变性条件下的蛋白凝胶电泳蛋白预制SDS-PAGE凝胶试剂盒

sds-page凝胶电泳原理SDS-凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析和分离技术。

它基于蛋白质在电场中的迁移速率与分子质量之间的关系，通过将蛋白质样品加入SDS变性和还原缓冲液，并进行蛋白质的电泳分离，可以实现蛋白质分子量的估计和蛋白质组分的分离。

以下将详细介绍SDS-凝胶电泳的原理。

一、样品处理：在进行SDS-凝胶电泳之前，需要对样品进行处理，包括蛋白质的变性和还原。

这样做的目的是将蛋白质分子展开成线性构象，使各种蛋白质以相似的形式进入凝胶，并消除了蛋白质修饰对迁移速率的影响。

1.变性：加入SDS变性缓冲液。

SDS是一种带负电荷的表面活性剂，可以与蛋白质相互作用，让蛋白质线性展开，并赋予蛋白质负电荷。

在变性缓冲液中通常还会包含甘油和十二烷基硫酸钠，以提高蛋白质的溶解度。

2. 还原：加入还原剂。

通常使用二巯基乙醇（2-mercaptoethanol）或二巯基丙烷（Dithiothreitol, DTT）等还原剂，以破坏蛋白质的二硫键，消除蛋白质中的多肽链的二级结构。

二、凝胶制备：SDS-的凝胶通常由两种不同浓度的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）单体制备而成，其中较稀的为分离凝胶，较浓的为聚合凝胶。

聚丙烯酰胺是由甲基丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂（常用的是二甲基丙烯酰胺）共聚合而成的。

1. 分离凝胶（stacking gel）：通常为4-15%（w/v）的聚丙烯酰胺。

分离凝胶中加入的缓冲液pH稍微较低，以产生较高的电场强度，使蛋白质迅速进入聚合凝胶。

2. 聚合凝胶（resolving gel）：通常为8-20%（w/v）的聚丙烯酰胺。

聚合凝胶中加入的缓冲液pH较高，以产生较低的电场强度，使蛋白质在其中进行分离。

三、电泳操作：1.样品加载：将处理后的蛋白质样品加载到凝胶孔上。

第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。

本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。

1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。

2.试剂（1）水。

（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。

（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。

（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。

（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。

（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。

建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。

（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。

（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。

（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。

实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质【实验⽬的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握⽤此法分离蛋⽩质组分的操作⽅法。

【实验原理】在⽣物化学、分⼦⽣物学和基因（遗传）⼯程实验中，常常要进⾏蛋⽩质和核酸的分离⼯作。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为⽀持介质进⾏蛋⽩质或核酸分离的⼀种电泳⽅法。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作⽤下聚合交联⽽成的三维⽹状结构的凝胶。

通过改变单体浓度与交联剂的⽐例，可以得到不同孔径的凝胶，⽤于分离分⼦量⼤⼩不同的物质。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采⽤过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基⼄⼆胺（简称TEMED）。

通常控制这⼆种溶液的⽤量，使聚合在1⼩时内完成。

（2）光聚合：通常⽤核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加⼊TEMED 加速反应。

聚丙烯酰胺凝电泳常分为⼆⼤类：第⼀类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第⼆类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。

⼀般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分⼦筛效应（凝胶的⽹状结构及电泳物的⼤⼩形状不同所致）。

③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。

因此，样品分离效果好，分辨率⾼。

SDS即⼗⼆烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离⼦表⾯活性剂，它能以⼀定⽐例和蛋⽩质结合，形成⼀种SDS-蛋⽩质复合物。

这时，蛋⽩质即带有⼤量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从⽽使天然蛋⽩质分⼦间的电荷差别降低仍⾄消除。

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒产品简介：聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE），其作用原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。

它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开,主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。

Leagene SDS-PAGE凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE凝胶，也可用于配制非变性(native)PAGE凝胶，30T试剂盒一般可以配制30～40块，60T试剂盒一般可以配制60～80块，具体配制的量应根据器具大小决定。

产品组成：主要成分：主要由30% Acr-Bis(29:1)、1.5M Tris-HCl(pH8.8)、10% SDS、AP、TEMED、1M Tris-HCl(pH6.8)组成。

自备材料：1、制胶器具2、蒸馏水3、微量移液器操作步骤（仅供参考）：1、根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(下层胶)：不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围：SDS-PAGE分离胶浓度 最佳分离范围6%胶 50-150kD8%胶 30-90kD10%胶 20-80kD12%胶 12-60kD15%胶 10-40kD成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（ml）6%胶 5 10 15 20 25 30 40 50 蒸馏水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%Acr-Bis(29:1) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8 10.0 1.5M Tris,pH8.8 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（ml）8%胶 5 10 15 20 25 30 40 50 蒸馏水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2 30%Acr-Bis(29:1) 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.3 1.5M Tris,pH8.8 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（ml）10%胶 5 10 15 20 25 30 40 50 蒸馏水 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%Acr-Bis(29:1) 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10 13.3 16.7 1.5M Tris,pH8.8 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（ml）15%胶 5 10 15 20 25 30 40 50蒸馏水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5 30%Acr-Bis(29:1) 2.5 5 7.5 10 12.5 15.0 20.0 25.0 1.5M Tris,pH8.8 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。

原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。

而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。

这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。

当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。

电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。

蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。

电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。

1.溶液配制1.1.30%（W/V）丙烯酰胺+0.8%双丙烯酰胺用天平称取15g丙烯酰胺、0.4g双丙烯酰胺，加入50ml 去离子水溶解混匀。