三代基因组编辑技术

基因组编辑三大技术：CRISPR、TALEN和ZFN最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。

大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由细胞进行修复。

区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。

在过去，如果你想在模式生物中进行复杂的基因组修饰，你几乎只能选择小鼠。

首先，你要设计一个打靶载体，将其引入小鼠胚胎干细胞，并将这些经过修饰的细胞注射到小鼠囊胚。

接着是孕育、出生、筛选，等待所需的幼崽成长到性成熟，交配和杂交，之后是更多孕育、更多筛选，一直下去。

复杂的项目也许需要一年或更长时间才能完成。

它几乎只对小鼠起作用。

原因还不是很清楚，也许小鼠胚胎干细胞有着特别活跃的同源重组系统。

大鼠和人类则不是这样。

不过好消息是，最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。

大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由细胞进行修复。

区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。

锌指核酸酶（ZFN）第一个使用定制DNA核酸内切酶的基因组编辑策略就是锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，简称ZFN）。

锌指蛋白是转录因子；每个指模块识别3-4个碱基的序列，将这些模块混合搭配，研究人员或多或少能靶定他们希望的任何序列。

Sigma-Aldrich公司将ZFN技术商业化，推出CompoZr ZFN试剂平台。

ZFN是异源二聚体，其中每个亚基含有一个锌指结构域和一个FokI核酸内切酶结构域。

FokI结构域必须二聚化才有活性，确保必须存在两个相邻的DNA结合事件才能实现双链断裂，从而增加了目标特异性。

切割事件使得大部分基因组编辑技术得以实现。

在双链断裂后，细胞试图修复它。

最简单的方法是非同源末端接合（NHEJ），其中细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉近，这往往产生移码。

第三代基因组测序特征
第三代基因组测序是指利用先进的技术和方法，针对DNA序列进行高效、精准、快速的测序，具有以下特征：
1.速度快：第三代基因组测序速度比第二代基因组测序提高了数十倍。

2.费用低：第三代基因组测序的费用相对低廉，适用于大规模的高通量测序。

3.数据量大：第三代基因组测序能够产生更大量的测序数据，为后续的基因组学研究提供了更多样的数据资源。

4.准确性高：第三代基因组测序方法能够极大程度地提高测序准确性，降低错误率。

5.使用方便：第三代基因组测序方法使用简便，减少了操作复杂度，方便用户进行基因组测序分析。

6.适用广泛：第三代基因组测序方法不仅适用于人类基因组的测序，还可以用于其他生物体的基因组测序，如动植物、微生物等。

7.多样性：第三代基因组测序方法不同于第二代方法的“读长”，第三代方法具有更大的“读长”，能够更全面地反映基因组的复杂性。

基因组编辑方法
基因组编辑，又称基因编辑（gene editing），是指一种通过删除、插入或替换基因组的某个片段或特定碱基使基因组发生特定变化的分子技术。

基因组编辑技术主要包括以下几种方法：
- 第三代基因编辑技术：CRISPR-Cas9，这种技术能以极其简单的方式对基因进行精准操作——编辑。

- TALEN 技术：这是一种依靠 TALEN 蛋白对基因组进行编辑的方法。

TALEN 蛋白由一对核酸酶和一对与目的 DNA 序列互补的核酸组成，可以在特定的位置切断 DNA 双链，并进行基因编辑。

- ZFN 技术：ZFN 是一种由一对锌指核酸酶和一段与目的 DNA 序列互补的寡核苷酸组成的基因编辑工具。

ZFN 可以特异性地识别并结合到目的 DNA 序列上，然后在锌指核酸酶的催化下切断 DNA 双链，实现基因编辑。

利用基因组编辑技术，可以精确地定位到基因组上的某一个位点，在这个位点上剪断目的DNA片段，插入新的DNA片段，从而使特定位点基因序列发生突变，实现对DNA序列的遗传改造操作。

三代基因组组装流程
1. 数据质控：首先，对原始测序数据进行质量控制，包括去除低质量序列、去除接头序列和低质量碱基等。

2. 参考基因组预处理：针对亚基因组，根据参考基因组信息对原始数据进行预处理，如去除线粒体DNA序列、剔除已知的污染序列等。

3. 数据比对：将预处理后的数据与参考基因组进行比对，通常采用软件工具如BWA、Bowtie 等进行比对。

比对可以确定测序reads在参考基因组上的位置，使其能够被正确组装。

4.组装：根据比对结果，利用组装算法将比对上的reads按照相对位置进行重组，形成较长的连续序列（contigs）。

常用的组装软件包括SPAdes、Velvet、SOAPdenovo等。

5. 连接和填补：对测序reads之间存在的间隙进行连接和填补，以获得更完整的染色体序列。

这一步通常借助长读长测序技术如PacBio或Nanopore进行，可以提供跨过间隙的长的序列片段。

6. 纠错：利用测序重叠信息，对组装得到的序列进行错误校正，去除可能存在的测序错误。

7. 染色体级组装（optional）：在基因组组装的最后一步，将contigs进行再连接，形成较长的染色体级序列。

8.评估和注释：对组装得到的基因组序列进行质量评估和注释，包括检测序列完整性、基因预测、功能注释等。

通常会借助一些基因组注释工具进行。

总的来说，三代基因组组装流程由数据质控、参考基因组预处理、数据比对、组装、连接和填补、纠错、染色体级组装、评估和注释等多个步骤组成，每个步骤都有相应的软件和工具可供选择和使用。

此外，实际的流程和方法可能因具体问题和研究目的的不同而有所差异。

基因测序三代技术介绍基因测序是指对生物体的基因组进行全面、系统的测序分析，以获得个体基因组的完整信息。

在过去的几十年中，随着基因测序技术的不断发展，人们逐渐实现了从第一代到第三代基因测序技术的跨越。

本文将介绍第三代基因测序技术的原理、应用和前景。

第三代基因测序技术是指相对于第一代和第二代技术而言的新一代测序技术。

与前两代技术相比，第三代基因测序技术具有更高的测序速度、更低的成本、更高的准确性和更广泛的应用领域。

第三代技术的代表性方法有单分子测序、纳米孔测序和光学显微镜测序等。

单分子测序是第三代基因测序技术中的一种重要方法。

它利用单个DNA分子作为模板进行测序，通过监测DNA聚合酶在DNA模板上的扩增过程，实现对DNA序列的测定。

这种方法不需要PCR扩增，因此可以避免PCR引入的偏差和错误。

同时，单分子测序技术具有较高的测序速度和准确性，可以在较短的时间内完成大规模基因组的测序，为基因研究提供了强有力的工具。

纳米孔测序是另一种常用的第三代基因测序技术。

它利用具有纳米孔的膜片作为测序平台，通过控制DNA分子通过纳米孔时引起的电流变化来测定DNA序列。

纳米孔测序技术具有高通量、快速、低成本和直接测序等优点。

由于纳米孔测序技术不需要PCR扩增和荧光标记，因此可以避免PCR和荧光引入的偏差和错误，提高了测序的准确性。

光学显微镜测序是第三代基因测序技术的又一重要方法。

它利用荧光染料标记的DNA分子在显微镜下进行成像，通过观察DNA分子的运动轨迹来测定DNA序列。

光学显微镜测序技术具有高分辨率、高准确性和高通量的特点。

通过引入微流控芯片和自动化设备，光学显微镜测序技术可以实现高通量的基因测序，为基因组学研究提供了重要工具。

第三代基因测序技术在基因组学研究、医学诊断和生物工程等领域具有广泛的应用前景。

在基因组学研究方面，第三代测序技术可以帮助科学家更好地理解基因组的结构和功能，揭示基因与疾病之间的关系，为疾病的早期预测和个体化治疗提供依据。

crispr/cas9CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。

CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

原理此系统的工作原理是crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。

而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA )，足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。

作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。

将蛋白与无核酸酶的Cas9( Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。

因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。

应用基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。

但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。

即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。

2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。

基因组编辑技术的原理与方法基因组编辑技术是一种用于改变生物体基因组的新兴技术，它使科学家们能够精确地修改生物体的遗传信息。

这项技术的出现为人们解决了许多生物学问题提供了新的方式，并对医学、农业等领域的发展产生了深远的影响。

本文将介绍基因组编辑技术的原理和方法。

一、基因组编辑技术的原理基因组编辑技术的核心原理是利用特定的工具分子在生物体的基因组上进行精确的编辑，从而改变其遗传信息。

目前最常用的基因组编辑技术包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录活化样蛋白指导的核酸内切酶（TALENs）和CRISPR/Cas9系统。

1. ZFNsZFNs是由锌指结构域与DNA切割蛋白相结合而成的人工核酸酶，可以通过与目标DNA序列特异结合，引发DNA双链断裂。

DNA双链断裂会触发细胞的自我修复机制，从而使得特定基因位点的突变得以引入。

2. TALENsTALENs是由转录活化样蛋白结构域与DNA切割蛋白相结合而成的人工核酸酶，与ZFNs类似，可以通过特异结合目标DNA序列，引发DNA双链断裂，从而实现基因组的编辑。

3. CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是目前应用最广泛的基因组编辑技术。

它利用CRISPR RNA (crRNA)与转录起始结合位点的引导序列组合形成单指导RNA（sgRNA），与Cas9蛋白结合后，可以识别并切割目标DNA序列。

通过Cas9蛋白切割后的DNA修复过程，可以实现特定位点的插入、删除或修改。

二、基因组编辑技术的方法基因组编辑技术依赖于上述提到的工具分子，通过特定的方法来实现基因组的编辑。

1. sgRNA设计与合成针对目标DNA序列，需要设计并合成特异性的sgRNA，以引导Cas9蛋白与目标序列结合。

2. 基因组编辑载体构建将sgRNA和Cas9蛋白的基因序列克隆到适当的载体中，形成基因组编辑载体。

3. 转染与表达将基因组编辑载体转染到目标细胞或生物体中，使其能够表达Cas9蛋白和sgRNA。

·35·1.基因编辑技术的发展历程自从基因概念的提出和DNA 双螺旋结构的发现以来，人类开始从DNA 的角度来研究和改变生物体中的遗传基因。

随后人类发现了作为“基因剪刀”的限制性内切酶和作为“基因针线”的DNA 连接酶，实现了体外对DNA 的切割和拼接；并开发了作为“基因倍增器”的聚合酶链式反应，实现了体外对DNA 的指数倍数扩增。

另一方面DNA 测序技术的进步，使人类对一系列生物的基因组序列都有了接近完全的了解。

因此人类开始尝试通过对生物体基因组上某个特定序列或单个核苷酸进行替换、切除，或插入外源DNA 序列，实现对生物体内特定基因的编辑和相应的功能研究。

1979年研究者通过同源重组的方法实现了对酵母的基因替换和外源基因的正常表达，这是最早报道的基因组编辑案例。

随后研究者利用同源重组的方法对未分化的小鼠胚胎干细胞实现了靶向基因编辑，并获得了2007年诺贝尔生理学和医学奖。

但由于酵母和小鼠体内同源重组发生的频率很低，此时基因编辑的应用仍处于缓慢发展阶段。

20世纪90年代以来，研究者相继开发了锌指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases， ZFNs）技术和转录激活因子样核酸酶技术（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）两代基因编辑技术。

但由于前者适用范围狭窄，而后者实验周期繁琐，因此均未得到广泛的应用。

2.新型基因编辑技术 – CRISPR/Cas 基因编辑技术细菌成簇规律间隔短回文重复CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）/Cas （CRISPR-associated）系统主要在细菌和古生菌中参与抵抗噬菌体和外来遗传物质的入侵，由具有靶向识别作用的crRNA 和具有酶切功能的Cas 蛋白两部分组成。

该系统不受基因序列的限制，几乎在所有细胞、物种中都能实现相应编辑。

CRISPR-Cas9文库技术原理及应用CRISPR-Cas9技术原理CRISPR-Cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。

CRISPR-Cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现，是细菌中抵抗外源病毒的免疫系统。

CRISPR-Cas9系统由两部分组成，一部分是用来识别靶基因组的，长度为20bp左右的sgRNA 序列，另外一部分是存在于CRISPR位点附近的双链DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引导下对靶位点进行切割，最终通过细胞内的非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复，从而形成基因的敲除和插入，最终实现基因的（定向）编辑。

与前两代技术相比，CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑，更重要的是可以同时对多个基因进行编辑，这也为全基因组筛选提供了有效的方法。

目前比较常见的文库类型包括：●CRISPR-Cas9 knock out文库●CRISPR panal文库●CRISPRa/i文库●psgRNA文库CRISPR-Cas9文库建库流程●靶位点确认及sgRNA文库设计●sgRNA文库芯片合成●sgRNA文库构建●QC验证文库质量●sgRNA文库慢病毒包装●感染稳定细胞株●药物筛选实验●细胞表型筛选●NGS测序验证功能基因CRISPR-Cas9文库应用方向1、药物靶点确定与验证CRISPR-Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关数据。

SCIENCE发表文章[1]，研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。

CRISPR／Cas系统CRISPR技术是近年来兴起的继锌指核酸酶和TALENs技术的第三代基因编辑技术，相比于之前的两种人工核酸酶，其具有许多无可替代的优势，并已在多种动植物中应用。

文章就CRISPR系统的发现、分类、作用机制以及其优缺点和对外來应用的展望做综述介绍。

标签：CRISPR机制；结构；脱靶前言基因编辑指对目标基因进行敲除、替换和插入的遗传操作。

最近几年来基因组定点编辑技术包括人工核酸酶即锌指核酸酶、TALENs[1]、CRISPR/Cas系统。

锌指核酸酶是非特异性核酸酶ForkI的切割结合域与有串联锌指结构的锌指蛋白融合成的人工核酸酶，串联锌指结构可特异性的结合DNA序列前者使DNA双链断裂，产生双链断裂。

TALENs可以与DNA特异性的识别。

其也由非特异性核酸酶Fork I和TALE融合而成。

要指出的是，以上二者均会产生双链断裂，而基因组双链断裂时，会发DNA损伤修复机制，包括DNA双链断裂末端直接连接，其常常会造成连接处碱基突变，如果人为的将缺失部位设置在外显子上，可造成移码突变，实现基因敲除；若利用同源重组，人为加入含同源臂外源DNA，经同源重组，将外源同源片段添加到基因组上，即引入了外源基因片段。

CRISPR系统是新兴起来的一种基因编辑技术，它存在于细菌，类似获得性免疫。

并在多种动植物中得到了应用，本文主要从其历史、机理、发展和应用前景作出综述。

1 CRISPR/Cas系统的发现和发展最早日本科研组于1987年发现大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近存在串联间隔重复，之后发其广泛存在于细菌和古细菌基因组[2]，零二年首次将其命名为CRISPR。

零五年，发现CRISPR的间隔序列和细菌内一些染色体外的遗传物质高度同源，因此推测，这可能与细菌抵抗外源基因入侵有关。

零六年，利用生物信息学分析，其可能以类似RNAi的方式行使功能。

零七年，发现细菌可能利用其抵抗噬菌体的入侵，零八年，又发现细菌可以利用其抵抗外源质粒的转化。

三代基因组测序技术原理简介摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。

虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。

测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。

在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。

图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。

以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。

第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。

自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。

研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。

在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。

这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。

值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。

三种基因编辑⼯具的⽐较⽐较三种基因编辑技术⼀、基因编辑的概念基因编辑是指对基因组进⾏定点修饰的⼀项新技术。

利⽤该技术，可以精确地定位到基因组的某⼀位点上，在这位点上剪断靶标 DNA ⽚段并插⼊新的基因⽚段。

此过程既模拟了基因的⾃然突变，⼜修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。

⽬前主要有 3 种基因编辑技术，分别为： a)⼈⼯核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技术；b) 转录激活因⼦样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技术；c) RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas )。

⼆、三种基因编辑技术的介绍基因编辑技术ZFN 技术是第⼀代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋⽩发展起来的。

ZFN 由特异性识别序列的锌指蛋⽩(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。

其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，⽽由FokⅠ构成的切割域能执⾏剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。

于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和⾮同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。

HR 修复有可能会对靶标位点进⾏恢复修饰或者插⼊修饰，⽽ NHEJ 修复极易发⽣插⼊突变或缺失突变。

两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的⽬的。

基因编辑技术TALE（Transcription activator -like effectors）:⼀种源于植物致病菌Xanthomonas sp.的靶向基因操作技术。