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【实验目的】1.掌握SDS-聚丙烯酰胺电泳法的原理。
2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。
【实验原理】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl 或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。
2.实验试剂⑴2mol/L Tris-HCl （pH8.8）：取24.2g Tris，加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
⑵1mol/L Tris-HCl （pH8.8）：取12.1g Tris，加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品，则蛋白质分子中的二硫键被还原，1g 蛋白质可定量结合1.4g SDS。
由于SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量的负电荷，其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时，它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离，有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。
用这种方法测定蛋白质的Mr，简便、快速，只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。
所得的结果，在Mr为15000~200000的范围内，与用其他方法测得的Mr相比，误差一般在±10%以内。
因此SDS测定Mr的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。
现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。
实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。
在一定的条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。
在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时，应注意以下几个问题：1.如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：⑴二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 . 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 . 熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动, 称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状, 在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量, 因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同, 二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动, 经过一定的时间后得以分离, 这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时, 蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小, 形状和所带的电荷量有关, 为了使其只与蛋白质分子的大小有关, 从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量, 就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称, 它是一种阴离子表面活性剂, 加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上（在一定条件下, 大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质）, 使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷, 其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别, 使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素, 于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线, 可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明, 它们在水溶液中的形状, 近似于雪茄烟形状的长椭园棒, 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? , 即 1.8 nm ）, 而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
分子生物学实验报告实验名称:SDS・聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工XXX姓名：XXX同组人：XXX学号：XXXX日期:XXXXSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是LI前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋口质，一般使用考马斯壳蓝（CBB）染色⑴。
本次实验的LI的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2材料和方法2.1实验原理2.1.1聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2」.1」性能聚丙烯醸胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范圉内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂屮义双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸钱（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N：N・四中基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，曲过硫酸鞍形成氧的自由基，后者乂使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自曲碱基状态下才有效, 所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1 小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4%, pH = 6.8,分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5%, pH二&8。
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品，则蛋白质分子中的二硫键被还原，1g 蛋白质可定量结合1.4g SDS。
由于SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量的负电荷，其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时，它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离，有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。
用这种方法测定蛋白质的Mr，简便、快速，只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。
所得的结果，在Mr为15000~200000的范围内，与用其他方法测得的Mr相比，误差一般在±10%以内。
因此SDS测定Mr的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。
现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。
实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。
在一定的条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。
在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时，应注意以下几个问题：1.如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：⑴二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。
一般以巯基乙醇作为还原剂。
在有些情况下，还需要进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。
⑵溶液中的SDS浓度：溶液中SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需达10倍以上。
⑶溶液的离子强度：溶液的离子强度应很低，最高不能超过0.26，因为SDS在溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS具有较高的平衡浓度。
2.不同的凝胶浓度适用于不同的Mr范围，Weber 的实验指出，在5%的凝胶中，Mr25000~200000的蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10000~70000Mr蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10000~50000Mr的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于Mr更高的蛋白质。
可根据所测Mr范围选择最合适凝胶浓度，并尽量Mr范围和性质与待测样品相近的蛋白质做标准蛋白质。
标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率）最好在0.2~0.8之间均匀分布。
在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制的完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定Mr，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。
3.有许多蛋白质，由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS与巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。
因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的Mr而不是完整分子的Mr。
为了得到更全面的资料，还必须用其他方法测定其Mr及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果相对照。
4.不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其Mr，已发现有些蛋白质用这种方法测出的Mr是不可靠的.这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。
例如组蛋白F1，它本身带有大量的正电荷，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，她Mr 是21000，但SDS-凝胶电泳测得的结果却是35000。
因此在分析SDS-凝胶电泳所测得的结果时，应该小心。
一般至少用两种方法来测定未知样品的Mr，互相验证。
为了判断待测样品是否可用SDS-凝胶电泳法来测定Mr，也可使蛋白质-SDS复合物在不同浓度（交联度相同）的SDS凝胶中电泳，得到Ferguson图。
如果待测样品的自由迁移率m0与标准蛋白质的m0基本交于一点，而且在不同浓度的SDS-凝胶中测得的Mr都相同，则表明此蛋白质在SDS-凝胶电泳中的行为是正常的，可以用SDS-凝胶电泳法测定其Mr。
现在常用做SDS-凝胶电泳的缓冲系统有好几种，有连续系统的也有不连续系统的。
操作方法一贮液及凝胶溶液的配置方法，参照聚丙烯酰胺凝胶电泳中的贮液配制方法，只是在分离胶和浓缩胶液中加入SDS，使SDS的浓度达到0.4%，电极缓冲液中SDS浓度达到1mg./ml,样品缓冲液中的SDS浓度为2g/100ml.SDS-凝胶电泳可采用垂直柱型，也可采用垂直板型。
由于垂直板型电泳操作方便，样品泳动的起点一致，便于对样品的分离情况做比较，目前大多采用此型。
二样品的制备一般是将样品溶解在含1%SDS、1%巯基乙醇的0.01mol/L,pH7.2的磷酸缓冲液中，在100℃加热2~5分钟。
蛋白质的最后浓度一般为0.05~1mg/ml。
也可以将上述溶液在37℃保温2小时而不是100℃加热。
一般说来，两种处理的结果都一样。
但如果蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37℃保温处理就会引起样品的水解，使测定失败，而100℃加热3分钟一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。
也有少数例外的情况，需采用特殊的样品处理方法。
1.标准蛋白样品的制备称取细胞色素c、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵清蛋白、牛血清清蛋白各0.2mg 左右，分别放入小试管中，按0.5mg/ml溶液的比例，向样品中加入“样品溶解液”（见试剂的配制），使充分溶解，轻轻盖上软木塞（不要盖紧，以免加热时迸出），将小试管放入沸水浴中加热3分钟，取出冷至室温。
2.待测蛋白质样品的制备固体样品的制备与标准蛋白质相同。
如待测样品已在溶液中，可先配制“浓样品溶解液”（各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高1倍，将待测液与“浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。
若待测溶液太稀可事先浓缩：若溶液的含盐量太高，则需先行透析。
处理好的样品即可用于电泳。
每个凝胶样品孔内加5μg蛋白质（或更少）便可得到清晰的区带。
处理好的样品溶液可在冰箱中保存较长的时间，使用前在100℃水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。
三电泳将聚合好的凝胶连同制胶模具装置在电泳槽上，拔掉样品槽模板（梳子），用电泳缓冲液清洗样品孔，然后将上下电极槽注满缓冲液，检查上槽无泄露，即可加样。
用微量注射器按号向凝胶样品孔中加样，没孔加20μl（含蛋白质1~5μg），稀的样品可适量增加其体积。
加样完毕后，打开直流稳压电源（负极接上槽，正极接下槽，事先接好），将电流调至50~80mA（根据凝胶板的横截面积适当调节增减），保持电流强度不变，待染料（染料已事先加在“样品溶解液“中）迁至距凝胶下端约1cm处，停止电泳。
四染色、脱色将凝胶取出，滑入一白瓷盘或大培养皿中，在染料区的中心插入细铜丝做为标志，加入染色液，染色1小时左右。
倾出染色液，用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液，数小时换液一次，直至背景清晰。
五Mr的计算通常以相对迁移率m R来表示迁移率，相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离见图3，按下式计算：相对迁移率m R=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离（cm）以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率做图，得到标准曲线如图4所示，根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其Mr。
图3、4试剂和器材试剂2. 0.2mol/l,pH7.2磷酸盐缓冲液：取280ml 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，加入720ml0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液，混匀后调pH至7.2。
此溶液用来进一步配置凝胶缓冲液、电极缓冲液和样品溶解液。
3.样品溶解液：0.01mol/ L,pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝。
用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。
配制方法如下：SDS 100mg巯基乙醇0.1ml甘油1ml溴酚蓝2mg试剂2 0.5ml加蒸馏水至总体积10ml4.电极缓冲液：0.1%SDS，0.1mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液（或Tris-HCl缓冲液）：取1g SDS，加入500ml试剂2，用蒸馏水定容到1000ml.5.染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入454ml 50%甲醇和46ml冰乙酸。
6.脱色液：75ml冰乙酸，875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。
7.SDS：市售化学纯SDS需要结晶后使用。
重结晶的方法如下：称取20gSDS，放入50ml 圆底烧瓶中，加约半牛角匙活性炭及300ml无水乙醇，搅拌，摇匀。
烧瓶上接一个小冷凝管。
在水浴上加热到乙醇微沸，回流约10分钟，用热过滤漏斗趁热过滤。
滤液应是无色透明。
滤液冷至室温后，移至－20℃冰箱中过夜。
次日，通过预冷的布氏漏斗抽滤，用少量－20℃无水乙醇洗沉淀3次，尽量抽干，将结晶置真空干燥器中干燥或40℃以下烘箱烘干。
简明操作方法1.将成套的两块玻璃板正确防如硅胶条中，然后夹在电泳槽中，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃。
安装好电泳槽后，用1.5%琼脂封底，待琼脂凝固后即可制胶。
2.将已经配制好的分离胶液轻轻混匀后，灌入玻板胶腔中至适当高度，表面加一薄层蒸馏水或双蒸水封闭胶液表面。
开始加入水后，会在凝胶液和水之间形成分界线，在聚合过程中，分界线会逐渐消逝，待分界面再次出现时，说明分离胶已经聚合完全。
3.待分离胶聚合后，倒掉表面的水，再将配制好的浓缩胶轻轻混匀后灌满玻璃板胶腔，迅速插入样品梳，静置聚合。
4.待测样品用样品缓冲液制成0.5~1.0mg/ml左右的溶液，在沸水浴中加热3~4分钟，冷却后点样。
5.浓缩胶聚合后，拔掉样品梳，装好电泳槽，在上下槽中注入电极缓冲液，用微量注射器点样，每个样品槽中点样20~40μl。
如果样品浓度太低，可以适当加大点样量。
6.上槽为负极，下槽为正极，连接好电泳仪电源，用恒压（100V）或恒流（30mA）左右电泳，也可以在样品通过浓缩胶后，加大电压到250V进行电泳。
