原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型

doi：10.3969/j.issn.l000484X.2020.23.006CpG ODN协同小鼠肝癌细胞裂解物对小鼠原位移植性肝癌的抑制作用研究①孙鹏②李欢欢王卫芳窦瑶周晓晶(长春中医药大学临床医学院，长春130117)中图分类号R730.51文献标志码A文章编号1000-484X（2020）23-28424）4[摘要]目的:研究CpG ODN与小鼠肝癌细胞（H22）裂解物（TCL）联用对小鼠原位移植性肝癌的抑制作用及机制初探。

方法:制备H22细胞裂解物和建立BALB/c小鼠原位移植性肝癌模型。

将模型鼠随机分为四组PBS、TCL、CpG ODN和CpG ODN+TCL,观察各组小鼠肿瘤生长情况及小鼠的生存期。

采用细胞毒性淋巴细胞（CTL）杀伤实验观察各组小鼠淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤情况。

用ELISA方法检测CpG ODN协助TCL诱导Th1型细胞因子分泌水平。

结果:与其他组相比CpG ODN+TCL明显抑制了肿瘤生长、延长了荷瘤鼠的生存期（P<0.05）o体内外实验显示，CpG ODN能协同TCL刺激小鼠产生Th1型细胞因子和诱导CTL反应。

结论：以CpG ODN为佐剂的TCL具有抑制小鼠原位移植性肝癌的作用，且这种作用可能由于CpG ODN协同TCL诱导小鼠产生的Th1型细胞因子和CTL反应实现的。

[关键词]肿瘤细胞裂解物;免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸;肝癌;Thl型免疫反应Effect of CpG ODN on assisting TCL from liver cancer cells to induce immune response against orthotopic-transplantated liver cancer in miceSUN Peng,LI Huan-Huan,WANG Wei-Fang,DOU Yao,ZHOU Xiao-Jing.Clinical Medical College,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun130117,China[Abstract]Objective:To study the effect of CpG ODN on assisting TCL from H22cells to induce immune response against or-thotopic-transplantated liver cancer in mice and to explore the mechanism.Methods:We prepared TCL from H22cells and built BALB/c mice with orthotopic-transplantated liver cancer.The model mice were injected divided into PBS group,TCL group,CpG ODN group and CpG ODN+TCL group randomly.The mice were monitored for tumor growth and recoding the survival.CTL killing experiment was used to observe the killing of liver cancer cells by lymphocytes in each group.ELISA was used to detect CpG ODN assisting TCL to induce Th1cytokine secretion level.Results:Compared with other groups,CpG ODN+TCL significantly inhibited the growth of orthotopic transplantation liver cancer cells and prolong survival in mice（P<0.05）.In vivo and vitro experiments,CTL response and Th1-biased cytokine also induced by CpG ODN adjuvanted TCL.Conclusion:TCL with CpG ODN as an adjuvant has the effect of inhibiting orthotopic liver cancer in mice,and this effect may be realized by CpG ODN and TCL-induced Th1cytokine and CTL response in mice.[Key words]TCL；CpG ODN;Liver cancer；Th1immune response肝癌是最常见的肝脏原发恶性肿瘤，其致死率极高［1］。

肝癌小鼠造模实验方法(1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。

具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c（昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。

若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。

(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。

)(2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。

并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。

7mL，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝(3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*106个瘤细胞)（5*106）？。

全程严格无菌操作，皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL／只(含2*1040min内完成。

(4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg／kg、300mg／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip组(60mg／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组(1000mg／kg、4000mg／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO只小鼠。

造模24h后，阳性对照组(CTX)20mg／kg和青蒿琥酯ip组(60mg／kg)，腹腔注射0．2mL／只，每天1次，连续lOd：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL／只，每天1次，连续lOd。

模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd。

平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。

记录各小鼠死亡的时间。

其他问题：检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？1、造模后第二天给药2、肿瘤长出一定体积后在给药。

迷迭香酸抑制荷瘤小鼠H22肝癌移植瘤生长的作用机制曹雯;莫凯;潘金凤;韦斯军;王振宁;尹园【期刊名称】《临床合理用药杂志》【年(卷),期】2024(17)11【摘要】目的观察迷迭香酸抑制荷瘤小鼠H22肝癌移植瘤生长的作用机制。

方法建立肝癌H22荷瘤小鼠模型,根据随机数字表法分为模型组、迷迭香酸组、环磷酰胺(CTX)组,每组5只。

迷迭香酸组灌胃给予迷迭香酸,CTX组腹腔注射CTX,模型组灌胃给予等体积0.9%氯化钠注射液,3组均连续给药14 d。

比较3组肿瘤生长情况、免疫器官指数、肿瘤组织病理变化、T淋巴细胞(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))、CD3^(+)、CD4^(+)凋亡率、肿瘤组织中免疫细胞因子[干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)]水平。

结果给药14 d后,CTX组和迷迭香酸组的肿瘤重量和体积低于模型组(P均<0.01);迷迭香酸组小鼠体质量、胸腺指数和脾脏指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);CTX组小鼠体质量和胸腺指数低于模型组(P均<0.01),脾脏指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

HE切片染色结果显示,模型组小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞分布密集且数目丰富,坏死细胞较少;CTX组肿瘤细胞数明显减少,细胞排列稀疏,肿瘤细胞坏死较多;迷迭香酸组出现肿瘤细胞凋亡和坏死,肿瘤细胞数目减少。

CTX组脾脏组织中CD3^(+)、CD4^(+)水平高于模型组(P均<0.05),CD8^(+)水平、CD4^(+)/CD8^(+)与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);迷迭香酸组CD4^(+)水平、CD4^(+)/CD8^(+)高于模型组,CD8^(+)水平低于模型组(P<0.05或P<0.01),CD3^(+)水平与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);CTX 组荷瘤小鼠脾脏组织中CD4^(+)、CD8^(+)凋亡率高于模型组,迷迭香酸组CD4^(+)凋亡率低于模型组,CD8^(+)凋亡率高于模型组(P<0.05或P<0.01);CTX 组与迷迭香酸组肿瘤组织中IFN-γ水平高于模型组,TNF-α、IL-10水平低于模型组(P<0.05或P<0.01)。

疾病小鼠模型系列之肝癌篇前面疾病模型专题已经为大家介绍了肺癌及胃癌小鼠模型，今天是疾病模型专题第三讲，小编将为大家介绍肝癌相关的小鼠模型。

近年来，肝癌的发病率在全球呈上升趋势。

根据美国癌症学会官方期刊发表的《2018年全球癌症统计数据》报告显示[1]，肝癌发生率高居恶性肿瘤第六位，是导致癌症相关死亡的第四大疾病(Fig.1)。

其中，中国的肝癌病例数占全世界总数的55%，肝癌已经成为我们的国家病。

Fig.1 排名前10的癌症在全球范围内的发病和死亡占比诱导肝癌发生的相关因素特别多，诸如：病毒，化学致癌物，酒精等，但其确切的发病机制目前尚不清楚。

因此，建立与人类肝癌生物学特性相近的动物模型，对于肝癌发病机制的研究以及药物开发具有重要的现实意义。

首先我们一起来了解肝癌基本知识！肝癌的分类肝癌主要分为原发性及继发性两种。

●原发性肝癌：肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，为我国常见恶性肿瘤之一。

原发性肝癌根据不同的组织类型分为：肝细胞肝癌(HCC)和肝内胆管细胞癌(ICC)，其中HCC最为常见，约占70-85%。

●继发性肝癌：又称为转移性肝癌，其他脏器的肿瘤细胞经过血液、淋巴或直接侵入肝脏引发的肿瘤。

肝癌的发展进程肝癌的发生是一个多阶段逐渐演变恶化的过程，从最初的肝炎到肝硬化，再到最后的肝癌，是一个多步骤的发展过程[2]。

Fig.2 肝损伤不同阶段(图片来自于网络)由于不同病因会引发不同基因的改变，导致肝癌具有异质性(Fig.3)[3]，因此肝癌模型不具有普遍性。

接下来，小编就目前常用的肝癌模型进行综述，供广大研究者进行参考。

Fig.3 常见的肝癌模型病理图（a.DEN诱发的肝癌; b. DEN+CCl4诱发的肝癌；c.Mdr2肝特异性敲除引发的肝癌；d.Tak1肝特异性敲除引发的肝癌; e.Pten肝特异性敲除引发的肝癌;f.原位注射肿瘤细胞引发的肝癌）常见的肝癌动物模型01 01诱发性肝癌模型许多化学致癌剂达到足够的剂量及时间可诱发动物形成肿瘤。

小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【摘要】目的:探讨用肝癌H22细胞建立小鼠肝癌原位移植模型.方法:将肝癌H22细胞注入小鼠腹腔内,建立异位移植模型;抽取腹水中癌细胞接种于小鼠肝实质内,建立原位移植模型.结果:移植后10d可扪及肿瘤生长,模型成功率94.4％;晚期自发转移率79.4％,腹水产生率35.3％,无自发消退;移植瘤保持甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)高分泌及γ-氨基酰转氨酶(γ～GT)同工酶阳性的特点;模型平均自然生存期28d.结论:小鼠肝癌原位模型成功率高,易于制作,生物学特征符合模拟人类肝癌在体内发生发展的全过程,可成为今后人类研究肝癌的重要动物模型.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2015(038)006【总页数】2页(P48-49)【关键词】肝癌;H22细胞;原位移植模型;小鼠【作者】项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【作者单位】佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003【正文语种】中文【中图分类】R735.7肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，因其发病率高、恶性程度高、死亡率高，素有“癌中之王”的称号[1]。

目前已有大量研究为肝癌临床的治疗提供基础依据，而肝癌动物模型一直是肝癌临床与基础研究工作的重要工具。

目前有关人肿瘤转移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠,动物肿瘤则多数是用Wistar或SD大鼠建立的,而用小鼠建立原位肿瘤移植模型国内外报道较少。

小鼠作为一种更经济，易饲养，易获得的实验研究载体，在发挥其普遍应用性方面有着重大的作用。

小鼠肝癌原位移植模型作为一种新型的动物模型是否能更好地模拟人肝癌在体内发生、发展、侵袭及转移的过程，本实验将研究报道如下。

人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法先用组织学完整的新鲜人肝癌组织接种于裸鼠皮下，形成皮下移植瘤，然后用此移植瘤组织再接种于裸鼠肝内，建立肝原位移植瘤模型（间接肝原位移植瘤模型），并将其与直接肝原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型作比较。

一、间接肝原位移植瘤模型的制备1. 用新鲜的肝癌外科手术切除标本（来自长海医院，患者为1名47岁男性，病理诊断：肝左叶肝细胞癌，粗梁型，Ⅱ级），在Hanks液中，去除坏死组织和非癌组织后切成1～2 mm3小块。

2. 取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠腰背部皮下，待皮下移植瘤长到直径约1 cm时切取肿瘤，在Hanks液中，去除坏死组织后切成1～2 mm3小块，裸鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，行左上腹横切口，暴露肝脏。

3. 取上述2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠肝右叶深部实质内，全层关腹。

二、直接肝原位移植瘤模型的制备1. 同一例新鲜肝癌手术切除标本，处理方法同皮下移植，裸鼠处理同间接肝原位移植，取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头直接植入裸鼠肝右叶深部实质内。

2. 皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型的制备。

三、病理检查和相关指标检测1. 解剖和组织学检查（1）所有裸鼠接种后，分组分笼饲养，自由进食，每天观察1～2次。

（2）当裸鼠处于全身衰竭状态时处死并作大体解剖，对接种瘤和转移瘤分别进行观察、测量，记录肿瘤侵袭和转移情况，重要器官（主要为肝和肺）经10%中性甲醛固定后，常规石蜡制片，光学显微镜检查。

2. 周围血甲胎蛋白(AFP)检测处死前，均采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。

3. 瘤细胞DNA含量分析留取部分移植瘤标本采用流式细胞术进行DNA含量分析。

注意事项目前，肝癌的复发和转移仍然是其术后长期存活的主要障碍。

为了研究肿瘤的转移机制，建立接近于人体的肿瘤动物模型显得尤为重要。

两种方法建立小鼠原位肝癌模型的比较摘要】目的比较建立小鼠原位肝癌模型的两种方法的优劣。

方法分别采用肝脏原位注射细胞法和尾静脉高压水流动力学注射法建立小鼠原位肝癌模型，对两组小鼠肝脏的成瘤情况进行比较。

结果两组小鼠均能在短期内成瘤，且成瘤率高。

结论尾静脉高压水流动力学注射法比原位注射细胞法更容易操作，小鼠存活率高，肝脏成瘤更均匀。

【关键词】原位肝癌模型高压水流动力学注射【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）14-0382-02原发性肝细胞肝癌是我国乃至全球范围内的研究热点，而原位肝癌小鼠模型是进行原发性肝细胞肝癌基础研究和临床研究的重要工具。

目前原位肝癌模型主要采用化学诱导法（DEN），但是该方法建立模型成瘤的时间比较长，大概需要6-8个月，导致研究的周期很长。

本文尝试了两种比较快速地建立小鼠原位肝癌模型的方法--肝脏原位注射细胞法和尾静脉高压水流动力学注射法，并对这两种方法建立的小鼠模型进行了比较。

1 实验材料及方法1.1 实验动物与试剂C57BL/6小鼠7-8周，雄性，20只,购自上海斯莱克实验动物有限公司。

Hepa1-6细胞株购自中科院上海细胞库。

DMEM高糖培养基，胎牛血清，购自上海英潍捷基公司。

水合氯醛、碘伏购自国药集团。

注射器，手术器械、缝合线、针领自苏州大学材料供应中心。

1.2 方法1.2.1 细胞悬液制备 Hepa 1-6在37℃、5 % CO2 的细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞,0.25%胰蛋白酶消化后,收集于15mL离心管中，用PBS调整细胞悬液浓度至5×107/mL用于原位注射细胞法,每只小鼠注射20uL。

用PBS调整细胞悬液浓度至5×105/mL 用于尾静脉高压水流动力学注射法每只小鼠注射2mL。

1.2.2 小鼠分组 20只7-8周龄的C57BL/6雄性小鼠分为2组，第1组10只进行肝脏原位注射细胞建立模型，第2组10只采用尾静脉高压水流动力学注射的方法建立模型。