当前位置：文档之家 › 单分子检测与荧光相关光谱

单分子检测与荧光相关光谱

  • 格式：ppt
  • 大小：2.25 MB
  • 文档页数：22

下载文档原格式

  / 22

合集下载

大连理工大学现代分析化学第十一章分子发光光谱

大连理工大学现代分析化学第十一章分子发光光谱

第一节
2. 荧光分析法的特点2.
第二节
（2）
（3
2.激发光谱与荧光2.
(3)激发光谱与发射光谱的关系(3)
3. 荧光的产生与分子结构的关系3.
(2) 化合物的结构与荧光(2)
4. 影响荧光强度的因素
第三节
荧光用的样品池须用低荧光的
形状
（3）
由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发光成直角。

3. 三维光谱技术3.
4.4.磷光检测技术磷光检测技术
第三节
2.2.定量依据与方法定量依据与方法
（2）定量方法
3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用
4. 磷光分析法的应用4.
第四节
2.化学发光反应类型2.
（2
化学发光的特点4.化学发光的特点4.。

第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy

第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的

荧光相关光谱在生物化学领域中的应用

荧光相关光谱在生物化学领域中的应用

荧光相关光谱在生物化学领域中的应用黄茹;周小明【摘要】荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)是一种通过监测荧光涨落从而获得单分子水平的分子扩散行为信息的技术.FCS高灵敏度的优点使得它已发展成为一种可以在活体外与活体内检测分子浓度、扩散系数、结合和解离常数等参数的有力工具.荧光互相关光谱(fluorescence cross-correlation spectroscopy,FCCS)是FCS技术的进一步发展,其大大扩展了FCS技术的应用范围.本文介绍了FCS及其衍生技术的原理及其在生物化学领域的应用.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2013(022)004【总页数】5页(P289-293)【关键词】荧光相关光谱;分子诊断;生物化学【作者】黄茹;周小明【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q631荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy，FCS)的实质是监测带有荧光基团的物质在激光作用体积内的扩散情况。

FCS可以测定＜10-15 L微区内的荧光团由于布朗运动或化学反应而导致的荧光强度的涨落，其微小的观测体积使它成为一种非常重要的单分子监测技术，并且最大程度上降低了系统中非检测物质的荧光对目标物检测造成的影响。

FCS在20世纪70年代形成初步的概念［1］，经过在检测器、自相关电子元件和共聚焦显微镜等方面的一系列发展，到90年代已经发展成为一种被广泛应用的光谱技术［2，3］。

其中，激光共焦技术通过减少样品的照射体积来抑制散射光的影响，从而使FCS的检测达到了单分子水平。

Rigler等首先解决了FCS信噪比低的问题，使得单分子荧光检测成为了可能［4］。

分子荧光光谱法

分子荧光光谱法

即在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度
成正比，这是荧光法定量的基础。
2. 荧光量子产率Φ
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 激发态的分子数 吸收的光子数
产生荧光的必要条件是 分子必须具有能吸收激发光的结构通常是共轭双键结构； 必须具有一定程度的荧光效率，即荧光物质吸光后 子数与吸收的激发光的量子数的比值
第九章
分子荧光光谱法
Molecular fluorescence spectroscopy
9.1
9.1.1
荧光光谱法基本原理
分子的激发与失活
1. 分子的多重态 单重态 一个所有电子自旋都配对 的分子的电子状态。大多数有机 物分子的基态是单重态。当基态 一对电子中的一个被激发到较高 能级，其自旋方向不会立刻改变， 分子仍处于单重态。
9.2
9.2.1
荧光分析仪器和荧光法的应用
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分 析，也可用于测绘激发光谱和荧
光光谱。第一单色器选择激发光
波长（＞250nm的紫外光），故 称为激发单色器。第二单色器
（荧光单色器）与激发光入射方
向垂直，并选择荧光波长，可提 高方法的选择性和准确度。
量子产率（Ф）。
F = K′（I0—I） 根据朗伯-比尔定律，lg I 0 =εbc I
则 I I0 e
2.303bc
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
F K I 0 (1 e 2.303bc )
假设εbc＜0.05
F = K’I02.303 εbc 当I0一定时 F = K· C (K =K’I02.303 εb)
三重态 有两个电子的自旋不配对 而平行的状态。激发三重态能量 较激发单重态低。

分子荧光光谱法

分子荧光光谱法

F = k (I0 - I)=KC
返回
28
Instrumentation
Perkin- -Elmer 204
特殊点：有两个单色器，光 29 源与检测器通常成直角。
23
A.
Light Sources
1. Xenon arc lamps
They give broad continuum spectra in UV/Vis region (200 -1000 nm, λmax at ~ 500 nm) Very high radiation power
Natural Fluorescence
Green fluorescent protein (GFP)
From jellyfish（水母）
Widely applied in molecular biology (2009 Nobel Prize)
Red fluorescent protein (DsRed)
originally isolated from the Indo Pacific sea anemone(海葵) relative Discosoma species h
5
4
分子荧光和磷光光谱分析法
产生机理
1、荧光\磷光的产生
激发后分子的多重性可能改变( S/T两态). 单重态: 所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机
物分子的基态是单重态。当处于基态的一对电子中的一个
被激发到较高能级，其自旋方向没有改变，分子仍处于单 重态。 三重态: 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态 6 能量较激发单重态低。
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，要以辐射或
无辐射跃迁的方式回到基态。

单分子荧光检测的原理、方法及应用

单分子荧光检测的原理、方法及应用

0 前言
随着生命科学的迅速发展，人们对生命现象 的研究已深入到单细胞、单分子层次，许多传统的 分析方法与手段面临极大的挑战。单分子检测是 近十年来迅速发展起来的一种超灵敏的检测技 术，为分析化学工作者打开了一扇新的大门。现 在，人们不仅可以在溶液中对单个分子进行检测 和成像，而且可以通过对单分子的光谱性质进行 测量，从而对化学反应的途径进行实时监测，特别 是能对生物大分子进行探测并提供分子结构与功 能之间的信息。单分子检测有电化学法与光学 法，本文仅就单分子荧光检测的原理、方法及应用 作一简单阐述。
分子荧光检测的原理、方法及其在生命科学中的应用。
关键词：单分子检测；荧光；评述
中图分类号：06 - 1
文献标识码：A
Fluorescence Detection of Single Molecule and Its Applications
WANG Yi-iin
（ COiiege Of Chemistry and Chemicai Engineering，Guangxi University，Guangxi Nanning 530004 PRC）
从单分子水平上研究蛋白质与核酸的相互作 用可为人类基因组的研究提供许多新机会。实时 观察单个酶分子在 DNA 上的结合和运动可揭示 许多新问题，如 DNA 结合蛋白在许多非特异性结 合位点中如何找到特异性位点的，RNA 聚合酶在 转录时是如何运动的。单分子检测技术已用于直 接观察基因表达过程［24］。研究表明，荧光标记的 RNA 聚合酶分子沿 DNA 链作直线滑行，为滑动 是寻找启动子的机制提供了直接证据。研究表 明，在转录过程中 RNA 聚合酶分子沿 DNA 链移
图 1 分子能级图
2 方法
单分子荧光检测的技术关键在于确保被照射 的体积中只有一个分子与激光发生作用以及消除 杂质荧光的背景干扰。采用高效滤光片，利用共 焦、近场和消失波激发，可达此目的。根据所用仪 器及对样品激发方式的不同，单分子荧光检测大 体可分为以下 4 种。 2. 1 近场扫描光学显微镜

单分子检测与荧光相关光谱..

单分子检测与荧光相关光谱..
，可以反映局部微观环境的信息。可以得到在特殊时刻，特定分子 的特殊位置和行为。
采用单分子效应可能观察到未知领域的新效应。如单分子体系的波
动行为或不确定行为。
分子发光分析
概述 2.单分子荧光的产生原理：
荧光的产生原理可以用右图来描 述： S0 、 S1 、 S2 分别表示分子 基态、第一和第二激发单重态。 T1 为激发三重态，分子吸收光 子后，被激发到 S1 、 S2 较高的 能级之后，迅速弛豫到 S1 的最 低震动能级，然后发射一个荧光 光子，同时使分子回到 S0 的较 高激发态，并弛豫迅速到 S0 的 最低震动能级。分子便处于新一 轮的激发和发射循环。 分子发光分析
相对于单个罗丹明6G分子的水 的拉曼散射强度
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系统 23.2.1全内反射（TIR）
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系统
23.2.2共聚焦光学检测系统
通过物镜照明的方法叫落射照明；
滤光镜
激发光 发射光
检测器
入射光能激发照射锥里面所有的荧
光团； 发射光通过物镜被回收，称为荧光
溶剂杂质荧光产生的背景干扰；
分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的探测体积无关,而背景正比于探测体积，采用pL(皮升) 、或fL（飞升）级探测体积；
结合光谱滤波和时间分辨等技术。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
罗丹明6G是单分子检测常用的 一种荧光染料，右图显示了罗丹 明6G的发射光谱和溶剂乙二醇 的拉曼光谱图。
在，使样品不直接成像。一个时 间点之观察一个点。
单分子荧光蛋白共焦荧光图像
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.1用于单分子检测的检测器

7.荧光相关谱(FCS)

7.荧光相关谱(FCS)

12
荧光相关谱技术是怎样实现的
把激光光束会聚到样品上，激发特定区域的荧光，由探测器 监测荧光强度变化(荧光分子或粒子的扩散或化学反应，使得激 发区域内粒子在其平衡浓度的波动，造成荧光强度的波动),进行 荧光自身相关运算，获取粒子的某些信息，如溶液的浓度、粒子 扩散系数等。
⎯⎯ The Key Laboratory of Biomedical Photonics of Ministry of Education, China ⎯⎯ 2005/12/28
⎯⎯ The Key Laboratory of Biomedical Photonics of Ministry of Education, China ⎯⎯ 2005/12/28 7
1996 The ConfoCor from Carl Zeiss is the first automated fluorescence correlation spectrometer 1997 The confocal laser scanning microscope LSM 510 developed by Carl Zeiss is a very compact and user-friendly system. 1999 Carl Zeiss sets the standard for fully automated dual channel cross correlation spectrometry: ConfoCor2 2000 With the combination of the ConfoCor 2 with the LSM 510 to form the :ConfoCor2/ LSM 510 combi the age of biophysics dawns in cell biology. An ingenious technique is made available to a wide variety of users.

分子荧光光谱法 ppt课件

分子荧光光谱法 ppt课件
分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!

ppt课件
26
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
40
2.激发光谱与发射光谱的关系
（1）镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
41
ppt课件
42
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
ppt课件
24
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与

分子荧光光谱法

分子荧光光谱法

仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析；
分子荧光光谱法
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可 变波长三种；
同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。
合适的可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似，发射光谱严重重叠，但 <15nm的同步光谱只显示酪氨酸 特征光谱； >60nm时，只显示色 氨酸的特征光谱，实现分别测定。
分子荧光光谱法
3.内滤光作用和自吸现象 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收
光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
分子荧光光谱法
4、溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
分子荧光光谱法
四、仪器结构流程
（ 多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 ‘2的荧光； 10-
7～10 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波
长长； ‘2 > 2 > 1 ；
分子荧光光谱法
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
分子荧光光谱法
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱

分子荧光光谱法

分子荧光光谱法

em
吸收峰 荧光峰

从图中看出
磷光峰


2. 荧光光谱法
一、荧光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁 产生荧光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基 态 在光致激发和去激发光的过程中，分子中 的价电子（ 、n电子）处于不同的自旋状 态，通常用电子自旋状态的多重性来描述

1. 电子自旋状态的多重性
OH N
M OH N
（四）取代基的类型
——取代基对荧光物质的荧光特征和 强度也有很大影响。分成三类： （1）增强荧光的取代基 —— 有 -OH、

OR、 -NH2、-NHR、-NR2等给电子基团 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与 苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电子， 扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强 度增强
- SO3H等
三、环境对荧光的影响
1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出 不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移， 荧光强度增大 2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而 非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光 物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强 度减弱。

荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 止照射，荧光马上熄灭

无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧>激

VR
S2 IC S1 VR ISC
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃

分子荧光光谱法(原理和方法)

分子荧光光谱法(原理和方法)

1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态

kf
k f ki kec kic
ห้องสมุดไป่ตู้
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程 （系间窜越、外转换、内转换）
的速率常数减小的因素都可使荧光增强。
根据朗伯-比尔定律
Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
则F=ΦI0（1-10-εbc)=φI0(1-e-2.303εbc) 又因
e-2.303εbc=1-2.303 εbc-(-2.303 εbc)2/2!-(-2.303 εbc)3/3!
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
Molecular fluorescence spectroscopy
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．

分子荧光光谱法

分子荧光光谱法

5. 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫——内转换 内转换——振动驰豫到达单重激发态的 内转换 振动驰豫到达单重激发态的 最低振动能级时，单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子） 最低振动能级时，单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态 的不同振动能级， 荧光发射” 的不同振动能级，此过程称为 “荧光发射”。 6. 磷光发射：三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不 磷光发射：三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子） 同振动能级， 磷光发射” 同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。
三、激发光谱与荧光光谱
1、激发光谱 将激发荧光的光源用单色器分光， 将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光 波长，固定荧光发射波长， 波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质 溶液发射的荧光强度( ，以激发光的波长为横座标， 溶液发射的荧光强度 F)，以激发光的波长为横座标， 光谱图， 荧光强度为纵座标作F—l光谱图，便可得到荧光物质的 激发光谱。 激发光谱。
由于三重态寿命较长， 由于三重态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率 也高，失去激发能的可能性大， 也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观 察到溶液中的磷光现象。因此， 察到溶液中的磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其 它去活化才能观察到某些分子的磷光。 它去活化才能观察到某些分子的磷光。 处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态， 处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪 种途径的速度快，哪种途径就优先发生。 种途径的速度快，哪种途径就优先发生。 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快， 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快， 则荧光发生几率高，强度大。 则荧光发生几率高，强度大。 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢， 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢， 则荧光很弱或不发生。 则荧光很弱或不发生。

单分子对荧光共振能量转移(spFRET)

单分子对荧光共振能量转移(spFRET)

单分子对荧光共振能量转移（spFRET）生物物理学系 郑晓惠 学号 10281034 一 引言 光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。

在 单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS） 探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的 综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个 整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效 应掩盖了许多特殊的信息。

而单分子探测可对体 系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程 的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。

2002 年美国第 46 届生物物理年会表明单分子仍是 生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。

主 要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子 荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分 子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行 单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子 轨迹追踪等[1]。

由此可见，单分子荧光技术具有重 要的地位。

标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特 性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、 反应动力学、构象动力学、分子运动自由度 (molecular freedom of motion)及在化学和静电环境 下活性改变的信息。

近年，在动态结构生物学研 究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构 象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光 偏 振 的 各 向 异 性 （ single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的 构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动 (rotational motions)。

另一个是单分子对荧光共振能 量转移(single pair fluorescence resonance energy transfer, spFRET)，在单分子水平测量一个分子内 或两个不同分子间的距离变化和相互作用。

第十一章 分子荧光与分子磷光光谱法

第十一章 分子荧光与分子磷光光谱法
17
若用数学式来表达这些关系，得到 = kf /（kf+ki） 式中kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率 常数的总和。 凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光。 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下 接近1，说明ki很小，可以忽略不计。一般来说，kf主要取决于化 学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。 磷光的量子产率与此类似。
14
荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
15
由基态最低振动能层跃迁到 第一电子激发态各个振动能 层的吸收过程中，振动能层越高，两个能层之间的能量 差越大，即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越 短。反之，由 第一电子激发态的最低振动能层降落到基 态各个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层越高， 两个能层之间的能量差越小，荧光峰的波长越长。 另外，也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸 收在大约10-15的短时间内发生，原子核没有发生明显的 位移，即电子与核之间的位移没有发生变化。假如在吸 收过程中，基态的零振动能层与激发态的第二振动能层 之间的跃迁几率最大，那么，在荧光发射过程中，其相 反跃迁的几率也应该最大。也就是说，吸收和发射的能 量都最大。
11
如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同 的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷 光光谱曲线。 在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无 辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长 波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也 相对较弱。
12
荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由 于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此， 在激发和发射之间产生了能量损失。 （2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子 激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛 豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射 光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发， 电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能 层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。

分子发光光谱

分子发光光谱

2013-10-13
分子的活化与去活化
振动弛豫
S2
内转移 荧光
反系间 窜跃
系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型 共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec ２. 无辐射跃迁的类型
T1
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
紫 外 可 见 共 振 荧 光 S0 光 谱
2013-10-13
★荧光激发光谱的形状与发射波长无关 • 由于在稀溶液中，荧光发射的效率(称为 量子产率)与激发光的波长无关，因此用 不同发射波长绘制激发光谱时，激发光 谱的形状不变，只是发射强度不同而已
2013-10-13
★荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似，荧 光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 • 物质的分子只有对光有吸收，才会被激发，所 以，从理论上说，某化合物的荧光激发光谱的 形状，应与它的吸收光谱的形状完全相同 • 由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些 影响，使得绝大多数情况下，“表观”激发光 谱与吸收光谱两者的形状有所差别 • 如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光 谱相比较，便会发现两者之间存在着“镜像对 称”关系
2013-10-13
• 另一方面，吸收时由基态的最低振动能级跃迁 到第一电子激发态的各振动能级，振动能级越 高，所吸收的能量越大，即吸收峰的波长越短 相反 • 荧光发射是由第一电子激发单重态的最低振动 能级跃迁回基态的各振动能级，振动能级越大， 所释放的能量越小，即发射的荧光峰波长越长
2013-10-13
• 处于激发态的分子是很不稳定的，它可能通过 辐射跃迁和非辐射跃迁的形式去活化(去激发) 释放出多余的能量而返回基态 • 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的 发射 • 无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量， 包括振动弛豫、内(部)转移、系间跨(窜)越及 外(部)转移等过程

评述与进展荧光相关光谱及其在单分子检测中的应用进展

评述与进展荧光相关光谱及其在单分子检测中的应用进展

评述与进展荧光相关光谱及其在单分子检测中的应用进展张普敦　任吉存3(上海交通大学化学化工学院,环境科学与工程学院,上海200240)摘　要　单分子检测在生命科学、化学、物理学等领域具有重要的意义。

荧光相关光谱是单分子检测的新技术,在生命科学领域有巨大的应用潜力。

综述了荧光相关光谱单分子检测的原理、实验技术以及在生物分子相互作用、活细胞、核酸、疾病诊断、高通量筛选以及与毛细管电泳联用等领域的研究,并展望了其发展前景。

关键词　单分子检测,荧光相关光谱,评述　2004202212收稿;2004208231接受本文系国家自然科学基金(No .20271033,20335020),上海市自然科学基金(No .02Z A14057),中国博士后科学基金(No .200303264)资助项目1　引 言生命科学的发展对分析检测技术的灵敏度要求越来越高,人们希望在单分子水平上了解物质之间的相互作用以及生命的过程。

激光诱导荧光(L I F )是目前最灵敏的检测方法,可用于单分子的研究。

影响激光诱导荧光检测灵敏度的主要因素来自瑞利和拉曼散射。

荧光相关光谱(FCS )利用激光共焦技术减少样品照射体积,抑制散射光影响从而实现单分子检测的新方法。

该方法是通过测定溶液中微区内(通常<10-15L )发光粒子由于布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落现象(荧光强度的明暗变化),并对荧光强度随时间变化函数作分析,从而获得粒子的浓度、化学动力学参数等相关信息。

虽然荧光相关光谱概念在上世纪70年代提出[1～3],但直到90年代随着计算机技术、激光共焦技术以及光学检测技术的发展才使其得到实质性进展,实现了单分子检测。

荧光相关光谱单分子检测技术在生物学和化学领域有广泛的用途。

除了进行扩散常数、化学动力学参数等研究外,FCS 技术现已应用于生物分子相互作用研究、活细胞分析、核酸分析、肿瘤早期诊断以及高通量药物筛选等。

本文对近年来荧光相关光谱单分子检测技术的研究进展,特别是在生命科学领域的研究进展进行评述并展望了其发展前景。

分子荧光光谱分析

分子荧光光谱分析
不能使用含有重原子的溶剂
第11页，此课件共22页哦
溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长 红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电 离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。
第12页，此课件共22页哦
3）pH值的影响
荧光物质的电离与非电离形式的Φf有差别，带有酸性
或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH关； 4）溶解氧的影响
一、分子退激发的过程
激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占优势。
1、振动驰豫
1）分子吸收光子后，可能被激（非辐射跃迁）到达同一激发态的最
低振动能级
需时间10-13—10-11sec，效率较高
2、荧光发射
第5页，此课件共22页哦
分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到基 态——荧光发射。
检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的测定方法结合起来, 可用于测定复杂的混合物
第20页，此课件共22页哦
第21页，此课件共22页哦
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
2002222//33/1/1
第22页，此课件共22页哦
溶解氧的存在使Φf下降
第13页，此课件共22页哦
第二节 荧光分光光度计
一、基本构造
1、光源
强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。
2、单色器
两个，互成直角
3、样品池
四通杯
4、检测器
光电倍增管
第14页，此课件共22页哦
二、仪器光路
光源
激发单色器
第15页，此课件共22页哦
样品池
荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这种现象 叫作红移或斯托克斯位移。
3、内部转换 1）分子内过程，热退激 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸收λ1、
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

概述
根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间,可算出单 个分子发射的最大光子数为105~106。目前光学检测 系统收集、检测光子的效率约为1%或0.5%~5%,故单 个分子仍可被检测到数千光子信号。 检出限约为10-13mol/L
分子发光分析
概述
3.两个基本要求：
在被照射的体积中只有一个分 子与光子发生相互作用，可以 通过调整体系的浓度或密度来
单分子酶催化反 23.6.2单分子ATP酶活性研究
肌球蛋白的S1亚基通过白蛋白-生物素卵蛋白涂层结合到玻璃表面，在S1片段 上有一个ATP酶活性，能切割Cy3标记 的ATP。蛋白质也有Cy3标记，使得单 一酶分子位于滑道上，ATP酶标签定位 后，绑定在S1片段上的Cy3被光漂白， 以消除其散射光的影响。当Cy3-ATP / ADP酶固定化之后，会发生荧光强度的
在高光照条件下检测室会发生荧 光闪烁现象，这种单一荧光团的闪烁 可以简单的光物理模型进行解释，荧 光团闪烁的主要来源是系统的交叉三 重态。 如果背景信号来自自发荧光，那 么入射强度的增强不会引起信噪比的 增加。 在开始时，随着如射强度的增加 ，光子计数率呈直线增加，并很快达 到最大值。
四甲基罗丹明标记的脂质分子的光子计数率
F.分子信 标 F.分子马 达
荧光单分子检测的应用领域
分子发光分析
分子发光分析
荧光偏振
单分子荧光分子具有唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩，分 子只吸收偏正方向与其偶极矩方向一致的光子。因此在偏振
激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向
，可以确定单个荧光分子的空间取向。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
影响分子检测能力的因素： 由于样品中杂质产生的背景干扰；
分子发光分析
23.6单分子荧光检测的生化应用
23.6.1单分子酶动力学
用荧光标记的酶分子或底物反应，
在反应过程中会发生酶的构型变化，使 绿色荧光的量子产率增加，引起绿色荧
底物分子
酶分子
光强度的增加；通过检测反应过程中荧
光强度的变化，对酶促反应进行实时监 测，从而获得与酶促反应有关的丰富的
动力学数据。
瞬时增加。
分子发光分析
23.7单分子荧光检测的其他应用
由于单分子检测具有快速、选择性强、纳米级分辨率、检测限 低、可进行实时监测等特点而在生物化学、医学、生命科学物理等 领域得到了广泛的应用。
A. 单分子 荧光寿命估算 H.单分子 传感器 G.偶极辐 射成像 B. 单分子 取向成像
C. 单分子 取向和旋 转运动 D.单分子 共振能量转移 E.时间分辨 单分子研究
单分子荧光检测与荧光相关光谱
分子发光分析
主要内容：
单分子荧 光检测
荧光相关光 谱在单分子 检测中的应 用
荧光相关 光谱
分子发光分析
概述 概 念：
单分子荧光检测是检测灵敏度达到分子水平的一
系列高灵敏检测技术的总称。已经达到了分子检测灵敏
度的极限。它能对单个分子进行检测和成像，而且可以 通过对单分子的光谱性质进行测量，从而对化学反应的 途径进行实时监测，能对生物大分子进行探测并提供分 子结构与功能之间的信息。其检测的空间尺度能达到纳
，可以反映局部微观环境的信息。可以得到在特殊时刻，特定分子 的特殊位置和行为。
采用单分子效应可能观察到未知领域的新效应。如单分子体系的波
动行为或不确定行为。
分子发光分析
概述 2.单分子荧光的产生原理：
荧光的产生原理可以用右图来描 述： S0 、 S1 、 S2 分别表示分子 基态、第一和第二激发单重态。 T1 为激发三重态，分子吸收光 子后，被激发到 S1 、 S2 较高的 能级之后，迅速弛豫到 S1 的最 低震动能级，然后发射一个荧光 光子，同时使分子回到 S0 的较 高激发态，并弛豫迅速到 S0 的 最低震动能级。分子便处于新一 轮的激发和发射循环。 分子发光分析
滤光器 电感耦合摄像机 更直接 棱镜 物镜 更方便
常用的宽视场检测方法。两种方
法都是基于倒置显微镜。 使用第一种方法是要使入射光瞄
准物镜的焦点。
绿色荧光蛋白图像
分子发光分析
23.3SMD光学装置
另一种限制检测体积的方法是共
焦光学和逐点检测，其所用的是 一种光子探测器（SPAD），其原
光纤
理如右图所示。单点检测器的存
米数量级。
分子发光分析
概述 1.单分子检测的理论意义:
通常对大量分子集合体的观察测量只能反映分子的平均效应，这种
平均效应掩盖了许多特殊的信息；而这些特殊的信息在研究具有非
均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构式显得尤为重要。 体系中各个分子的变化过程与时间密切相关，单分子检测可以对体
系中的单个分子进行研究；单分子的特征对局部场的存在非常敏感
相对于单个罗丹明6G分子的水 的拉曼散射强度
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系 统 23.2.1全内反射（TIR）
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系 统
23.2.2共聚焦光学检测系统
通过物镜照明的方法叫落射照明；
滤光镜
激发光 发射光
检测器
入射光能激发照射锥里面所有的荧
光团； 发射光通过物镜被回收，称为荧光
和梳状陷波滤波器。
全息陷波滤波器吸收光谱图
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.2SMD滤波器
在532nm的激发光下，选用不同的滤光 器检测尼罗红得到的光谱图。陷波滤波 器、长波通滤波器、双色向滤波器。
通过特定的发射滤波器是尼罗红 的荧光强度明显减弱。
分子发光分析
23.5单分子光物理性质的研究
在，使样品不直接成像。一个时 间点之观察一个点。
单分子荧光蛋白共焦荧光图像
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.1用于单分子检测的检测 器
SPAD（光子探测器）——单分子单点测量优选检测器，有以下优点： SPAD连同单光子计数电子设备，只需一个5伏的电源即可工作； 量子效率更高，能达到60%~90%； 背景计数率低，能见效背景干扰； CCD（电感耦合检测器）——用于单分子成像 由一个像素阵列构成，每个像素点都是一个独立的检测器；
实现。
单分子的新号要大于背景的干 扰信号，要减少拉曼散射、瑞 利散射及其它杂质荧光造成的 干扰。缩小探测体积能有效减
少背景干扰。
分子发光分析
概述 4.单分子荧光的特征：
量子跳跃
发射－暗态交替的量子跳跃过程是单分子荧光的典型特征，
取决于单分子的周围环境和猝灭途径，是实验中单分子荧光 光谱和荧光强度涨落现象的原因。
溶剂杂质荧光产生的背景干扰；
分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的光子数不同；
提高分子检测能力的方法：
单分子信号与探测体积无关,而背景正比于探测体积，采用pL(皮升) 、或fL（飞升）级探测体积；
结合光谱滤波和时间分辨等技术。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
罗丹明6G是单分子检测常用的 一种荧光染料，右图显示了罗丹 明6G的发射光谱和溶剂乙二醇 的拉曼光谱图。
CCD不是光子计数探测器，而是一种集成探测器，每个像素点的信号
正比于入射光子的数量； 像素点的噪音不会随时间二增加，且有较高的量子效率。
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.2SMD滤波器
在单分子检测中，除去激发波长处的 散射光的影响是非常必要的。根据原
理的的不同可以分为全息陷波滤波器
配置；
散射光被双色向滤光镜分离出来； 双色向滤光镜是一种能透过一些波
长的光，二反射其他波长的光的装
置。
共聚焦光学检测原理
分子发光分析
23.3SMD光学装置
几乎所有的单分子荧光检测器都 使用光学装置限制观察体积。在 宽视场检测和逐点检测中用到了 不同的方法。在宽视场检测中最 常用的是全内反射，右图是两种