21常规石蜡切片制片规范

组织切片制备的基本要求
(一)组织制片过程中，应确保切片号与蜡块号一致。

(二)制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含需要脱钙、脱脂等特殊处理的标本）。

(三)制片完成后，技术人员应检查制片质量，并加贴标有本病理科病理号的标签。

常规石蜡-HE染色片的优良率应≥95%，优秀率不<35％。

不合格切片应立即重做。

(四)制片过程发生意外情况时，有关技术人员和技术室负责人应及时向科主任报告，并积极设法予以补救。

(五)制片完成后，技术人员应将所制切片与其相应的活检记录单／取材工作单等进行认真核对，确认无误后，将切片连同相关的活检申请单／活检记录单／取材工作单等一并移交给病理医师。

双方经核对无误后，办理移交签字手续。

具体交接方法由各医院病理科自行制订。

动物病理组织学石蜡切片制作标准操作程序（SOP）一、\器材和试剂准备（一）载玻片和盖玻片的清洁1.载玻片和盖玻片清洗方法(1)锅内倒入适量清洗液（100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液）；(2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却;(3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）;(4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）;(5)将玻片放入 95%乙醇（分析纯）中浸泡；（6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用；注意：由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。

2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理（1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。

一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。

或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水，混匀，加10mL浓氨水。

（2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。

二、石蜡组织切片的制作（一）取材注意事项：1.材料质量：材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。

2.取材体积：组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳）3.取材力度：取材器具锋利。

勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。

夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。

取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。

4.固定形状：固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。

⽯蜡切⽚步骤⽯蜡切⽚基本步骤（⼀）取材和固定根据实验⽬的选择材料。

将整个⾍体或⾍体的内部器官（如肠道、马⽒管、唾液腺等）取出后，⽴即投⼊固定液。

取材⼤⼩：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。

固定液：2.5%的戊⼆醛固定液，Bouin⽒液，10%甲醛等。

固定时间：4oC固定24⼩时。

注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所⽤⼑、剪要锋利，切割时不可来回切割。

夹取组织时，镊⼦要轻，切勿挤压，以免损伤组织。

取材时，组织块可稍⼤⼀点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。

2.选好组织块的切⾯应熟悉器官组织的组成，并根据观察⽬的来确定纵切或横切。

3．保持材料的清洁组织块上如有⾎液、污物、粘液、⾷物等，先⽤⽣理盐⽔冲洗⼲净，再⼊固定液。

4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。

固定：1．材料新鲜取出组织后须⽴即固定。

否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发⽣⾃溶现象。

2．抽⽓⽣物组织常有⽓体的存在，使材料不能沉⼊固定液中，抽⽓使得固定液有效渗⼊。

真空泵抽⽓或者⽤空针管抽⽓。

昆⾍整体固定，固定前⽤解剖针刺数个⼩孔，以利⽤固定液渗透。

3．固定剂⽤量⼀般为组织体积的10~20倍。

勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗⼊。

4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作⽤。

5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗⼊，对长期固定的标本可经常更换固定液。

（⼆）洗涤2.5%戊⼆醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10minBouin⽒固定液固定的组织：直接⼊70%酒精更换数次即可脱⽔，注意苦味酸。

甲醛固定的组织：直接投⼊50%或70%酒精脱⽔，不经⽔洗。

但如果在甲醛中时间过长，则仍应当⽤流⽔冲洗。

陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱⽔、切⽚和染⾊。

病理切片、石蜡切片制作过程中注意事项病理切片是病理医生用来诊断患者疾病的主要手段之一。

病理切片制作过程复杂漫长，影响病理切片制作质量的因素众多，常见问题归纳如下：一、固定标本要充分及时：固定标本是制片的第一个环节；固定时间不合适或者固定不正确的组织，在染色时常会出现较浅的核质着色和轮廓不清，还会出现不同程度的片状发白区；固定液的浓度要适宜，固定标本的正确方法为：组织离体后快速放入适宜浓度的固定液中，固定液的量大约为标本体积的7倍左右，盛放标本的容器以不使标准变形为宜，大小适中。

二、规范对标本进行取材：取材的原则为：保持病变的特征和器官的完整性。

尽量修除无关组织，切面尽量做到平整，原则上小标本要全部制片，大标本宜在病变部位以及病变部位与正常组织交界处多处取材。

三、及时更换试剂：在整个切片过程中，试剂的使用比较频繁，试剂的浓度改变，会影响到组织的脱水、透明、浸蜡效果，有些试剂因为挥发到别的试剂中，甚至会导致对病理组织的污染，从而产生误诊。

因此，制片过程应注意观察试剂情况，根据标本量的大小及时更换试剂，确保组织处理达到要求。

四、组织包埋、切片：小块组织要采用线状包埋，大块组织要在包埋时整理平整，以防出现切片不完全或片内组织杂乱而造成诊断医师误诊[3]。

切片机应随时检查刀口是否钝化，随时保持刀口锋利以防出现切片断裂、破碎的情况。

切片力求完整，尽量将每块组织切到最大面，以防发生漏诊。

五、染色、封固要仔细，掌握好烤片条件：一般为60℃烤片0.5～1 h，过高温度和过长时间都会导致组织发黑，染色不清；脱蜡过程也相当重要，如果出现脱蜡不干净，那么就会出现切片不易着色和着色不匀的情况。

盐酸乙醇的分化是影响染色效果的关键环节。

分化不足和过度都会导致染色失败。

树胶的稠度也应适中，树胶过稀过多会发生溢胶，树胶过稠过少又会出现封片不全或空泡。

完成切片固封后，应及时贴好标签，防止出现混淆事故。

六、加强操作人员的工作责任心，减少因人为因素导致差错事故及坏片的发生。

病理科常规组织石蜡切片核对及制备的诊疗规范
一、组织制片过程中,应确保切片号与蜡块号始终保持一致。

二、制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含需要脱钙、脱脂等特殊处理的标本）。

三、制片完成后，技术人员应检查制片质量，并加贴标有本病理科病理号的标签。

常规石蜡包埋-HE染色片的优良率（甲、乙级切片所占的比例）≥90%，优级率（甲级切片所占的比例）≥35%。

不合格切片应立即重做。

切片质量的基本标准如下：
注：切片质量分级标准：①甲级片：≥90分（优）；②乙级片：75-89（良）；③丙级片：60-74分（基本合格）；④丁级片：≤59分（不合格）。

四、制片过程发生意外情况时，有关技术人员和技术室负责人应及时向病理科主任报告，并积极设法予以补救。

五、制片完成后，技术人员应将所制切片与其相应的活检申请单/活检记录单、取材工作单等进行认真核对，确认无误后，将切片连同相关的活检申请单/活检记录单、取材工作单等一并移交给病理医师。

双方经核对无误后，办理移交签字手续。

石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。

一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。

1.取材应根据要求选取材料来源及部位。

例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。

材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。

2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。

固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。

固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。

例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。

固定液可分为单一固定液及混合固定液。

前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker 氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。

因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。

10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。

固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。

3.洗涤与脱水固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。

石蜡切片的制作标准化操作流程1.取材固定1)取材必须新鲜，组织离体后迅速割取组织块，并随即投入固定剂福尔马林中。

切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。

2)固定完毕，用水冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。

2.脱水脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水，各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。

需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。

3.二甲苯透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。

透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。

将组织块先放入纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，。

透明时间一般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。

4.透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在60℃左右。

透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。

纯石蜡应处理2-3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15-30min。

透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。

包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。

具体做法是；先准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。

5.切片方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。

幼苗用去离子水冲淋干净后，选下胚轴中部切取5 mm长的小段，FAA(福尔马林、70％酒精、冰醋酸混合液)固定液中固定，4℃冰箱中保存备用。

常规石蜡制片，番红、固绿对染法：固定-脱水-透明-浸蜡-包埋-切片-粘片-脱蜡-复水-番红、固绿染色-封片切片厚度为10 μm，5％明胶粘片，阿拉伯树胶封片，Axiaskop 40型显微镜下观测并摄影。

1取材、固定：幼苗用去离子水冲淋干净后，选下胚轴中部切取5 mm长的小段，FAA(福尔马林、70％酒精、冰醋酸混合液)固定液中固定48h，4℃冰箱中保存备用。

2脱水：经30％、50％、70％、80％、90％、95％、纯酒精(两次)。

每级停留l h。

3透明：脱水后的材料在2／3纯酒精+l乃二甲苯、1／2纯酒精+l／2二甲苯、1／3纯酒精+2／3二甲苯、纯二甲苯(两次)中分别浸1 h。

4浸蜡、包埋：熔点(52 ℃)的石蜡切成蜡屑，将其每隔半小时加入浸有材料的二甲苯中(室温条件)，直至蜡屑不熔为止。

蜡碗加盖后置于37℃的恒温箱中过夜。

24h后，将恒温箱温度调至56℃，揭开盖，2 h后将浸材料的蜡倒掉，将化好的蜡(56-58℃)倒入，共换三次，每次0.5 h。

而后包埋。

5切片、粘片：切片厚度为10 μm，5％明胶粘片，45℃恒温展片。

6脱蜡、复水及染色：经纯二甲苯(两次)、1／2纯酒精+1／2二甲苯中各l h后、分别经纯酒精、95％、85％、70％各级酒精复水各5 min，番红染色12 h。

染色完毕移入脱水系，经70％、85％、95％各级酒精脱水各2分钟，0.1％的固绿中染色30 S，95％酒精、纯酒精(两次)、1／2纯酒精+1／2二甲苯、二甲苯(两次)各5 min.福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。

幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。

常规石蜡切片制片规范1．制片过程中的每一个环节，应确保切片号和蜡块号一致，自始至终不能将号码弄错，一旦发生应重新取材，以防事故发生。

2．制片完成后，应在HE切片上及时粘贴写好本病理科病理号的标签，并认真仔细地核对。

345．。

61．(1)(2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。

(3)勿挤压组织块:切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。

夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。

(4)规范取材部位:要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。

(5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。

纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。

(6)(7)2(1)。

(2)3．脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时，此过程可用脱水机自控完成。

丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。

因乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。

常用的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、水杨酸甲酯等。

4．浸蜡、包埋(1)使石蜡浸入组织中，取代组织中含有的透明剂。

(2)包埋：将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中，称蜡块，此过程称为包埋。

5．切片和贴片(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)～306称H.E染色法。

这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的切片均可使用。

苏木素是一种碱性染料,可使组织中的嗜碱性物质染成蓝色，如细胞核中的染色质等；伊红是一种酸性染料，可使组织中的嗜酸性物质染成红色，如多数细胞的胞质、核仁等在H.E染色的切片中均呈红色。

六、苏木精一伊红(I-IE)染色HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。

(一)染色程序1．石蜡切片HE染色(常规HE染色)(1)二甲苯工：5～10min。

(2)二甲苯Ⅱ：5～10min。

(3)无水乙醇工：1～3min。

(4)无水乙醇1I：1～3min。

(5)95 9／6乙醇工：1～3min。

(6)95％乙醇Ⅱ：1～3min。

(7)80％乙醇：lmin。

(8)蒸馏水：Imin。

(9)苏木精液染色：5～10min。

(10)流水洗去苏木精液：lmin。

(11)1％盐酸一乙醇：1～3s。

(12)稍水洗：1--~2s。

(13)返蓝(用温水或1％氨水等)：5～10s。

(14)流水冲洗：1~2min。

◇病理学分册(15)蒸馏水洗：1～2min。

(16)0．5％伊红液染色：1"---'3min。

(17)蒸馏水稍洗：1"-~2s。

(18)80％乙醇：l--~2s。

(19)95％乙醇工：2"~3min。

(20)95％乙醇II：2-~3min。

(21)无水乙醇工：3～5rain。

(22)无水乙醇Ⅱ：3～5rain。

(23)石炭酸一二甲苯：3～5min。

(24)二甲苯I：3-'--5min。

(25)二甲苯11：3---~5min。

(26)二甲苯Ⅲ：3~5min。

(27)中性树胶封固上述(12)和(13)项可省去，但(14)的冲水时间须延长至10～15min(细胞核显示更清晰)；②(23)项可用无水乙醇代替，北方地区可省略。

2．冷冻切片HE染色(1)冷冻切片固定：lO'~30s。

(2)稍水洗：1～2s。

(3)苏木精液染色(60℃)：30~60s。

(4)流水洗去苏木精液：5～lOs。

(5)l％盐酸一乙醇：1～3s。

(6)稍水洗：1～2rain。

(7)返蓝(用温水或1％氨水等)：5～lOs。

(8)流水冲洗：15-~30s。

(9)0．5％伊红液染色：1~'2min。

石蜡切片制片流程（番红固绿滴染）1.鲜样FAA（18：1：1）抽气固定24h以上。

2.易碎的材料可用甘油酒精软化剂（1：1）软化1周以上（乙二胺软化剂容易导致颜色变深）。

3.70%酒精浸泡1h。

4.80%酒精浸泡1h。

5.95%酒精浸泡1h。

6.吸水纸迅速吸干，100%酒精浸泡1h。

7.100%酒精浸泡1h。

8.含1/2酒精+二甲苯的溶液浸泡1h。

（若有浑浊，即脱水不完全，需要重新从95%酒精再脱水一次）。

9.纯二甲苯浸泡1h。

10.纯二甲苯浸泡1h。

11.加入约1/4二甲苯体积的碎蜡，放置约半小时，再加入1/4体积碎蜡（也可一步到位）。

12.视混合物熔点而定，40-50℃液体状态渗蜡1-2d。

13.视石蜡熔点而定，50-65℃（高于熔点3-5℃），含1/2二甲苯+石蜡的蜡锅浸蜡2h。

14.含1/3二甲苯+2/3石蜡的蜡锅浸蜡2h。

15.纯石蜡锅浸蜡2d以上。

16.包埋（若材料大、中间有空气可调高温度再抽气）（新蜡不易凝固，可在新蜡锅抽气再用老蜡包埋）。

17.空气中冷却（急剧冷却容易收缩不均而变形），削块成棱台形蜡块。

18.切片（8-20µm，若太薄易碎则调高厚度）。

19.40℃水中展片，用涂有粘片剂的载玻片捞片（展片时间不宜太短，易产生褶皱）（捞片的展片效果优于滴水展片，气泡少），40℃烘干。

20.40-50℃烤片2-3d（比石蜡熔点低5℃左右），让蜡带充分贴在玻片表面。

21.铅笔做好标记，二甲苯浸泡脱蜡20-30min。

22.二甲苯透明10-20min。

23.取出，滴加含1/2酒精+二甲苯的溶液，放置数秒，倾去。

（需要过渡酒精至与染色剂的酒精含量相同的浓度，染色）（以50%番红酒精溶液和95%固绿为例）。

24.滴加100%酒精，放置数秒，倾去。

25.滴加95%酒精，放置数秒，倾去。

26.滴加80%酒精，放置数秒，倾去。

27.滴加70%酒精，放置数秒，倾去。

28.滴加50%酒精，放置数秒，倾去。

石蜡切片的具体步骤与做法石蜡切片的具体步骤与做法？石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。

石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，因此用得最多，它有很多优点：比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片（4um以下），能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存。

缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好，容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。

制片时间太长。

石蜡切片的制作过程（一）材料与用具1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。

2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。

（二）实验内容与步骤1．取材及固定取动物体上的小块组织成为组织块。

组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。

切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。

组织块取下后，先用先用0.85％的生理盐水漂洗以戏曲血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。

由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。

如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。

材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。

不同的组织应选用适当的固定液。

固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。

不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。

2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。

组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。

AFA 固定液则不需要水洗。

3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。

石蜡切片制作流程表及相关注意事项一、取财1．样品要求：长宽1cm左右，厚度不超过5mm。

2．固定液：10％福尔马林固定液︰组织块=20︰1为宜。

3．固定时间：依大小而定，一般3-5h即可，如果24h或更长，应密封瓶口，封前换液。

4．修理组织块：将切面修平。

5．每个组织块都应编号，并做好记录。

6．用纱布包好组织块，并包上小纸条，注明编号、组织块数量等信息。

注：（1）对于肺部组织，在取材后必须用玻璃注射器抽掉肺泡腔中的气体，否则会影响脱水，透明和浸蜡等效果。

抽气具体方法：A．将组织块置入空玻璃注射器内，塞上推助器。

B．.向注射器内吸入约1/2的自来水，就会发现肺组织漂浮在水面。

C．排掉注射器内的空气。

D．将注射器倒置(头部向上)，用左手拇指赌上注射器头部,用右手用力拉推肋器。

E．反复C、D两步骤，直到肺组织沉到注射器底部即可。

（2）对于气管、支气管等含钙量较高的组织，必须有脱水前用5％和硝酸溶液软化，直到可用大头针扎透为止（一般需一天一夜）。

二、脱水过程1．水洗：将固定组织块放入广口瓶，瓶口用纱布包好，置流水下洗水，水洗时间依固定时间而定，一般12h以上，固定时间越长水洗时间越长。

2．脱水（1）75％2h（2）80％酒精1h（3）95％酒精Ⅰ 1 h（4）95％酒精Ⅱ 1 h（5）95％酒精Ⅲ过一夜（6）100％酒精Ⅰ 1 h（7）100％酒精Ⅱ 1 h组织块在进入下一阶段梯度酒精前要用吸水纸吸干水，尤其从95％洒精（Ⅲ）进入100％酒精（Ⅰ）时，切记防止带入水分，所有过程要在瓶口加盖，防止水分子进入。

（其他注意项见下文）三、透明（1）酒精（100％）︰二甲苯=1︰1 过度20min（2）二甲苯Ⅰ透明15min（3）二甲苯Ⅱ透明15min四、浸蜡（1）二甲苯︰石蜡=1︰:1软蜡（熔点52℃～54℃） 1h 温箱56～58℃(2) 石蜡Ⅰ（熔点54℃～56℃） 1h 温箱56～58℃（3）石蜡Ⅱ软硬混合（熔点更高） 1h 温箱56～58℃浸蜡温度保持在56～58℃，温度太高会烧坏组织块，太低石蜡会凝固。

石蜡切片的制作的实验指导石蜡制片法是将材料经过固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法，是永久制片法。

是光学显微镜的制片技术中最常用的一种方法。

（一）材料的采集与分割•采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。

为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。

分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。

分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。

•操作：取来桐花叶子数片，用刀片将其切割成小于1cm3大小的小块取材原则：•植物材料的取材（注意季节；横切面，纵切面）•动物组织的取材（各器脏的全部组织结构或重要结构，如消化管包括粘膜、粘膜下层、肌肉和外膜四层结构；切割方向，取材大小）注意事项：•遵循准确、典型、完整、适时原则•固定剂的选择•刀须锐利•详细记录时期、采集地点、标本名称、年龄、性别、取材部位、断面和所用固定剂等（二）杀死与固定•利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。

•将F.A.A固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖，时间为24小时。

说明：F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。

卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。

因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。

（乙醇+醋酸：F.A.A，也称卡诺氏固定液）固定和固定剂•固定的概念和目的••将所要观察的新鲜组织割取后立即投入某种固定剂中，通过化学药品的作用保存组织、细胞的形态结构，不使其改变形态和变质的一种措施•固定的作用和目的••防止组织自溶和腐败，保存细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等成分••使细胞成分沉淀和凝固，因而产生不同折射率，造成光学上的差异，使某些看不清的结构变得清晰，而且有些固定剂可使细胞各部分容易染色••固定剂兼有硬化作用，使组织硬化不易变形，利于后续操作••固定的主要目的是保持材料生活时的状态。

常规石蜡切片制片方法组织经系列酒精的脱水，经透明剂的作用，经熔化的石蜡的浸渍，包埋后所切成的切片称为石蜡切片。

组织脱水把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。

不管是正常的组织，还是有病变的组织，都含有不同程度量的水分。

据测定，人体的物质组成约含水55~67%，蛋白质15~18%，脂类10~15%，无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。

如果不把这些水分脱去，石蜡切片将无法进行，因为石蜡和水不能混合在一起，所以除去组织中的水分成为制片中的关键，用什么物质才能担当起这个重任呢，至今为止，国内所用的都是酒精。

因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合，所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。

酒精脱水力强，对组织又有硬化和易脆的不良影响。

在使用时，通常是从低浓度至高浓度，浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，组织经过这一系列处理后，基本可达到脱水的目的。

临床上如使用含酒精的固定液固定组织时，(Carnoy氏、AAF液)组织不需要经过低浓度的酒精，可直接进入95%酒精脱水。

组织脱水，目前常用的有两种方法1.人工组织脱水法该法经济实惠，灵活度高，可根据不同的组织及其大小来确定脱水时间，也可根据不同组织及大小分批进行脱水，其优点是：①可根据不同的组织及大小，任意增减脱水时间，达到脱水目的。

②可随时观察组织的变化，随时中断组织的脱水，不使组织过度硬脆。

③可以多层次地进行脱水。

缺点：①需耗费人力，每个步骤的递增都需要人工完成。

②不能大批量的进行脱水。

③必须在上班完成脱水或者定点于某一浓度的酒精中过夜，晚上无法进行梯度递增。

2.自动组织脱水机脱水法自动组织脱水机的机型品种繁多，大小不一，国内生产的轨道式和圆盘式两种，国外生产的有圆盘式和柜式两种，上述国内外四种型号的机子，我们都使用过，根据使用的效果做一简单介绍。

①轨道式自动组织脱水机。

这种机子容量小，脱水用的试剂不足一千毫升，组织块脱水用的提篮小，每次只能容纳40块组织左右，它适合于较小的单位，但不适合于大单位。

试验三、石蜡切片制作方法一、取材1．方法：取材应根据需要，用锋利的刀片从所需部位上切取一小块放在固定液中固定。

植物组织应根据实际情况，细的根茎和窄的叶片，可取3-5mm长一小段；粗的根、茎和宽的叶片，也可以切取一部分进行固定。

2．注意：所选材料要具有典型性、代表性。

材料要新鲜，保持生活状态，防止失水。

取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

二、固定1．方法：切取新鲜的材料，应按材料的种类，大小，性质和制作要求，立即将材料投入固定液中加以固定，使其形态结构和成分被化学试剂固定下来，与生活时保持相仿。

固定的时间，视材料的种类，大小，性质，固定液的种类与性质，渗透力的强弱等而定，可以从1-2小时到十几小时或二十几小时，甚至可以长到几天。

一些小的材料，仅需几十分钟。

例如把洋葱根尖固定与FAA固定液里，固定时间为12-24小时。

FAA固定液：50-70%酒精90ml，福尔马林（37-40%甲醛水溶液）5ml，冰醋酸5ml。

固定时间2-24小时，可作为保存剂长期保存，中间需换固定液。

固定液需放室温阴凉处储藏，也可放0-4℃下储藏。

2．注意：固定材料时固定液必须充足，一般为样品的20-30倍。

一般固定液都以新配为好，配好后应储存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

三、冲洗1．方法：将材料放入指管或广口瓶，并加入半管水，用纱布将管口扎住，然后倒置于水槽中，这样可以使指管半沉半浮于水中。

打开水龙头，让材料按冲洗的时间在流水中冲洗。

注意水流不宜太急，以免冲坏材料。

流水时间可根据材料和固定液的情况而定，一般需要12-24小时。

2．注意：固定液为酒精或酒精混合液，一般不冲洗。

若需冲洗则必须用与固定的酒精相近浓度的酒精冲洗。

含有铬酸、重铬酸钾的，必须用流水冲洗。

冲洗时间应与固定时间相同或更长。

四、脱水1．方法：脱水一般多使用酒精，为了不使材料急剧收缩，应用不同浓度的酒精，自低浓度到高浓度逐级脱水。