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组织制片技术原理与流程及切片机的使用组织制片的特点组织制片是组织学、胚胎学、病理学、生物学等学科观察和研究组织、细胞的正常形态和病理变化的常用方法。
其基本原理是用固定剂固定组织、细胞以及各种亚细胞器，保持组织的微细结构，制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差，在显微镜下观察组织、细胞的形态结构，或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分，并可进行形态和化学成分的定量分析。
随着细胞和分子生物学技术的发展，组织制片也为原位显示细胞内基因表达提供了基础。
一石蜡包埋切片制作石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂，故固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织中的水，后用二甲苯等透明剂置换出乙醇，此过程即脱水、透明。
再用石蜡渗入组织块，冷凝后变硬，即浸蜡、包埋，就可在切片机上切片了。
1.固定细胞、组织离体后要迅速用相应的固定剂固定，使蛋白质沉淀、变性、凝固，保持组织原有的形态结构和抗原性。
一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或Carnoy于4℃并向固定过夜。
2.脱水与透明固定后的组织须由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，一般为50%、70%、85%、95%、和100%（3次）3.渗蜡与包埋渗蜡是石蜡置换组织块中透明剂的过程，一般用熔点为52-60℃的石蜡。
透明后的组织块先于1/1体积的二甲苯与石蜡中37℃渗透过夜，后温度调至58℃换入纯石蜡继续渗透，一般每间隔3h换一次纯石蜡，直到无二甲苯气味即可进行包埋。
4.切片与展片先用刀片修去组织块周围多余的石蜡，一般保留2mm左右的石蜡，修整成梯形的组织块，以便于展片时蜡带的分离。
先加热刀片，后把修好的组织块快速粘到方形的小木块上，冷凝后即可进行切片。
一般组织切片的厚度为6-12um，切片速度以40-50次/min为宜，用毛笔托起蜡带，分割后依次放到洁净的载玻片上，蜡带的光滑面朝下放，后滴上适量的蒸馏水放至展片台上于37-40℃烤片过夜。
5. 染色、脱水、透明与封片染色一般是双重染色或单染，番红与固绿是常用双重染色法，而苏木精是最优良的核染色剂。
⽯蜡切⽚步骤⽯蜡切⽚基本步骤（⼀）取材和固定根据实验⽬的选择材料。
将整个⾍体或⾍体的内部器官（如肠道、马⽒管、唾液腺等）取出后，⽴即投⼊固定液。
取材⼤⼩：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。
固定液：2.5%的戊⼆醛固定液，Bouin⽒液，10%甲醛等。
固定时间：4oC固定24⼩时。
注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所⽤⼑、剪要锋利，切割时不可来回切割。
夹取组织时，镊⼦要轻，切勿挤压，以免损伤组织。
取材时，组织块可稍⼤⼀点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。
2.选好组织块的切⾯应熟悉器官组织的组成，并根据观察⽬的来确定纵切或横切。
3．保持材料的清洁组织块上如有⾎液、污物、粘液、⾷物等，先⽤⽣理盐⽔冲洗⼲净，再⼊固定液。
4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。
固定：1．材料新鲜取出组织后须⽴即固定。
否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发⽣⾃溶现象。
2．抽⽓⽣物组织常有⽓体的存在，使材料不能沉⼊固定液中，抽⽓使得固定液有效渗⼊。
真空泵抽⽓或者⽤空针管抽⽓。
昆⾍整体固定，固定前⽤解剖针刺数个⼩孔，以利⽤固定液渗透。
3．固定剂⽤量⼀般为组织体积的10~20倍。
勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗⼊。
4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作⽤。
5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗⼊，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（⼆）洗涤2.5%戊⼆醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10minBouin⽒固定液固定的组织：直接⼊70%酒精更换数次即可脱⽔，注意苦味酸。
甲醛固定的组织：直接投⼊50%或70%酒精脱⽔，不经⽔洗。
但如果在甲醛中时间过长，则仍应当⽤流⽔冲洗。
陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱⽔、切⽚和染⾊。
自己设计实验材料的石蜡制片和显微测量与分析方法一．石蜡制片的操作流程1 取材选取经过自己设计实验的对照和处理的材料的根、茎、叶的相同部位。
2 固定和抽气在测定生理指标的同时，进行固定，固定液为FAA（75℅酒精90ml+冰醋酸5ml+甲醛5ml）。
，重复3次，材料的长和宽最大不超过1cm。
固定液为材料的20倍左右。
将选取的材料分装两试管，加入固定液。
固定时间24小时，其间要放入抽真空机中抽气15-30分钟至材料完全沉浸在固定液下面。
并用铅笔写好标签。
3 脱水、透明及渗蜡将材料从固定液中取出后，其具体流程如下：A：酒精X：二甲苯75%A（2h）→85%A（2h）→95%A（2h）→100%A（2h）→100%A（2h）→3/4A+1/4X（2h）→1/2A+1/2X（2-3h、过夜）→1/4A+3/4X（2h）→X（2h）→1/2X+1/2蜡（过夜）→渗蜡1（2h）→渗蜡2（2h）→渗蜡3（2h）设置浓度梯度是为了防止材料皱缩，但具体浓度梯度和浸泡时间要视材料情况而定，对于幼嫩的材料，梯度要大些，各步浸泡时间可短些，老的硬的梯度则要小些，各步浸泡时间则相应要长些。
第二次100％A脱水很关键，一定要确保水脱尽。
4 包埋将渗蜡后的材料和石蜡一起倒入小纸盒，用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直，倒入纯蜡进行包埋。
稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固。
5 修块将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料，并修成梯形，切面在梯形的上部。
注意上部矩形对边平行，梯形底部用烧热的蜡将其固定在木块上。
6 切片将粘有蜡块的小木块至于切片机上，调整切距到适当大小，转动调节器条切片厚度12µm 进行切片。
注意切片时要一手转动切片机，另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形成一长条蜡带。
切片过程中，如果蜡带偏向一边，也要及时修正。
7 烫片滴一滴蛋白胶于干净载玻片中央，用干净的手指涂抹均匀后，滴上清水，将取下的蜡带切成小段置于载玻片上（放上两至三段），然后将载玻片放到展片台上(保持40℃)烫片。
石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml）1000200100重铬酸钾（mg）63120100蒸馏水（ml）2002001000重铬酸钾1200g蒸馏水2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1.将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2.流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3.95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、准备工作（二）常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。
石蜡制片法（用于免疫组织化学，HE染色）发布日期:2008-10-27 热门指数:6172 收藏石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。
此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。
该法多采用旋转式切片机进行切片。
石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。
采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。
为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。
分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。
分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。
常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。
将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。
用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。
F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。
卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。
因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。
（三）脱水脱水的目的是除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进行，因为这些程序中所用的药品都不能与水混合，所以必须脱水。
常用的脱水剂为酒精。
脱水过程应缓慢进行，不能操之过急或时间过长，以免组织变硬变脆或发生收缩现象。
石蜡制片技术［自己整理］石蜡制片又叫永久制片，是观察植物组织构造常用的制片方法之一。
其优点主要是适合各种植物组织的制片，切片的厚薄易于控制（最薄可达0.5微米），清晰度很好，亦适合作细胞学研究，并能够制成连续切片，制片易于长久保存，易于交流等。
但制片周期较长，易受条件限制，制片中使用化学试剂较多，对人有一定毒害，易使材料变脆、变硬或变形，某些内含物易于消失，常使组织变小，甚至使组织扭转变形，细胞所含物质缩小而折光性增强，影响观察正确性，且制片成本较高等。
虽然这样，但是石蜡制片仍不失为一种很好的制片方法，被人们常采用。
现将主要的基础理论和技术方法介绍如下：首先要明确,在这种条件下,植物的组织或部位不能直接用来切片,首先要按照该方法的要求,将材料进行程序化处理,终究要让所起填充作用的石蜡进入到材料的细胞中,然后带石蜡在切片机上进行切片,再染色、封藏。
这样的程序中，中间过程是十分复杂的，往往随材料的不同，而方法有所不同，在实际工作中要不断地摸索,不断地总结,只有这样,才有可能做出好的片子。
选择切片材料是全部切片工作的第一步，如果选择的材料不适当或有错误，以后的工作将是没有意义的。
选择材料时要注意具有代表性,植物的器官或器官的某一部位,其组织构造往往能够代表整个器官的基本情况,但不同部位,即便是同一器官,其组织构造,亦有一定的过渡差异,通常在选择材料时,要注意选择器官靠中间的部位作为试验材料,当然如果是作生长发育观察,则另当别论。
因此选好试验材料，对于整个实验至关重要。
当选择好材料后，实验的主要过程有以下步骤：材料的固定或软化——冲洗——脱水——透明——浸蜡——包埋——切片——贴片——烘片——脱蜡——二重染色——封片⒉制片程序简介：1)材料的固定或软化：最好用新鲜的固定材料（新鲜材料要迅速杀死植物细胞，最大程度保持组织和细胞的自然状态，这就是所说的杀死和固定）。
干材料可先行软化（常用温水浸泡，勤换水，勿使材料腐烂）。
