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乳铁蛋白与牛初乳乳铁蛋白极其广阔的市场前景，吸引了多家国际原料供应商投入巨资进行大规模的商业化生产，而这其中一、安全保障：1、做得最好的是荷兰的DMV公司，为全球最大的乳铁蛋白供应商，欧洲绝大部分奶粉所采用的乳铁蛋白即由其供应。
2、其所生产的乳铁蛋白纯度高达95%，是目前全球唯一一个通过美国FDA的GRAS认证的乳铁蛋白原料，具有极高的安全性。
3、因此荷兰DMV是美国FDA大量乳铁蛋白临床试验的乳铁蛋白原料供应商。
4、我国的江苏四环生物股份有限公司与荷兰DMV合作推出了全国首款且唯一具有国家食品药品监督管理局保健食品认证的乳铁蛋白产品5、2011年6月1日卫生部颁布新的食品安全法规，将乳铁蛋白从食品添加剂升为营养强化剂，强化婴幼儿营养。
6、上市制药企业生产，质量保证四环医药：江苏四环生物股份有限公司，是在深圳证券交易所上市的大型制药企业，注册资本10个亿，股票代码000518.7、国家认证证书四、??? ◆抗微生物/抗病毒活性；◆参与铁的代谢；◆消炎作用；◆抗氧化功能1、抗微生物活性??? 有报道表明乳铁蛋白可以抑制多种细菌、真菌、寄生虫和病毒生长发育，具有较广谱的抗病毒性能，包括脊髓灰质炎病毒，单纯疱疹病毒，丙型肝炎病毒，艾滋病毒，人巨细胞病毒，流感病毒，呼吸道合胞病毒，轮状病毒及猫杯状病毒。
??? 发生的机理有几种。
乳铁蛋白具有结合铁离子的能力，而铁离子为许多微生物生长所必需，这样，乳铁蛋白可以通过结合铁离子使其周围的铁离子浓度大大降低，从而抑制了微生物的生长。
??? 不仅如此，乳铁蛋白还可以形成抗微生物的肽，这些肽能破坏或者穿过细菌。
Saito等人研究发现，牛乳铁蛋白在酸性条件下加热产生的水解物（肽）具有抗菌活性，这一活性的最佳水解度约为10%（pH2.0，在120℃加热15分钟水解）。
与原乳铁蛋白相比，这些水解物没有结合铁的能力，且在富含铁的基质中也能很好地保持活性，其抗菌活性与铁的螯合无关，因此其抗菌机理不同于乳铁蛋白。
乳铁蛋白的分离工艺研究牛初乳是指奶牛产犊后3d内所分泌的乳汁。
科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为富集的生物资源之一。
包括重要的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（IgG）、乳铁蛋白（LF）及胰岛素生长因子（IGF）等，含量比常乳高10～100倍。
这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等生物功能，不仅可以制造功能保健食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。
乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。
LF的一级结构是一条多肽链，分子量为70～80kD，LF上结合有两条糖链，含量为7%左右，其组成包括有半乳糖、甘露糖、N－乙酰半乳糖胺、藻糖等。
LF具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌酶再生、防止脂质过氧化等。
在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为1.00mg/ml，比常乳高近50倍。
我国约有乳牛近430万头，其中成年母牛260万头，以每头乳牛年产初乳50kg计算，每年可产近130t乳铁蛋白，因此生产乳铁蛋白的原料极为丰富，它的开发利用将带来可观的经济效益和社会效益。
但牛初乳具有异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除喂养牛犊之外，利用率非常低。
初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映。
因此，高效综合利用牛初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提取高纯度、高活性的天然活性蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重要的现实意义。
本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成本分离高纯度乳铁蛋白的目的。
1 原料与器材1.1 原料与试剂牛初乳：乳牛产犊3ｄ内收集的样品，CM-Sephadex C-50：进口分装BMK（Shanghai）Sci & Tech Ltd，CM-SEPHAROSE FAST FLOW，LF标准样品、电泳级丙稀酰胺Acr、电泳级甲叉双丙稀酰胺Bis、分析纯Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），化学纯SDS（十二烷基磺酸钠），分析纯TEMED（四甲基乙二胺），过硫酸胺Ap，分析纯甘氨酸，考马斯亮蓝R-250等。
牛初乳IgG的分离提纯方法研究摘要：牛初乳中的免疫球蛋白是动物体内免疫系统最为关键的物质之一,有抑制毒素和病原微生物等功能。
国内外在提取活性免疫球蛋白的方法上均有大量的研究,依据不同用途选择提取纯化方法,并将不同方法进行组合使用,可以收到良好的制取效果。
关键词：牛初乳IgG 分离提纯1.免疫球蛋白G(IgG)生化特性及生理功能牛初乳IgG免疫活性的变化主要受消化道内pH值和各种蛋白酶的影响。
张和平等(1997)研究IgG在体外的消化特性时发现，在pH 2．0及存在胃蛋白酶时IgG损失较大，在pH 4．0及存在胃蛋白酶时IgG损失较小，在pH 7．0及存在胰蛋白酶时IgG则能够很好地保持免疫活性。
在胃肠道中，牛初乳IgG则能够有效地抵抗酸和酶的降解，保持其免疫活性。
这是因为牛初乳含有能够抑制蛋白酶活力的某些糖蛋白和能够有效保护活性因子免受蛋白酶破坏的其他酶抑制剂。
IgG等抗体物质具有特殊的天然结构，许多研究证实IgG是乳清蛋白中对蛋白酶降解具有较高抗性的组分，这是生物进化的结果。
2.牛初乳IgG的分离提纯方法2.1 膜分离技术的应用膜分离技术作为生化分离技术的一项主要内容，已被世界许多国家的乳品行业采用。
现已应用到乳品行业的膜分离技术有超滤(uF)、反渗透(RO)和纳滤(NF)。
膜技术在乳清蛋白回收、乳糖的分离、乳清脱盐、牛乳浓缩等方面都取得了很大成果和经济效益。
用膜分离技术来分离牛初乳中的IgG可避免因酸沉淀、受热对IgG分子结构、活性的破坏，得到高效的免疫球蛋白。
张小平研究了超滤分离牛初乳乳清中IgG的方法，测定不同超滤温度和压力条件下IgG含量和活性的变化情况。
结果表明：通过超滤可将乳清中IgG含量提高一倍左右；超滤压力增加，IgG含量相应增加，IgG活性基本不变。
在压力0.08 MPa时，IgG含量为45.98mg／mL，活性未变，仍为1024；超滤温度增加，初乳中的IgG含量先有较小增加然后减少，IgG活性则下降。
《牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺研究》一、引言随着生活品质的不断提升，人类对营养与健康的追求逐渐加深。
作为生物活性蛋白的重要组成部分，乳铁蛋白具有较高的营养价值与保健功能，被广泛应用于食品、医药及化妆品等领域。
牛初乳作为天然的乳铁蛋白资源，因其独特的营养成分及生物学活性，正成为众多学者研究的焦点。
本论文针对牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺进行研究，旨在为乳铁蛋白的工业化生产提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料本研究所用材料为新鲜牛初乳，实验过程中所使用的试剂均为分析纯。
2. 方法（1）提取工艺：采用离心法、酶解法等手段对牛初乳进行初步处理，提取出乳铁蛋白。
（2）分离纯化工艺：通过超滤法、盐析法、凝胶过滤法等手段对提取出的乳铁蛋白进行纯化处理。
三、实验结果1. 提取工艺研究（1）离心法：通过离心分离法处理牛初乳，可得到初步的乳铁蛋白粗品。
此方法操作简便，但提取效率较低。
（2）酶解法：采用酶解法对牛初乳进行酶解处理，可使乳铁蛋白的提取率显著提高。
2. 分离纯化工艺研究（1）超滤法：采用超滤膜对提取出的乳铁蛋白进行超滤处理，可有效去除杂质，提高乳铁蛋白的纯度。
（2）盐析法：通过调整溶液的盐浓度，使乳铁蛋白与其他成分分离，达到纯化目的。
此方法操作简单，但纯化效果受盐种类及浓度影响较大。
（3）凝胶过滤法：利用凝胶过滤柱对乳铁蛋白进行分离纯化，可有效去除小分子杂质及大分子蛋白质，提高乳铁蛋白的纯度及生物活性。
四、讨论在提取工艺方面，离心法虽然操作简便，但提取效率较低；酶解法则可显著提高乳铁蛋白的提取率。
因此，在实际生产中，可结合两种方法，先通过离心法得到初步的乳铁蛋白粗品，再采用酶解法进一步提高提取率。
在分离纯化工艺方面，超滤法、盐析法及凝胶过滤法均可有效提高乳铁蛋白的纯度及生物活性。
其中，超滤法适用于大规模生产，盐析法则可根据具体需求选择合适的盐种类及浓度进行纯化；凝胶过滤法则适用于对纯度要求较高的产品。
乳铁蛋白的分离制备研究乳铁蛋白（lactoferrin）是乳汁中具有天然活性的非血红素铁结合糖蛋白,具有广泛的生物学活性,如抗氧化、消炎、广谱抗菌、抑制癌细胞生长以及免疫调节等。
因此乳铁蛋白的分离制备研究对乳铁蛋白产业的蓬勃发展具有重要意义。
近年来,国内乳铁蛋白的分离制备的原料主要为牛初乳,从鲜牛乳中分离制备乳铁蛋白的研究较少。
本文以鲜牛乳为原料,将酶法、膜技术和色谱技术联用,以乳铁蛋白纯度、回收率、膜效能为指标,确定最优工艺参数,为乳铁蛋白分离制备的工业化生产提供一定的理论依据。
1.酶凝乳法提取乳铁蛋白的工艺参数研究,得出以下结果:凝乳温度为38—46℃,凝乳pH值为5.8—6.6,凝乳时间为40—60min,凝乳酶添加量为0.005—0.007%时,乳铁蛋白纯度最高,乳清最澄清。
最优工艺参数:凝乳温度42℃,凝乳pH6.2,凝乳时间40min,凝乳酶添加量0.005%;验证试验的结果为:乳铁蛋白纯度为（2.24±0.25）%,乳清混浊度A<sub>500</sub>为0.25±0.05。
2.膜技术分离乳铁蛋白的工艺参数研究,得出以下结论:（1）0.45μm陶瓷膜微滤透过液的蛋白含量高于0.10μm陶瓷膜微滤透过液的蛋白含量,且在0—3h两种孔径的陶瓷膜的透过液蛋白含量都随着微滤时间的延长显著降低（P<0.05）,3h后蛋白含量无明显变化（P>0.05）,微滤膜不能继续正常发挥作用,因此选择每2h彻底清洗一次。
（2）膜效能（Y<sub>1</sub>）和乳铁蛋白纯度（Y<sub>2</sub>）与料液温度（X<sub>1</sub>）、操作压力（X<sub>2</sub>）和料液pH（X<sub>3</sub>）关系的二次多项回归方程:Y<sub>1</sub>=0.28+9.653×10<sup>-3</sup>X<sub>1</sub>+2.093×10<sup>-3</sup>X<sub>2</sub>-0.026X<sub>3</sub>+8.235×10<sup>-3</sup>X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>-2.430×10<sup>-3</sup>X<sub>1</sub>X<sub>3</sub>-1.080×10<sup>-3</sup>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>-0.038X<sub>1</sub><sup>2</s up>-0.022X<sub>2</sub><sup>2</sup>-0.085X<sub>3</sub><sup>2</sup>Y<su b>2</sub>=20.76+0.73X<sub>1</sub>+0.094X<sub>2</sub>-1.63X<sub>3</sub >-0.1X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>+0.31X<sub>1</sub>X<sub>3</sub>+0.18X< sub>2</sub>X<sub>3</sub>-1.81X<sub>1</sub><sup>2</sup>-0.095×X<sub>2</sub><sup>2</sup>-4.51X<sub>3</sub><sup>2</sup>（3）100kDa超滤膜超滤的最佳工艺参数为:料液温度35.65℃,操作压力0.202MPa,料液pH6.85,该条件下,膜效能为0.287g/（m<sup>2</sup>·min）。
乳及乳制品中牛乳铁蛋白含量测定方法比较研究陈柔含，韩奕奕，马颖清，刘 洋，丰东升*上海市农产品质量安全中心曁农业农村部食品质量监督检验测试中心（上海），上海 201708摘 要：[目的]探讨两种不同检测方法测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白的含量及应用研究。
[方法]对比高效液相色谱（HPLC）法和超高效液相色谱串联质谱（UPLC- MS/MS）法测定生鲜乳、调制乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料和奶粉样品等乳及乳制品中牛乳铁蛋白的含量，并对测定结果进一步比较和分析原因。
[结果]两种测定方法均具有较高回收率和较优的重现性，但两者方法对实际样品的测定结果具有一定差异性。
[结论]HPLC法测定牛乳铁蛋白是通过肝素亲和柱纯化富集乳铁蛋白，测定的是非热变性牛乳铁蛋白的含量；而UPLC-MS/MS法测定的是热变性和非热变性牛乳铁蛋白的含量，不受热处理加工工艺的影响。
实验室可针对不同检测目的选择不同方法进行定量研究。
关键词：牛乳铁蛋白；液相色谱；质谱；乳及乳制品文章编号：1671-4393（2022）09-0095-07 DOI:10.12377/1671-4393.22.09.190 引言牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin，bLF）是牛初乳中非常重要的铁结合型大分子糖蛋白，其分子量为78~80 kDa。
由于其氨基酸序列中含有大量的精氨酸与赖氨酸，故其等电点在7.8~8.2，是一种呈碱性的蛋白质[1]，主要由动物的乳腺上皮细胞分泌及表达。
乳铁蛋白（LF）与铁转运和储存密切相关，且对免疫功能系统的调节具有正向作用，同时拥有广谱抗菌性、抗病毒、抗癌、抗氧化等强大的生物功能，因此被媒体报道为“奶黄金”。
在自然界中，人的母乳中LF的含量较高，在1.0~3.0 mg/mL的范围内[2]，而牛初乳中的含量相对较低。
因此商业上很多基金项目：上海市科委项目“乳及乳制品中乳铁蛋白等活性物质检测技术研究及其应用”（19391902700）作者简介：陈柔含（1996-），女，浙江台州人，硕士，助理畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；韩奕奕（1972-），女，上海人，硕士，正高级畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；马颖清（1984-），女，上海人，硕士，畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；刘 洋（1994-），女，河北承德人，硕士，助理畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究。
浙江大学硕士学位论文牛初乳中乳铁蛋白与IgG的分离纯化姓名：解大斌申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：吴绵斌20060301等微量元素缺乏，发育迟缓，免疫力低下，易患各种疾病。
而牛初乳是提取这类生物活性物质的最佳来源之一。
１．２乳铁蛋白乳铁蛋Ｉ！Ｉ（Ｌａｃｔｏｆｅｎ＇ｉｎ，Ｌ０又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。
尽管有“乳铁蛋白”的称谓，它并非乳汁所特有，在哺乳动物的很多外分泌物中都存在，如：眼泪、唾液和精液等。
只是除乳中外，其他分泌物中Ｌｆ含量甚微。
因其晶体呈红色，故也有学者称之为“红蛋白”。
１．２．１乳铁蛋白的结构人、牛、马等动物的乳铁蛋白三维构象己通过蛋白晶体ｘ射线衍射分析确定下来。
人乳铁蛋白与午乳铁蛋白结构相似，氨基酸残基组成单链，两端折叠成球形（Ｎ叶和Ｃ叶），中间由一段螺旋肽链连接呈现“二枚银杏叶型”结构，形成８０ｋＤ具高级结构的糖蛋白，铁结合部位在两叶的切入部分。
图１．１Ｌｆ三维空间结构乳铁蛋白两叶结构基本相似，不同之处在于表面环状叶结构，每叶都有２个相似的吖Ｂ区域，其中一叶基于６束１３一层状结构，另一叶基于５束ｐ一层状结构。
Ｎ端和Ｃ端的球状结构包括３个区域，每端可各与一个Ｆｅ２＋结合，此位点位于一个裂Ｅｌ内，直径约１０埃，与铁结合的同时结合一个Ｃ０３２。
（或２个ＨＣ０３一）离子，以保持电荷平衡。
在晶体结构中Ｐｈｅｌ７～Ｌｅｕ２９间肽链形成ｏｃ－螺旋结构，Ｓｅｒ３３～Ａｒ９３９间无规则卷曲结构并使一个平行Ｂ一折叠结构与Ｎ端相连。
Ｐｈｅｌ７－Ｌｅｕ２９间肽段具有较强的抗菌活性，如果将其∞螺旋变成ｐ一折叠结构抗菌活性有较大提高，可能是由于Ｂ一折叠结构易于细菌表面接触的缘故㈦。
⑦浙江大学硕士学位论文图３．１阳离子交换柱洗脱衄线Ｆｉｇ３．１ＮａＣｌｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｏｎｃａｔｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｎｍＭ～标准蛋白Ｍａｒｋｅｒ；Ｓ一标准牛Ｌｆ；１一Ｏ．８５ｍｏｌ／Ｌ蛋白峰图３．２阳离子交换柱洗脱蛋白ＳＤＳ。
