Tricorn+蛋白水解酶

摘要腈水解酶作为一种重要的工业酶能够直接将有毒腈化物转化为相应的无毒酸和氨，应用广泛。

腈水解酶介导的生物催化制备某些羧酸化合物已经代替了传统的化学合成法，其反应条件温和，环境友好，选择性高等优点，引起研究者密切关注，因此筛选获得更多具有优良性质的腈水解酶具有很大的意义。

近年，枯草杆菌孢子展示技术作为一种新型的蛋白固定化方式引起广泛关注，由于枯草杆菌芽孢具有高稳定性和抗逆性，使得芽孢便成为了一个优秀的固定化载体在其表面展示外源蛋白。

目前有关利用芽孢展示技术进行耐逆化工酶酶的固定化报道较少，本文首次克隆表达鉴定了来自Thermotoga maritima MSB8的腈水解酶并展示在芽孢表面，然后对连接孢子表面衣壳蛋白与腈水解酶的连接肽进行了初步优化。

本研究中，首次从Thermotoga maritima MSB8基因组扩增到腈水解酶基因，并连接到原核表达载体PET-28a上，构建表达质粒PET-28a-nit，然后转化入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定，分子量在30kDa 左右，与预测一致。

对Thermotoga maritima MSB8腈水解酶的酶学性质进行了研究，发现以3-氰基吡啶作为反应底物时，该腈水解酶的最适反应温度和pH分别为45℃和7.5。

热耐受性试验显示在75℃环境下处理0.5h能够保留将近50% 的酶活，酸碱耐受性试验显示该腈水解酶对碱性反应条件的比较敏感。

Mn2+，Zn2+和Cu2+能显著抑制酶活，Mg2+和Fe2+.能够稍微促进酶活，其它的一些金属离子和金属离子螯合剂EDTA对酶活没有显著影响。

还原剂二硫苏糖醇DTT能够一定程度促进酶活，其它一些还原剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂和有机溶剂都对该腈水解酶活性产生了不同程度的抑制作用。

该腈水解酶的动力学常数Vm和Km值分别为3.12 μmol/min/mg和7.63mM，催化常数为kcat/Km为0.44 /mM/s，底物谱研究表明该腈水解酶对脂肪族双腈具有明显的特异性。

YR-ACPro酸性蛋白酶◇产品概述：蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。

由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。

包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。

蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。

蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。

本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌（Aspergillus）深层发酵而成。

它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。

◇工作机理：蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。

在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。

酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。

◇产品特性：本产品能够产生最大活性的pH范围是2.5-6.0，最适pH值是3.5；温度范围是10-50℃（50-122°F），最适温度是50℃。

◇产品规格：产品为固体：酶活力为 10，000 U/g）酶活力单位定义: 温度为40℃，pH3.0条件下，1分钟内释放1ug酪氨酸所需要的酶量。

◇使用说明：用作饲料添加剂时，本产品的添加量为5-10U/g。

在酿造业使用时，本产品的添加比例为5U/g。

◇产品包装及储存：本产品的包装规格为25kg/箱。

也可根据客户需求提供大小不等的包装。

存放于阴凉干燥处，避免阳光直射。

本产品在低温下（25℃以下，但不能冷冻）贮存时，其活性可保持相当长一段时间。

◇使用注意事项：本产品无毒、可生物降解。

避免儿童接触及不必要接触，长期接触一些产品（如本产品）中的蛋白质会使有的人对该产品过敏。

人参皂苷Rb3糖基水解酶的纯化及其反应特性作者：张睿哲徐龙权宋建国鱼红闪来源：《广西植物》2020年第05期摘要：人参皂苷Rb3是三七茎叶皂苷的主要成分。

为了充分利用廉价的三七茎叶皂苷，该研究以微生物Aspergillus sp. P90r菌为对象，综合运用生物转化的方法，经过提取、分离纯化和酶活力测定等步骤，最终以确定酶反应途径的方式得到了所产的特异性人参皂苷Rb3糖基水解酶的相关性质和动力学等反应特性。

结果表明：该酶比Absidia sp. GRB3-X8r菌产酶活力高15%～25%，SDS-PAGE电泳结果测得分子量约为65.6 ku，纯化后酶蛋白的含量为0.237mg·mL-1，蛋白比活力可达到169 U·mg-1，纯化倍数为13.70，回收率为9.39%。

人参皂苷Rb3糖基水解酶在pH=5.0的偏酸性环境下酶活力很高，最适反应条件：pH=3.0～5.0，温度45 ℃，其中在pH=4.0～6.0范围内相对稳定。

该酶在20 min时进入混合级反应，酶反应米氏常数Km值为8.77 mmol·L-1，Vmax为57.44 mmol·L-1·h-1，在60 min时反应速度达到最大，Vmax趋于稳定，为66.63 mmol·L-1·h-1。

通过对酶的催化特性研究表明，该酶先水解Rb3的20-O-木糖基，其次水解3-O-葡萄糖基，最终催化反应产物中有F2和C-K生成。

综上结果，微生物Aspergillus sp. P90r菌酶具有能水解人参皂苷Rb3木糖基和葡萄糖基的特异性。

关键词：人参皂苷Rb3，人参皂苷Rb3糖基水解酶，酶学性质，酶分离纯化，酶促反应动力学中图分类号： Q814.1文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2020）05-0706-09Purification and reaction characteristics of hydrolyzed ginsenoside Rb3-glycosylaseZHANG Ruizhe， XU Longquan， SONG Jianguo， YU Hongshan*（ College of Biology Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034，Liaoning， China ）Abstract： Hydrolyzed ginsenoside Rb3 is the main component of Panax notoginseng stem and leaf saponins. In order to make full use of cheap P. notoginseng stem and leaf saponins， the microorganism Aspergillus sp. P90r was studied， and we used the biotransformation methods comprehensively. Related properties， kinetics and other reaction characteristics of the specific ginsenoside Rb3-glycosylase were produced by determining the way of enzymatic reaction through extraction， separation， purification， enzyme activity determination and other steps. The results were as follows： This enzyme activity was 15%-25% higher than the enzyme by Absidia sp. GRB3-X8r. The result of the molecular weight of enzyme protein was 65.6 ku by SDS-PAGE electrophoresis. The content of enzyme protein was 0.237 mg·mL-1 after purification， the specific activity of the protein was attainable as 169 U·mg-1， the purification factor was 13.70 and the recovery rate was 9.39%. And the enzyme activity of ginsenoside Rb3-glycosylase was higher in the pH 5.0 of acidic environment. The enzyme was suitable condition in the range of pH 3.0-5.0， in the temperature of45 ℃， and it was relative stable in the range of pH 4.0-6.0. The enzyme entered the mixed-order reaction at 20 min， and the results of the enzyme reaction kinetics showed that the Km value was 8.77 mmol·L-1 and Vmax was 57.44 mmol·L-1·h-1. The reaction rate reached the maximum at 60 min， and the speed tended to be stable， and Vmax was 66.63 mmol·L-1·h-1. The results oncatalytic properties of enzymes showed that the enzyme firstly hydrolyzes 20-O-xylose of ginsenoside Rb3， secondly hydrolyzes 3-O-glucosyl， eventually which the catalytic reaction products include the formed substance of F2 and C-K. In summary， the microbial Aspergillus sp. P90r enzyme has the specificity to hydrolyzed ginsenoside Rb3-xylose and Rb3-glucose.Key words： hydrolyzed ginsenoside Rb3， hydrolyzed ginsenoside Rb3-glycosylase， enzyme properties， isolation and purification， enzyme kinetics我国高产量的人参属植物是人参（Panax ginseng）、三七（P. notoginseng）、西洋参（P. quinguefolus）等，其人参属植物中化学成分比较复杂，主要的有效活性物质是人参皂苷（宋亚会和姜晓军，2009）。

•在22个快速降解的蛋白质中有20个是含有PEST序列。

•在35个慢速降解的蛋白质中有32个不含PEST序列。

分泌到细胞外蛋白质的寿命•分泌到细胞外的蛋白质，它们的寿命都比较长，如胶原蛋白、眼睛中的晶体蛋白。

•这些蛋白质不进行代谢，它们的变化具有累积效应，超过一定限度就产生疾病。

•晶体蛋白中赖氨酸残基的侧链氨基和肽链N端氨基都有可能被葡萄糖修饰，发生非酶促的糖化，严重时会导致白内障。

•糖尿病患者因为长期血糖升高，晶体蛋白的糖化进程加快，未老年化的糖尿病患者患有白内障，这是糖尿病并发症。

影响复合蛋白质寿命的其他组分•外周血液中多数糖蛋白的糖链是以唾液酸为非还原端的糖残基，在血液循环中的半衰期较长。

•糖蛋白的糖链最外侧唾液酸被去除或丢失，暴露出次末端的半乳糖，半衰期明显降低，被肝脏快速清除。

肝脏实质细胞表面存在识别并专一结合半乳糖的去唾液酸糖蛋白受体。

•将次末端的半乳糖切除，相应糖蛋白在哺乳动物血液中的半衰期又恢复到原有的水平。

糖链结构与细胞寿命•糖蛋白中糖链的结构不仅与糖蛋白的寿命，而且与一些细胞的寿命有关。

•红细胞表面存在多种糖蛋白，这些糖蛋白的唾液酸被除去后，被肝脏实质细胞清除，同时也将红细胞从循环的血液中清除。

•糖蛋白和红细胞上的唾液酸可作为其―年龄‖指标，带有唾液酸的糖蛋白和红细胞则是―年轻‖的分子和细胞，一旦丢失了唾液酸，则糖蛋白和红细胞进人―老年‖期，应该被代谢。

蛋白质降解的场所•溶酶体•细胞质中的蛋白酶和其他体系•其他细胞器中蛋白质的降解蛋白质降解的场所•细胞外主要是消化道，许多体液中也有蛋白酶，但是多数是起调节作用的限制性肽酶。

•细胞内蛋白质彻底降解的场所：溶酶体、线粒体和细胞质（蛋白酶体、依赖ATP的蛋白酶和依赖钙离子而不依赖A TP的蛋白酶）。

•消化道和溶酶体中存在着多种不同专一性的肽酶，而蛋白酶体则是相对的比较专一的蛋白质降解场所。

溶酶体是蛋白质降解的重要场所•细胞外的蛋白质（如血浆蛋白质、蛋白质类激素以及细胞质膜上的受体蛋白质），几乎都是通过胞吞方式进入溶酶体，在溶酶体中彻底降解。

蛋白水解酶蛋白水解酶是一类广泛存在于生物界中的酶类，其具有将蛋白质分解为小分子多肽甚至氨基酸的能力。

蛋白水解酶广泛应用于食品、医药、生物工程等领域。

本文将介绍蛋白水解酶的定义、分类、应用以及未来的发展方向。

蛋白水解酶是一类酶，其作用是将蛋白质分解为小肽段或氨基酸。

蛋白水解酶的主要作用是在生物体内或外部降解蛋白质结构，使其转变为可以被生物体吸收和利用的形式。

蛋白水解酶可以通过加水分子裂解肽键，以产生小分子多肽和氨基酸。

根据催化产物的不同，蛋白水解酶可以分为胶原酶、淀粉酶、蛋白酶等多个类别。

胶原酶主要作用于胶原蛋白，将其分解为胶原多肽；淀粉酶主要作用于淀粉，将其分解为糖；蛋白酶则将蛋白质分解为小肽段和氨基酸。

具体而言，蛋白水解酶可以分为蛋白内切酶和蛋白裂解酶两类。

蛋白水解酶在食品行业中具有重要应用。

在食品的加工过程中，蛋白水解酶可以降解食品原料中的蛋白质，从而增加食品的口感和可溶性。

例如，在啤酒生产过程中，麦汁中的蛋白质会被水解酶分解为小肽段和氨基酸，从而改善啤酒的透明度和可口度。

此外，蛋白水解酶还可以用于制作乳制品、酱油、豆制品等食品，以提高其风味和口感。

在医药领域，蛋白水解酶也有广泛的应用。

蛋白水解酶可以用于治疗消化系统疾病，如胃溃疡、胃炎等。

此外，蛋白水解酶还可以用于治疗一些炎症性疾病、创伤和手术后的愈合等。

近年来，随着人们对口服胶原蛋白的需求增加，蛋白水解酶也被广泛应用于口服胶原蛋白的生产中，以提高其生物利用率。

除了食品和医药领域，蛋白水解酶还可以用于生物工程。

在生物反应器中，蛋白水解酶可以作为工具酶，用于转化大分子蛋白质为小肽段或氨基酸，从而提高生物反应的效率。

此外，蛋白水解酶还可以用于生物降解塑料、清洁污水以及处理农业废弃物等方面。

尽管蛋白水解酶在多个领域中有广泛应用，但目前仍然存在一些挑战和发展方向。

首先，蛋白水解酶的高效提取和纯化方法仍然需要改进。

其次，如何改善蛋白水解酶的催化活性和稳定性也是一个重要的研究方向。