比伐卢定的分离纯化

注射用比伐芦定产品类别化学药品请仔细阅读使用说明书并按说明使用或在药师指导下购买和使用。

【药品名称】通用名称：注射用比伐芦定英文名称：Bivalirudin For Injection汉语拼音：zhusheyongbifaluding剂型：注射剂【成份】抗凝成分是水蛭素衍生物(片断)，系一合成 20肽，相对分子质量 2 180。

结构式为 Phe—Pro——Arg——Pro ——Gly——Gly——Gly——Gly——Ash——Gly——Asp—— Phe—Glu—Glu—Ile—Pro—Glu—G1u—Tvr—Leu。

【性状】【作用类别】【药理作用】本品为凝血酶(thrombin)直接的、特异的、可逆性抑制剂。

无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性…1，其作用与肝素不同，它不依赖于抗凝血酶1V(NI1_Ⅳ)、肝素辅因子Ⅱ等。

凝血酶是凝血反应中起核心作用的丝氨酸蛋白酶：它水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体；激活凝血因子XⅢ；促进纤维蛋白交联形成稳定血栓的共价结构。

同时，凝血酶激活凝血因子V，Ⅷ；激活血小板，促进血小板聚集和颗粒释放。

因凝血酶可水解本品多肽顺序中Arg3和 Pro4之间的肽键，使本品失活，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。

在体外实验中，本品以浓度依赖方式延长健康人血浆的活化部分凝血酶时间 (activated partial thromboplastin time，af T)、凝血酶时间 (thrombin time，1vr)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)。

本品与游离型凝血酶或血栓型凝血酶的结合不受血小板释放物质影响。

健康志愿者试验显示：本品以剂量和浓度依赖方式延长活化凝血时间(activated clotting time，ACT)，af耵，Prr和1vr。

创作编号：GB8878185555334563BT9125XW创作者：凤呜大王*注射用比伐卢定说明书【通用名称】比伐卢定【产品英文名称】 Bivalirudin【功效主治】本品主要用于预防血管成型介入治疗不稳定性心绞痛,前后的缺血性并发症。

【化学成分】抗凝成分是水蛭素衍生物(片断)，系一合成 20肽，相对分子质量 2 180。

结构式为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Gl u-Glu-Tyr-Leu-OH【药理作用】本品为凝血酶(thrombin)直接的、特异的、可逆性抑制剂。

无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性…1，其作用与肝素不同，它不依赖于抗凝血酶1V(NI1_Ⅳ)、肝素辅因子Ⅱ等。

凝血酶是凝血反应中起核心作用的丝氨酸蛋白酶：它水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体；激活凝血因子XⅢ；促进纤维蛋白交联形成稳定血栓的共价结构。

同时，凝血酶激活凝血因子V，Ⅷ；激活血小板，促进血小板聚集和颗粒释放。

因凝血酶可水解本品多肽顺序中Arg3和 Pro4之间的肽键，使本品失活，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。

在体外实验中，本品以浓度依赖方式延长健康人血浆的活化部分凝血酶时间 (activated partial thromboplastin time，af T)、凝血酶时间 (thrombin time，1vr)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)。

本品与游离型凝血酶或血栓型凝血酶的结合不受血小板释放物质影响。

健康志愿者试验显示：本品以剂量和浓度依赖方式延长活化凝血时间(activated clotting time，ACT)，af耵，Prr和1vr。

因血管梗塞≥70%而接受经皮穿刺腔内冠状动脉成型术(PTCA)治疗的冠心病患者，给予本品后也可获得与健康人相同的抗凝效果。

毛细管气相色谱法测定比伐卢定有机溶剂残留量摘要：目的建立气相色谱（GC）测定比伐卢定中甲醇、乙酸乙酯、吡啶、乙腈4种有机残留量的测定方法。

方法采用直接进样毛细管气相色谱法，色谱柱为：DB-WAX色谱柱（30m×320 m×0.5 m）载气为氮气，FID检测器，DMF 为溶剂。

结果：此色谱条件下被测物均能得到很好的分离，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，回收率良好。

结论：方法简便、灵敏，结果准确、可靠，适用于比伐卢定中有机残留量的检测。

关键词：比伐卢定有机残留量毛细管气相色谱法比伐卢定（bivalirudin）是一种近年来应用于临床的直接凝血酶抑制剂，于2000年批准在美国上市，其有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，作用可逆而短暂。

早期的临床研究显示：比伐卢定抗凝治疗效果确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比使用更为安全。

由于在原药合成过程中使用了有机溶剂甲醇、乙酸乙酯、吡啶、乙腈，在成品中可能会有一定量的残留.按中国药典2010年版（附录Ⅷ）规定，该4种有机溶剂均有残留限量。

对于原药中4种有机残留溶剂的色谱分析及残留量的测定尚未见文献报道。

笔者参考了有关文献采用直接进样毛细管气相色谱法，测定了比伐卢定原料药中甲醇、乙酸乙酯、吡啶、乙腈的残留量。

方法简便、灵敏，结果准确可靠。

一、仪器与试药1.仪器Agilent 7890A2.试药比伐卢定原料药3批二、方法与结果1.色谱条件HP-INNOWAX（30m×320μm×0.5μm）毛细管柱；程序升温，起始40℃，保持8min，以每分钟15℃升至205℃，保持2min ；FID检测器，检测器温度250℃；进样口温度：240℃；分流比：10：1 ；以DMF为溶剂，直接进样1μl。

2.供试品溶液与对照品溶液的制备取比伐卢定样品0.1g，精密称定，用DMF1.0ml溶解，作为供试品溶液。

注射用比伐卢定说明书 Document serial number【LGGKGB-LGG98YT-LGGT8CB-LGUT-注射用比伐卢定说明书【通用名称】比伐卢定【产品英文名称】 Bivalirudin【功效主治】本品主要用于预防血管成型介入治疗不稳定性心绞痛,前后的缺血性并发症。

【化学成分】抗凝成分是水蛭素衍生物(片断)，系一合成 20肽，相对分子质量 2 180。

结构式为 D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH【药理作用】本品为凝血酶(thrombin)直接的、特异的、可逆性抑制剂。

无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性…1，其作用与肝素不同，它不依赖于抗凝血酶1V(NI1_Ⅳ)、肝素辅因子Ⅱ等。

凝血酶是凝血反应中起核心作用的丝氨酸蛋白酶：它水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体；激活凝血因子XⅢ；促进纤维蛋白交联形成稳定血栓的共价结构。

同时，凝血酶激活凝血因子V，Ⅷ；激活血小板，促进血小板聚集和颗粒释放。

因凝血酶可水解本品多肽顺序中Arg3和 Pro4之间的肽键，使本品失活，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。

在体外实验中，本品以浓度依赖方式延长健康人血浆的活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time，af T)、凝血酶时间 (thrombin time，1vr)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)。

本品与游离型凝血酶或血栓型凝血酶的结合不受血小板释放物质影响。

健康志愿者试验显示：本品以剂量和浓度依赖方式延长活化凝血时间(activated clotting time，ACT)，af耵，Prr和1vr。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010858578.6(22)申请日 2020.08.24(71)申请人 扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司地址 610000 四川省成都市都江堰市彩虹大道南段802号申请人 四川海汇药业有限公司(72)发明人 曹康平　叶鑫发　杨柱柱　张丽君　谢义鹏　(74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) 51222代理人 李高峡　张娟(51)Int.Cl.C07K 14/815(2006.01)C07K 1/06(2006.01)C07K 1/04(2006.01) (54)发明名称一种比伐芦定的制备方法(57)摘要本发明提供了一种比伐芦定的制备方法，属于多肽药物制备方法技术领域。

该方法以2‑CTC树脂为载体，采用固相法合成三肽片段Boc ‑D ‑Phe ‑Pro ‑Arg(Pbf)‑OH和六肽片段Fmoc ‑Pro ‑Gly ‑Gly ‑Gly ‑Gly ‑Asn(Dod)‑OH；再以Wang树脂或2‑CTC树脂为载体，通过逐步法偶联Fmoc保护氨基酸，获得中间体(10‑20)‑肽树脂，脱除Fmoc保护基后，依次逐个偶联以上的六肽片段和三肽片段，经裂解获得比伐芦定粗品，最后经纯化获得比伐芦定精品。

此方法极大地提高了产品收率和纯度，精品纯度达99.89％，单杂均控制在0.1％以下，也降低了成本，利于大规模、产业化生产。

权利要求书6页 说明书15页序列表3页 附图2页CN 112062835 A 2020.12.11C N 112062835A1.一种比伐芦定的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)使用2-CTC树脂，采用多肽固相合成法逐一偶联Fmoc保护氨基酸，分别合成三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH和六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH；(2)使用Wang树脂或2-CTC树脂，采用多肽固相合成法，按比伐芦定序列从C端向N端偶联，逐一偶联Fmoc保护氨基酸，得到中间体(10-20)-肽树脂，所述中间体(10-20)-肽树脂的结构为：Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；(3)采用多肽固相合成法，在中间体(10-20)-肽树脂上依次逐个偶联六肽片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Dod)-OH和三肽片段Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-OH，得到侧链全保护的比伐芦定肽树脂；(4)侧链全保护的比伐芦定肽树脂经TFA体系裂解后，得到比伐芦定粗品；(5)比伐芦定粗品经粗分、反相HPLC纯化，再经等电点沉淀，得到比伐芦定精品。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811101059.4(22)申请日 2018.09.20(71)申请人 济南康和医药科技有限公司地址 250101 山东省济南市高新区颖秀路2766号8层801房间(72)发明人 张颖　冯金辉　石鑫磊　王德龙　陈雷　王品　(51)Int.Cl.C07K 7/08(2006.01)C07K 1/04(2006.01)C07K 1/08(2006.01)C07K 1/06(2006.01)C07K 1/20(2006.01)(54)发明名称一种比伐芦定的制备方法(57)摘要本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种比伐芦定的制备方法。

发明采用Fmoc -Pro -Gly -Gly -OH与Fmoc -Gly -Gly -OH不存在侧链保护的氨基酸片段为原料，工艺简单，质量可控，易工业化生产，且通过Fmoc -Pro -Gly -Gly -OH更好的避免了Fmoc -Pro -Gly -Gly -Gly -Gly -OH溶解性差、重结晶困难等难点，同时避免了Bivalirudin ±1Gly和Bivalirudin ±2Gly的杂质产生。

固相合成比伐芦定操作简单，易工业生产，采用TFA裂解，避免HF使用，安全性高，合成比伐芦定粗品纯度在93％以上，产率99％以上。

采用乙酸铵溶液和乙腈进行一步纯化，TFA/水和乙腈完成二步纯化，冻干即可得到精肽纯度99.8％以上，收率58％以上，纯化工艺简单，更易于工业化大规模生产。

权利要求书1页 说明书6页CN 109134615 A 2019.01.04C N 109134615A1.一种比伐芦定的制备方法，其特征在于，该方法具体步骤为：(1)采用Fmoc -Leu -Wang树脂或Fmoc -Leu -CTC树脂作为固相载体，加入脱保护剂，脱除树脂上的Fmoc保护基；(2)将步骤(1)中脱除Fmoc保护基的树脂在活化剂存在下，按比伐芦定序列依次偶联Fmoc保护氨基酸，获得侧链保护的比伐芦定肽树脂：R 1-D -Phe -Pro -Arg(Pbf)-X -Y -Asn (Trt)-Gly -Asp(OtBu)-Phe -Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile -Pro -Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu -树脂其中，R 1为Fmoc或Boc；X为Pro -Gly -Gly；Y为Gly -Gly；(3)将步骤(2)得到的侧链保护的比伐芦定肽树脂进行裂解，沉降得比伐芦定粗品；(4)将步骤(3)中的比伐芦定粗品纯化、冻干，得比伐芦定精品。

专利名称：一种比伐卢定的合成方法
专利类型：发明专利
发明人：刘志国,魏祝宇,潘海良,叶有志,汪岳斌申请号：CN202111449570.5
申请日：20211201
公开号：CN113845587B
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种比伐卢定的合成方法，属于多肽药物制备技术领域。

比伐卢定的合成方法，包括：步骤（1），活化树脂，采用活化液对树脂进行活化处理获得活化树脂，所述活化液包括二氯甲烷、B‑丁内酯、纳迪克酸酐；步骤（2），Leu‑树脂的合成，采用固相合成法将溶胀后的活化树脂和Fmoc‑Leu合成Leu‑树脂；步骤（3），比伐卢定‑树脂的合成，采用固相合成法合成比伐卢
定‑树脂；步骤（4），脱保护，将比伐卢定‑树脂脱保护得到比伐卢定。

本发明合成方法合成的比伐卢定得率更高。

申请人：浙江湃肽生物有限公司南京分公司
地址：210046 江苏省南京市栖霞区八卦洲街道和悦路99号909室
国籍：CN
代理机构：北京国翰知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：李宇翔
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注射剂glyansargproilegluglupheaspglyasngluglutryleupheproglyglyglygly比伐卢定进口品未进国内深圳信立泰产品将于今年年终上市单纯抗iia因子抑制剂主推pci手术直接的特异的可逆性抑制凝血酶a比伐卢定的作用机制凝血酶活性部位活性部位结合部位结合部位结合部位maraganorejmetcbiochemistry19902930
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PCI
PPI
比伐卢定 的运用
急性心肌梗死（AMI） HIT:血小板减少症
VBT：管内放大家参考，
感谢您的关注！
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比伐卢定的作用机制
比伐卢定不与血浆蛋白，红细胞结合，不与P450作用， 在血浆中游离存在，静脉注射后5min可以达峰。以浓度方 式延长血清中的活化部分凝血酶时间（aPPT)、凝血时间 （TT)、凝血酶原时间（PT)。血清中游离的及血栓中结合 的凝血酶均能被抑制，不受血小板释放物质的影响。进入 人体内被蛋白酶清除，经肾脏排出，在肾功能正常状体下 半衰期为25min。
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比伐卢定的作用机制
因凝血酶可水解本品多肽顺序中 Arg3 和 Pro4 之间的 肽键 ,使本品失活 ，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而 短暂的。
Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ans Gly
Glu Ile Glu Glu Phe Asp Gly Asn Glu Try Leu Maraganore JM ,etc . Biochemistry ,1990 ,29 (30) :7095.
比伐卢定-----进口品未进国内，深圳信立泰产品将于今年年终上 市，单纯抗IIa因子抑制剂，主推PCI手术
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比伐卢定的作用机制
活性部位

注射用比伐卢定说明书【通用名称】比伐卢定【产品英文名称】 Bivalirudin【功效主治】本品主要用于预防血管成型介入治疗不稳定性心绞痛,前后的缺血性并发症。

【化学成分】抗凝成分是水蛭素衍生物(片断)，系一合成 20肽，相对分子质量 2 180。

结构式为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu -Tyr-Leu-OH【药理作用】本品为凝血酶(thrombin)直接的、特异的、可逆性抑制剂。

无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性…1，其作用与肝素不同，它不依赖于抗凝血酶1V(NI1_Ⅳ)、肝素辅因子Ⅱ等。

凝血酶是凝血反应中起核心作用的丝氨酸蛋白酶：它水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体；激活凝血因子XⅢ；促进纤维蛋白交联形成稳定血栓的共价结构。

同时，凝血酶激活凝血因子V，Ⅷ；激活血小板，促进血小板聚集和颗粒释放。

因凝血酶可水解本品多肽顺序中Arg3和 Pro4之间的肽键，使本品失活，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。

在体外实验中，本品以浓度依赖方式延长健康人血浆的活化部分凝血酶时间 (activated partial thromboplastin time，af T)、凝血酶时间 (thrombin time，1vr)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)。

本品与游离型凝血酶或血栓型凝血酶的结合不受血小板释放物质影响。

健康志愿者试验显示：本品以剂量和浓度依赖方式延长活化凝血时间(activated clotting time，ACT)，af耵，Prr和1vr。

因血管梗塞≥70%而接受经皮穿刺腔内冠状动脉成型术(PTCA)治疗的冠心病患者，给予本品后也可获得与健康人相同的抗凝效果。