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[1]王小丹，刘珊，徐海滨，严卫星.重组人乳铁蛋白对缺铁性贫血大鼠铁营养状况的改善作用[J].卫生研究.2012(01)[2]邬向东，李平华，陈如圣，全炳昭，罗军荣.牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化及其抗菌活性研究[J].江西畜牧兽医杂志.2011(01)[3]高东雁.丹参酚酸磷脂复合物及其自乳化给药系统研究[D].复旦大学2009[4]雷激，张明秋，张勇，黄承钰，白琳.体外消化/Caco-2细胞模型评价面粉锌生物利用率[J].食品科学.2011(01)[5]哈卓，赵丽丽，于晓旭，宗晓淋，毛雅元，张健，李一经，葛俊伟，乔薪瑗，唐丽杰.重组猪乳铁蛋白N端的高效表达及抑菌活性检测[J].生物工程学报.2010(04)[6]张明秋，王康宁，雷激，岳向峰，谢传晓，黄承钰.体外消化/Caco-2细胞模型评价铁生物强化玉米铁生物利用率[J].营养学报.2009(06)[7]陈历俊，姜铁民编着.乳铁蛋白生物功能及基因表达[M].科学出版社，2007[8]缪明星，袁玉国，安礼友，赵俊辉，柏亚军，郭磊，成勇.转基因小鼠乳汁中重组人乳铁蛋白的提取与抗菌活性分析[J].农业生物技术学报.2009(03)[9]杨鹏华，倪凤娥.常乳中牛乳铁蛋白的纯化及抗菌活性研究[J].安徽农业科学.2009(16)[10]雷激，黄承钰，张勇，张明秋，白琳.体外消化/Caco-2细胞方法评价富铁小麦生物利用率[J].卫生研究.2009(02)[11]雷激，张明秋，黄承钰，白琳，何中虎.用体外消化/Caco-2细胞模型观察维生素C 和柠檬酸对铁生物利用的影响[J].南方医科大学学报.2008(10)[12]胡宏伟.国民健康公平程度测量、因素分析与保障体系研究[D].武汉大学2010[13]崔淑霞.长春西汀自微乳化给药系统及其固体化制剂的设计与评价[D].沈阳药科大学2009。
![一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/99b1ab53fd0a79563d1e725f.png)
专利名称：一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法专利类型：发明专利
发明人：李晓波,王亮,肖向文,李艳红
申请号：CN201510686691.X
申请日：20151021
公开号：CN105237627A
公开日：
20160113
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种低分子量牛乳铁蛋白肽抗菌肽的纯化方法，该方法根据编码牛乳铁蛋白肽LfcinB的氨基酸编码序列NO.1和核苷酸编码序列NO.2，构建表达载体pPIC9K-LfcinB，并将载体转化到毕赤酵母GS115宿主细胞，形成可表达的重组细胞；培养宿主细胞，使其表达LfcinB抗菌肽；分离浓缩母液，加入蛋白抑制剂及保护剂，经透析和20%的三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得纯度较高的目的蛋白，经检测具有较高的抑菌活性。
申请人：中国科学院新疆理化技术研究所
地址：830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市北京南路40号附1号
国籍：CN
代理机构：乌鲁木齐中科新兴专利事务所
代理人：张莉
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一种牛乳铁蛋白工程菌及抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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乳铁蛋白的研究进展和应用摘要乳铁蛋白是一种具有多种生理功能的铁结合糖蛋白，具有抗菌、抗病毒、免疫调节等生理功能。
本文对LF的基本特性、生理功能的研究进展和与其他牛乳蛋白质的相互作用等方面进行了综述。
关键词：乳铁蛋白；生理功能；免疫调节前言一场肆虐全球的新型冠状病毒肺炎疫情，让更多的人意识到身体健康的重要性，同时，也让人们更加重视身心健康和自身免疫力的提升。
乳铁蛋白(Lactoferrin，简称LF)是哺乳动物体内天然存在的一种结合铁的具有免疫功能的非血源性糖蛋白[1,2]。
1939年Sorensen M和So-rensen SPL从牛乳乳清蛋白中分离出来，因其晶体呈红色，也有人称其为“红蛋白”，主要存在于母乳和牛乳中[1,3]。
目前LF的研究和利用已成为科研的热点，研究正向着保健品、药品和医疗诊疗剂方向发展[2]。
近年的研究表明，LF不仅在非特异性免疫系统中发挥作用，同时还具有抗微生物活性、抗炎症、抗癌症等功能，通过LF的不同功能可以看出其应用前景的广阔。
本文对LF的基本特性、生物功能活性的研究进展和与其他牛乳蛋白质的相互作用等方面作一综述。
1 LF的基本概述1.1 LF的结构LF是一种具有多种生理功能的铁结合糖蛋白，其分子质量约为70-80千道尔顿[4]。
人LF和牛LF的三级结构经对比后发现，氨基酸序列的同源性达到69 %。
人LF和牛LF的一级结构为单链糖蛋白结构，分别由691和689个氨基酸构成[5,6]。
LF的二级结构主要由α-螺旋和β-折叠交替排列而成，中间由一段螺旋肽链链接，呈“二枚银杏叶型”结构[7]。
LF的三级结构由多肽链折叠成两个极相似的、对称的球状叶结构，称之为N叶和C叶，每一个叶片又分为两个结构域，即N-1、N-2、C-1、C-2[7]，每一个叶片的结构域间形成一个裂缝，是铁离子的结合位点[8,9]。
不同来源的LF氨基酸序列都含有一个双重内部重复序列，如N末端序列与C末端序列有40%的一致性。
乳及乳制品中牛乳铁蛋白含量测定方法比较研究陈柔含，韩奕奕，马颖清，刘 洋，丰东升*上海市农产品质量安全中心曁农业农村部食品质量监督检验测试中心（上海），上海 201708摘 要：[目的]探讨两种不同检测方法测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白的含量及应用研究。
[方法]对比高效液相色谱（HPLC）法和超高效液相色谱串联质谱（UPLC- MS/MS）法测定生鲜乳、调制乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料和奶粉样品等乳及乳制品中牛乳铁蛋白的含量，并对测定结果进一步比较和分析原因。
[结果]两种测定方法均具有较高回收率和较优的重现性，但两者方法对实际样品的测定结果具有一定差异性。
[结论]HPLC法测定牛乳铁蛋白是通过肝素亲和柱纯化富集乳铁蛋白，测定的是非热变性牛乳铁蛋白的含量；而UPLC-MS/MS法测定的是热变性和非热变性牛乳铁蛋白的含量，不受热处理加工工艺的影响。
实验室可针对不同检测目的选择不同方法进行定量研究。
关键词：牛乳铁蛋白；液相色谱；质谱；乳及乳制品文章编号：1671-4393（2022）09-0095-07 DOI:10.12377/1671-4393.22.09.190 引言牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin，bLF）是牛初乳中非常重要的铁结合型大分子糖蛋白，其分子量为78~80 kDa。
由于其氨基酸序列中含有大量的精氨酸与赖氨酸，故其等电点在7.8~8.2，是一种呈碱性的蛋白质[1]，主要由动物的乳腺上皮细胞分泌及表达。
乳铁蛋白（LF）与铁转运和储存密切相关，且对免疫功能系统的调节具有正向作用，同时拥有广谱抗菌性、抗病毒、抗癌、抗氧化等强大的生物功能，因此被媒体报道为“奶黄金”。
在自然界中，人的母乳中LF的含量较高，在1.0~3.0 mg/mL的范围内[2]，而牛初乳中的含量相对较低。
因此商业上很多基金项目：上海市科委项目“乳及乳制品中乳铁蛋白等活性物质检测技术研究及其应用”（19391902700）作者简介：陈柔含（1996-），女，浙江台州人，硕士，助理畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；韩奕奕（1972-），女，上海人，硕士，正高级畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；马颖清（1984-），女，上海人，硕士，畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；刘 洋（1994-），女，河北承德人，硕士，助理畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究。
奶制品一直是人们饮食中重要的营养来源，其中的乳铁蛋白更是备受关注。
乳铁蛋白是一种在乳制品中富含的蛋白质，具有丰富的营养成分和重要的药理作用。
然而，乳铁蛋白的测定一直是个难题，而液相色谱法是一种常用的测定方法。
在接下来的文章中，我将通过深度和广度兼具的方式来探讨奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法，并共享我对这个主题的个人观点和理解。
让我们来了解一下乳铁蛋白。
乳铁蛋白是奶制品中的一种重要蛋白质，它不仅具有良好的营养价值，还具有抗菌、抗病毒和抗氧化等多种药理作用。
对乳铁蛋白的测定具有重要的意义。
液相色谱法作为一种高效、灵敏度高、选择性好的分析方法，已经成为乳铁蛋白测定的首选方法之一。
接下来，我将从液相色谱法的基本原理和操作流程开始介绍。
液相色谱法是一种利用溶液在固定相与移动相作用下分离、纯化混合物的物理化学方法。
在乳铁蛋白的测定中，可以使用反相液相色谱法和离子交换液相色谱法。
在操作流程上，首先需要提取样品中的乳铁蛋白，然后采用适当的色谱柱和色谱条件进行分离和检测，最后利用标准曲线法计算样品中乳铁蛋白的含量。
这种方法的优点在于准确性高、重复性好、操作简便、对样品的前处理要求低等。
让我们来谈谈乳制品中乳铁蛋白测定液相色谱法的应用和发展现状。
液相色谱法在乳铁蛋白的测定中已经得到了广泛的应用，尤其在乳制品加工和质量控制中具有重要的实际意义。
随着科学技术的不断发展，液相色谱法在乳铁蛋白测定中也在不断完善和提高，例如采用高效液相色谱法、超高效液相色谱法等新技术，可以更加快速、准确地测定乳铁蛋白的含量。
我还想强调乳铁蛋白的测定对于保障乳制品的质量和安全至关重要。
乳铁蛋白不仅是乳制品中的重要营养成分，更是对乳制品质量的重要指标之一。
利用液相色谱法对乳铁蛋白进行准确、快速地测定，有助于提高乳制品的品质和竞争力，有效保障消费者的健康。
对于奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法，我的个人观点是，这是一项非常重要的研究课题，对于乳制品行业的发展和消费者健康都具有重要意义。
常乳中牛乳铁蛋白的纯化及抗菌活性研究杨鹏华,倪凤娥 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434025)摘要 [目的]研究从常乳中纯化牛乳铁蛋白的工艺条件,探讨牛乳铁蛋白的抗菌活性。
[方法]选用SP sepharose HP 作为强阳离子交换介质,利用AKT A purifier 10高效液相色谱仪纯化牛乳铁蛋白。
[结果]结果表明,牛乳铁蛋白在pH 值7.5、浓度0.85mol/L 的NaCl 洗脱液中可以被洗脱下来,且产品纯度为90%以上。
牛乳铁蛋白浓度为5mg/m l 时对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用。
[结论]该研究建立了从常乳中纯化牛乳铁蛋白的方法,为大规模生产具有活性的牛乳铁蛋白奠定了基础。
关键词 牛;乳铁蛋白;纯化中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)16-07351-02Pur i f ica tion and Antibacter i a l Activ ity of Bov i ne Lactoferr i n from Cows ′M ilkYANG Peng 2hua et a l (College of L ife Science,Yangtze University,J ingzhou,Hubei 404325)Abstract [Objective ]The ai m was to research the purification p r ocedures of bovine lactoferrin fr om cows πm ilk,and t o discuss the antibacte 2rial activity of bovine lactoferrin .[Method ]U sing SP sepharose HP as exchange medium of str ong cation,bovine lact oferrin was purified by u 2sing AKT A purifier 10high perf or mance liquid chr omat ograph .[Result]The results showed that bovine lact oferrin was eluted at 0.85mol/L NaCl and 7.5pH value,and the purity was over 90%.The growth of E.coli was evidently supp ressed with 5mg/m l bovine lactoferrin .[Con 2clusi on ]This study constructed the purification method of lactoferrin fr om cows ′m ilk,and p rovided bases f or large scale p roduction of active bovine lactoferrin .Key words Cow;Lactoferrin;Purification作者简介 杨鹏华(1977-),男,河北保定人,博士,讲师,从事动物基因工程方向研究。
收稿日期 2009204220 牛乳铁蛋白(Bovine Lact oferrin,b LF )是一种多功能蛋白质,在牛初乳和干乳期乳腺分泌物中含量较丰富[1],而在常乳中含量较少。
它具有广泛的抗病毒[2]、抗细菌感染作用[3],能有效增强免疫细胞增殖,提高机体免疫力[4]。
故对牛乳铁蛋白的研究一直以来都是人们关注的焦点。
由于初乳中含量丰富,所以目前牛乳铁蛋白均来自于初乳,但是由于初乳的来源有限,在一定程度上限制了牛乳铁蛋白的大规模生产,导致牛乳铁蛋白的价格不菲。
该研究尝试应用强阳离子交换色谱法从常乳中纯化牛乳铁蛋白,为其工业化生产奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料、仪器、试剂 牛乳采自普通奶牛的常乳。
色谱柱H i L oad 16/10SP sephar ose HP colu mn,美国GEHealthcare 公司;高效液相色谱仪AKT A purifier 10,美国GE Healthcare 公司;DYY -Ⅲ2稳压电泳仪,北京六一仪器厂;超滤管,M illi pore 公司;Freez one 6冷冻干燥机,美国Labconco 公司。
大肠杆菌为长江大学生命科学学院实验室保存,肉汤琼脂培养基购自青岛海博生物公司,其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 牛乳清制备。
将乳样于4℃、4500r/m in 离心15m in,将下层液体吸出转移到另一个离心管。
将脱脂乳用浓度1mol/L 盐酸调节pH 值,使其pH 值在3.8～4.6,将调好pH 值的乳样于4℃、12000r/m in 离心20m in,取出,将上清转移到另一个离心管。
用浓度1mol/L 氢氧化钠调pH 值为7.5,将调好pH 值的奶样于4℃、12000r/m in 离心30m in,将上清收集到一个烧杯中,准备上样。
1.2.2 牛乳铁蛋白纯化工艺的建立。
乳清通过注射器上样,进入上样环。
色谱柱预先用浓度0.4mol/L NaCl 、浓度20.0mmol/L Na 3P O 4、pH 值7.5的平衡液平衡5个柱体积。
然后用浓度0.4～1.0mol/L NaCl 、浓度20.0mmol/LNa 3P O 4、pH 值7.5洗脱液线性洗脱15个体积,浓度1.0mol/L NaCl 、浓度20.0mmol/L Na 3P O 4、pH 值7.5洗脱液继续洗脱5个体积,流速设为3m l/m in 。
收集分离到的各个峰值蛋白,每10m l 收集一管,合并同一峰值的洗脱液,洗脱液经5K D 的超滤管5000r/m in 离心10m in,双蒸水恢复原体积,再5000r/m in,离心10m in,即得纯化除盐的b LF 。
纯化得到b LF 浓缩液,-55℃冷冻24h,取出立即放入Freez one 6冻干机中冻干至粉末状,取出4℃保存。
1.2.3 S DS 2P AGE 检测纯化效果。
配制浓度15%S DS 2P AGE,取10μl 纯化液加入10μl 蛋白上样缓冲液,100℃水浴5min,取出电泳。
浓缩胶电压设置50V,分离胶电压设置90V,电泳结束后用考马斯亮蓝染色,结果用凝胶成像仪拍照。
1.2.4 抗菌活性分析。
在试管中把大肠杆菌用肉汤琼脂培养基稀释浓度为2×104个/m l,分别添加终浓度为0.5、2.0、5.0mg/m l 的b LF,37℃、180r/m in 摇床培养。
分别在1、2、4h 测定菌液的OD 600。
同时设一不加b LF 的空白对照组。
每组设3个重复,试验重复3次。
2 结果与分析2.1 牛乳铁蛋白的纯化工艺 高质量乳清的获得采用了pH 值法,调pH 值至酪蛋白等电点,通过离心得到了几乎不含酪蛋白的乳清(图1W )。
这对于其后的阳离子交换色谱来说至关重要。
因为酪蛋白是乳蛋白中的主要蛋白,酪蛋白的去除有利于提高乳铁蛋白的纯化效率。
阳离子交换色谱采用了SP sephar ose HP 介质,洗脱液为含浓度20.0mmol/LNa 3P O 4、pH 值7.5的浓度0.4～1.0mol/L NaCl 的线性洗脱。
在流速为3m l/m in 的条件下,在NaCl 浓度0.85mol/L 时纯化得到了一个明显的蛋白峰,见图2C,经电泳检测证明为b LF,灰度扫描表明得到的b LF 纯度为91.3%(图1C )。
在C峰前出现了一个不明显的蛋白峰,分别收集到2个收集管中A 和B,但是经电泳检测未见到明显条带(见图1A 、B )。
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri .Sci .2009,37(16):7351-7352责任编辑 张彩丽 责任校对 王业政注:M,蛋白分子量标准;A 、B 、C,色谱纯化蛋白峰;b L,牛乳铁蛋白;Q,牛全乳;W ,乳清。
Note:M.Standard p r otein marker;A,B,C .Chr o mat ographic peakof purified p r otein;bL.Bovine lact oferrin;Q.Bovine whole m ilk;W.W hey .图1 牛乳铁蛋白纯度电泳检测结果F i g .1 S D S 2PAGE electrophoresis detecti on results of Bov i n eLactorerri npur ity图2 牛乳铁蛋白纯化色谱图F i g .2 Pur i f i cati on chro ma togram of bovi n e l actoferr i n pur ity2.2 牛乳铁蛋白抗菌效果 牛乳铁蛋白具有广谱的抗菌活性,试验采用大肠杆菌作为试验菌,通过不同浓度的牛乳铁蛋白溶液研究了对大肠杆菌的抗菌效果,结果见表1。
表1表明,牛乳铁蛋白浓度低时并不能抑制菌体生长,当牛乳铁蛋白浓度增加到2.0mg/m l 时,培养4h 后,OD 值明显降低,表现出一定的抑菌效果。
当牛乳铁蛋白浓度为5.0mg/m l 时,菌液的OD 值并不发生变化,说明该浓度对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用。
表1 牛乳铁蛋白抗菌效果Table 1 Anti bacter i a l effect of bov i n e l actoferri n浓度mg/m lConcen 2trati ons0h1h2h4h0.50.064±0.0050.073±0.0040.124±0.0110.717±0.0242.00.058±0.0030.067±0.0020.096±0.0090.344±0.0445.00.058±0.0040.071±0.0070.064±0.00050.073±0.004CK0.065±0.0020.073±0.0040.175±0.0070.770±0.0203 结论与讨论由于牛乳铁蛋白是一种多功能的活性蛋白,所以它一直是人们关注的热点。
目前牛乳铁蛋白大部分是从牛初乳中纯化分离得到的[5-6],鲜有从常乳中分离牛乳铁蛋白的报道。
而且因为牛乳铁蛋白在乳中的含量低,所以得到的蛋白纯度也不令人满意。
该研究从常乳中分离牛乳铁蛋白,选用了强阳离子交换介质SP sephar ose HP 。
经过一系列纯化工艺的摸索,确立了牛乳铁蛋白在pH 值为7.5浓度为0.8mol/L 的NaCl 洗脱液中可以被洗脱下来,且产品纯度为90%以上。
