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禽流感病毒的噬斑纯化方法实验目的用于禽流感病毒（AIV）的纯化，从混合毒中分离出禽流感病毒，病毒颗粒计数等。
实验原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒。
实验试剂。
实验材料酒精灯、酒精棉、酒精喷壶、打火机、计时器、一次性手套、试管架、镊子、塑料吸管、50ml 离心管及管架、高压灭菌后的1.5ml离心管、1000ul、100ul 枪及枪头、振荡器、PBS液、1×DMEM（无血清）、2×DMEM、2%低熔点琼脂糖、血清/胰酶。
1×DMEM（不含丙酮酸钠）、胰酶购自Life Technologies、小牛血清购自百旺公司。
操作步骤（一）噬斑纯化在6孔培养板中培养鸡胚成纤维细胞（CEF），使形成单层，细胞培养至80%左右。
用1×DMEM（无血清）对病毒作10倍倍比稀释，方法如下：（1）准备7个灭菌1.5 mL离心管，每管中加入900 uL 1×DMEM（无血清），吸待测的病毒液100 uL加入到第一管中振荡混匀后，换枪头，再吸100 uL加入到第二管中，振荡混匀后，换枪头，吸100 uL加入第三管，依次向下稀释，分别至 10-5、10-6、10-7（或10-8）。
注：若为噬斑传代，则在每孔加入20 uL原代噬斑病毒液，再加980 uL无血清的1×DMEM。
（2）取出培养好的细胞，弃去旧的培养液，用PBS洗一遍；（3）接种病毒液，从10-3到 10-7每个稀释度一孔，每孔 100ul 病毒稀释液，按从高稀释度向低稀释度的顺序加，最后一孔加100 uL 1×DMEM （无血清）作为对照；（4）摇匀后置37℃生化培养箱吸附1 h（可延长至2 h）；（5）吸附1 h后弃去病毒液，并用枪头吸干净残留的病毒液，用PBS洗一遍；（6）配2%的低熔点琼脂糖高压灭菌后，在微波炉内加热熔化，取出后和含2% FBS 的2×DMEM（若为弱毒株，则用含25 uL胰酶/板的2×DMEM，不能添加血清）等量混匀，常温下，待冷却到约30℃左右时，迅速将混合液沿侧壁滴加在细胞上，每孔2 mL；（7）凝固后用胶布封好，倒置放在37℃培养箱培养；注：待凝胶完全凝固后再放入生化培养箱。
病毒蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。
经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到1～2mm，大至3～4mm，这就是蚀斑。
某些病毒在一般单层细胞培养内不形成CPE，但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。
因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。
混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。
为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。
这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。
中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。
这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。
在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。
某些病毒，例如新城疫的某些变异株和SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。
从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。
反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。
但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。
根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。
因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有108个PFU……等等。
病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10×稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。
病毒蚀斑技术1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法。
(一) 原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。
但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。
对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。
固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。
小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。
为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。
因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。
病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。
例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103 ，则病毒原液的滴度为：58÷0.2×2.5×103 ＝7.25×105 (PFU/ml)(二) 技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。
1.病毒生物学纯化(Virus biological purification)在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。
这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。
病毒蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。
经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到 1 ~2mrp大至3~4mm这就是蚀斑。
某些病毒在一般单层细胞培养内不形成 CPE但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。
因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。
混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。
为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。
这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。
中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。
这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。
在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。
某些病毒，例如新城疫的某些变异株和 SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。
从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。
反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。
但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活，而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。
根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。
因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有10 8个PFU••…等等。
病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10 X稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。
流感病毒噬斑分析I目的：噬斑分析可以用96孔板来测定病毒滴度II健康和安全：在做流感病毒实验时应遵守这些健康和安全的要求。
1.穿上实验服、戴上手套和安全眼镜2.所有操作步骤都要在生物安全柜中进行3.将固体垃圾放到生物危害垃圾袋中，进行高压灭菌处理4.将液态垃圾用液体消毒剂处理5.所有的操作台面和设备在使用前和使用后都用70%的乙醇擦拭消毒6.咼毒性的流感病毒应在P3实验室中进行7.根据建立的进出程序，穿上恰当的个人保护装备。
8.严格遵守HPAI高致病性禽流感安全程序III材料:1.MDCK细胞培养基2.感染培养基（加了BSA，不能加FBS，因为会感扰流感病毒的复制，加入乙酰化的胰酶，切割流感病毒从而促进其感染）3. 1% 或2% Avicel-DMEM (1L)4.0VERLAY 2和3的混合培养基5.固定液4%的福尔马林（PBS）6.washing buffer (5%吐温PBS)7.封闭缓冲液Blocking Buffer (0.5% Tween 20, 1%BSA in PBS)8.Quencher (0.5% Triton X100, 20mM Glycine in PBS) 可以打开细胞9.——抗1301 An ti-l nflue nza Nucleoca psid po lycl onal goat an tibody from Virostat10.二抗Anti-Goat-HRP from KPL11.底物Subsrtate: True Blue from KPL12.Cell P lates ( 96 well p late) Costar cell treated p latesIV方法1.将细胞铺在96孔板中i.将MDCK细胞铺在96孔板中，每个孔应含有100微升培养液，6x104个细胞，使用MDCK细胞培养基。
ii.在CO2培养箱中培养24h或者知道形成完整的单细胞层。
2.病毒的稀释及吸附i.将加入抗冻药物处理的病毒浆液至于37度水浴中解冻ii.在96孔板中进行10倍的系列稀释a.在96孔板中加入225 uL的感染培养基b.向第一个孔中加入25uL的样品并吹打混匀C.从每一个孔中转移25uL到下一个孔中进行系列的稀释iii.将培养的细胞取出并将培养基倒掉iv.用100uL的感染培养基洗细胞两次，将残留培养基倒掉V.用排枪直接从稀释好的病毒稀释液中转移50uL到细胞板vi.将细胞在培养箱中培养1h,每隔20分钟轻微震荡3.覆盖i.吸取lOOuL的2%的Avicell去覆盖细胞ii.在培养箱中培养24h-26h4.固定细胞i.从孔中吸走覆盖物，并用lOOul的PBS洗两遍，倒掉残余培养基ii.向每个孔中加入lOOul的固定液，在室温下孵育10分钟iii.移走固定物并如上所述洗涤iv.加入lOOul的猝灭培养基，室温下孵育1O分钟V.去掉猝灭培养基，并用1x的washing buffer5Oul清洗每个vi.移走washing buffer，并向每个孔中加入50ul的blockingbuffervii.在培养箱中培养30min5.噬斑染色i.移去blocking buffer并用50ul的一抗1:1000孵育，室温下40~60minii.移走一抗用washing buffer洗，加入50ul1:1000稀释的二抗，室温下孵育40~60miniii.移去二抗用washing buffer洗，加入50ul的底物。
病毒蚀斑技术介绍1952年，把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术（）成为许多病毒的滴定和研究方法。
1、原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。
但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。
对于细胞结合性病毒，如，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。
固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。
小蚀斑需用显微镜观察，1-10的大蚀斑可用肉眼计数。
为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。
因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。
病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位（）来表示。
例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2，病毒的稀释度为2.5%26;103，则病毒原液的滴度为：58%26;0.2%26;2.5%26;103＝7.25%26;105（）2、技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆（无性繁殖纯系）、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。
（1）病毒生物学纯化（）在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。
这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。
这时, 有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒, 亦称%26;克隆株%26;。
克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。
病毒空斑纯化病毒蚀斑如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。
在细胞培养中做蚀斑是一种较精确的测定病毒感染的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1h，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。
但由于琼脂的限制只能感染临近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化步着色，形成不染色区域。
凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。
蚀斑技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常敏感的方法。
此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。
若目的是要提高病毒能力，应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数不得超过20-40个。
试验时，培养瓶应翻转培养，以防止水滴在琼脂面流动，以免各个蚀斑交叉融合，中性红应在蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。
对那些生长缓慢的病毒蚀斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层1-2次。
蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗2-3次，而后用去离子水冲洗1-2次后，用Hanks液配制成3%浓度，煮沸1h 除菌备用。
有人在试验时补加25mmol的MgCl2或CaCl2及1mmol的半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。
而MgCl2的加强作用最强。
流感病毒纯化（蔗糖梯度法）概论转头选择密度梯度选用一、概论在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。
密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。
第18章病毒分离培养的细胞培养法一、细胞培养用于病毒研究的优点：细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛，除用作病毒的病原分离外，还可研究病毒的繁殖过程及其细胞的敏感性和传染性（细胞的病理变化及包涵体的形成）。
观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性，可用于病毒的分离鉴定，抗原的制备及疫苗，干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。
近年来，可用于繁殖病毒载体以用于基因治疗。
应用细胞培养来研究病毒有下列优点：1、没有隐性感染：动物可能带有某些病毒的隐性感染，往往有干扰作用和假阳性出现。
细胞培养一方面是来源于动物部分组织，减少了隐性感染的机会，另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。
2、没有免疫力：动物经隐性感染获得免疫力，对接种病毒会发生抵抗，但由于后天免疫一般不表现在细胞抵抗力的增加，因此离体细胞无免疫力，利于病毒生长。
3、容易选择易感细胞：细胞来源方便，可供作病毒敏感性的筛选，可以从中选择最敏感的细胞以满足实验要求，同时还利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒一细胞的相互关系。
4、接种量大：动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，细胞不仅可以大量生产，而且还可较久地持续培养，便于病毒生长，特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。
5、培养条件易于控制：由于细胞培养可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分，因此可采用大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。
6、提高了疫苗的产量和质量：细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求，而且异性蛋白少，引起变态反应机会少。
疫苗中污染菌少或无，可随制随用，成本低，来源方便，便于贮存，且效力均匀，易标准化。
7、加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速早出结果，但应用对该病毒敏感的细胞。
二、用细胞培养分离病毒(一)接种标本的处理：1、粪便标本：用于分离肠道病毒之粪便标本放入装玻璃珠40ml沉淀管内，大约每2克粪便用15ml Hanks液稀释(其余粪便于-20℃保存备用)，用橡皮塞紧后剧烈振摇，使粪便乳化，经2500r/min沉淀15分钟后，按将上清用无菌八层纱布过滤，于4℃以10000r/min沉淀1小时再取其上清，1.8ml加入0.2ml抗菌素液进行处理(浓度为25000u/ml的双抗及250mg/L二性霉素B)剩下的悬液保存于-20℃备用。
病毒蚀斑技术1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法。
(一) 原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。
但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。
对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。
固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。
小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。
为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。
因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。
病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。
例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103 ，则病毒原液的滴度为：58÷0.2×2.5×103 ＝7.25×105 (PFU/ml)(二) 技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。
1.病毒生物学纯化 (Virus biological purification) 在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。
这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。
这时, 有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒, 亦称“克隆株”。
克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。
为了更有效地进行纯化, 必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。
同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm 都是健康细胞的蚀斑。
挑取后的病毒应传两代或两代以上。
一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。
因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。
2.蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test) 蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少 50％的血清稀释度作为其中的效价。
试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作, 接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37 ℃二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。
其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。
由于本试验的操作比较繁锁，目前在国内极少应用,国际上也没有把它作为一种各国都接受的诊断方法，仅在OIE国际动物卫生法典(第六版)中列为对裂谷热的规定诊断方法之一。
(三) 操作实例1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或纯化(1) 于55mm直径的灭菌塑料培养皿中培养绿猴肾细胞(Vero)，使形成单层。
细胞培养时间约3－4天，接种量约为2 000 000/ml个细胞。
选取单层细胞全部覆盖，不留有空洞的培养皿用作试验。
(2) 用细胞培养液对AKV病毒作10倍倍比稀释至10-7并保存于4℃。
(3) 每个稀释度的病毒液接种3个平皿。
(4) 接种前弃去细胞培养液,用5mlPBS或细胞培养液冲洗单层细胞,然后弃去冲洗液。
(5) 每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附一小时，每15分钟摇动一次，以便使病毒均匀分布。
(6) 按第4步骤冲洗未被吸附的病毒。
(7) 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂(预热)中，每个平皿加入7ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养约2天，平皿需倒置。
( 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2％琼脂(预热)中，每个平皿加入5ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱中培养至次日。
(9) 结果计算求每组三个培养皿的蚀斑平均数，组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律 (即若10-2组平均100个蚀斑，则10-3组平均应在10个左右)，否则应考虑重新试验。
以平均蚀斑数乘以病毒稀释的倍数再乘以5，即为每毫升病毒原液的蚀斑数。
(10) 选取特征性的若干蚀斑，分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒，然后分别接种到预先制备的单层细胞培养瓶中进行增殖或传代。
(11) 本试验采用BHK21细胞，可应用于牛流行热病毒(BEFV)。
2.蓝舌病病毒(BTV)血清型鉴定试验(纸片法)(1) 抗体纸片制备①取已知各种血清型毒株以1×107蚀斑形成单位接种绵羊, 接种后3-4周采血分离血清。
②制备直径0.5mm的中性滤纸片，121℃15分种灭菌后保存于干燥环境。
③取上述滤纸片浸入不同血清型的免疫血清后真空冻干, 保存于4℃冰箱备用，使用前以灭菌水湿润。
(2) 病毒接种①用直径6cm的塑料培养皿培养BHK21或Vero细胞使成单层。
②以103PFU/0.2ml被检蓝舌病病毒接种于细胞上, 吸附1h。
③洗去未被吸附的病毒，弃去洗液。
(3) 覆盖琼脂①取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂，每个平皿加入7ml，置平台冷却凝固。
②在琼脂面上按梅花形图案放上不同型的血清滤纸片, 并做好记号。
③把平皿放置在37℃二氧化碳培养箱培养2天。
④真空吸出平皿中的滤纸片。
⑤取2倍浓缩的细胞营养液加入等量的2%琼脂，每个平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培养箱培养2-3天, 待明显蚀斑抑制环出现。
(4) 结果判定出现明显抑制蚀斑形成(即滤纸片位置下仍保持活细胞被染色)的免疫血清即为该被检病毒的血清型。
注：本试验方法同时可应用于鹿流行性出血病病毒(EHDV) 与蓝舌病病毒(BTV)的鉴别。
3.新城疫病病毒(NDV)分离(1) 取疑似患病禽的组织用细胞培养液匀浆,离心沉淀后取上清液。
(2) 用16孔微量培养板制备鸡成纤维原代细胞。
(3) 细胞长成单层后吸去培养液，向每孔滴加0.1ml被检病料, 置37℃吸附2小时后弃残液。
(4) 制备1％琼脂的BME，置40－50℃水浴待用。
(5) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成覆盖层。
(6) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。
(7) 制备含0.002％中性红的1%琼脂的BME，置40－50℃水浴待用。
( 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成第二覆盖层。
(9) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。
(10) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。
注：本试验方法在样品中病毒含量少的情况下比单纯用细胞培养分离要敏感。
4.试验用各种成份的配制(1) 细胞营养液(用于稀释病毒)10倍199保存液 4ml牛血清 0.8ml3%碳酸氢钠 2.4ml 双蒸水 32.8ml40ml(2) 两倍浓缩细胞营养液(配制首层琼脂用)10倍199保存液 20ml牛血清 4ml3％碳酸氢钠 12ml1％二乙氨基乙基(DEAE) 10ml(可选择)双蒸水 54ml100ml(置40－45℃水浴备用)(3) 1.5％琼脂精制琼脂糖 1.5g双蒸水加至100ml(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。
)(4) 含中性红两倍浓缩细胞营养液(配制第二层琼脂用)10倍199保存液 20ml牛血清 10ml3％碳酸氢钠 12ml0.5％中性红 6ml双蒸水 52ml100ml(置40－45℃水浴备用)说明：在第二层琼脂中，中性红的最终浓度应为1:5000－1:10000。
(5) 2％琼脂精制琼脂糖 2g双蒸水加至100ml(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。
)（6）结晶紫溶液配置：Crystal violet stain: stock=1 g. crystal violet99ml 20% EtOHworking soluion= 20 ml stock40 ml 95% EtOH150 ml distilled water---------------------------------------------------------------------------Crystal violet-Formaldehyde stain: 100 ml10 ml 37-40% formalin90 ml dH2O0.4 g NaH2PO4 (monobasic)0.65 g Na2HPO4 (dibasic)0.1 g crystal violet计数：Pfu/ml (of original stock) = 1/dilution factor x number of plaques x 1/(ml of inoculum/plate)----------------------------------EV71 Plaque assay.RD cells (1 × 105) in 200 μl RPMI 1640 were seeded in each well of a 24-well plate. Serial dilutions of the different viral suspensions were added to the wells for 18 h of incubation. After absorption for 1 h at 37°C, the virus supernatant was replaced with DMEM containing 2% FBS and 0.8% methylcellulose for 72 h. After the removal of the medium and a 15-min fixation step with 4% formalin in PBS, the plaques were read by being stained with 1% crystal violet. Counts were expressed as PFU per milliliter.我也用Viscous medium做病毒空斑实验，甲基纤维素覆盖培养液具体配方如下，供参考：In a glass bottle, combine 8.8 g methyl cellulose (4000 centipoise ,Sigma) with 320 ml distilled water. Stir with a large magnetic stirrer. Autoclave 30 min at 121 ℃, leaving the magnetic stirrer inside the bottle. Remove from autoclave while still hot and stir again until methyl cellulose has completely dissolved (usually a few hours).Add 40 ml 10× MEM or 10× DMEM, 40 ml FBS, 40,000 U penicillin, 40 mgstreptomycin, and 4 ml of 1 M HEPES. Add L-glutamine and sodium bicarbonate according to the medium supplier"s recommendations. Store up to 6 months at -20℃.配置此Viscous medium 确实挺麻烦，所用试剂多，甲基纤维素是难溶解，不过我按上述方法大概两三天内也溶好了。
