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牛初乳中提取乳铁蛋白工艺的研究

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牛初乳中免疫球蛋白的提取及其保护剂研究的开题报告

牛初乳中免疫球蛋白的提取及其保护剂研究的开题报告

牛初乳中免疫球蛋白的提取及其保护剂研究的开题报告一、选题背景及意义牛初乳是母牛产后分泌的乳汁，在一定时期内对新生牛具有特殊的营养价值和免疫保护作用。

牛初乳中含有多种免疫因子，如免疫球蛋白、半乳糖和乳清蛋白等，其中免疫球蛋白是其中最为重要的成分之一。

牛初乳免疫球蛋白能够提高新生牛的免疫力，在预防感染疾病、消化系统发育等方面具有重要作用。

因此，对牛初乳中免疫球蛋白进行提取和保护剂研究，不仅有助于提高新生牛的免疫力，还可以为牛奶生产和养殖业提供有益的补充和创新。

本文旨在探讨牛初乳免疫球蛋白的提取方法和保护剂研究，以期为相关领域的研究和应用提供参考和借鉴。

二、研究内容1. 牛初乳中免疫球蛋白的提取方法研究。

本文将介绍当前常见的牛初乳免疫球蛋白提取方法，如离子交换、凝胶过滤、亲和层析等，从各自的原理、操作步骤、提取效率等方面进行比较分析。

2. 牛初乳免疫球蛋白保护剂的研究。

本文将探讨牛初乳免疫球蛋白保护剂的种类、性质、作用机理等，重点阐述保护剂对免疫球蛋白质量的影响，以及如何选择合适的保护剂和保护剂的添加量等注意事项。

3. 牛初乳免疫球蛋白饲料的研究。

本文将介绍如何将提取后的牛初乳免疫球蛋白应用于饲料中，以提高新生牛的免疫力和促进其消化系统发育，探讨免疫球蛋白饲料对新生牛的生长性能、免疫功能等方面的影响。

三、研究目的1. 探究牛初乳中免疫球蛋白的提取方法及其影响因素，为提高提取效率提供理论和实践基础。

2. 研究牛初乳免疫球蛋白的保护剂种类及其对免疫球蛋白的保护效果，为免疫球蛋白的保存和应用提供技术支撑。

3. 探讨免疫球蛋白饲料的配制方法及其饲喂效果，为新生牛饲养管理提供科学依据和参考方案。

四、研究方法1. 实验方法。

通过实验室模拟和实际样品分析等方法，对牛初乳中免疫球蛋白的提取、保护和应用进行研究。

2. 统计分析。

通过统计学方法对数据进行分析和处理，评估提取方法、保护剂和饲料配方等因素对免疫球蛋白提取效率和保护效果的影响。

乳铁蛋白的分离工艺研究

乳铁蛋白的分离工艺研究

乳铁蛋白的分离工艺研究
吕立获;周晓云;姚婷婷;芦国营;吴绵斌
【期刊名称】《中国乳品工业》
【年(卷),期】2005(033)008
【摘要】讨论了从牛初乳中分离乳铁蛋白的工艺.结果表明,牛初乳经过离心脱脂得到脱脂乳,加入带羧甲基的弱酸性阳离子交换剂CM-Sepharose Fast Flow在4℃下进行动态吸附,用去离子水将没有吸附上的杂蛋白冲洗掉,然后使用质量分数为
1.5%和5%的NaCl溶液进行阶跃洗脱:经过两步阶跃洗脱得到的乳铁蛋白纯度可
达95%以上.
【总页数】4页(P10-13)
【作者】吕立获;周晓云;姚婷婷;芦国营;吴绵斌
【作者单位】浙江工业大学,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,浙江,杭州,310032
【正文语种】中文
【中图分类】TQ936
【相关文献】
1.乳铁蛋白水解物修饰物的分离纯化及其抗大肠杆菌活性 [J], 马春敏;薄力影;范婧;李铁晶
2.乳铁蛋白-乳清分离蛋白乳状液微聚集体构建与酶交联对其流变学特性的影响 [J],
李昕;王旭;刘佳炜;李钰;许朵霞;曹雁平
3.乳铁蛋白提取工艺研究及应用 [J], 李楠楠
4.乳铁蛋白分离纯化研究进展 [J], 张基亮;张兰威;韩雪;马莺
5.转基因羊乳中重组人乳铁蛋白的分离工艺研究 [J], 支旭勃;李青旺;冯波;肖波;韩增胜;范玉生;张婷
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乳铁蛋白的分离工艺研究

乳铁蛋白的分离工艺研究

乳铁蛋白的分离工艺研究牛初乳是指奶牛产犊后3d内所分泌的乳汁。

科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为富集的生物资源之一。

包括重要的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（IgG）、乳铁蛋白（LF）及胰岛素生长因子（IGF）等，含量比常乳高10～100倍。

这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等生物功能，不仅可以制造功能保健食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。

乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。

LF的一级结构是一条多肽链，分子量为70～80kD，LF上结合有两条糖链，含量为7%左右，其组成包括有半乳糖、甘露糖、N－乙酰半乳糖胺、藻糖等。

LF具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌酶再生、防止脂质过氧化等。

在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为1.00mg/ml，比常乳高近50倍。

我国约有乳牛近430万头，其中成年母牛260万头，以每头乳牛年产初乳50kg计算，每年可产近130t乳铁蛋白，因此生产乳铁蛋白的原料极为丰富，它的开发利用将带来可观的经济效益和社会效益。

但牛初乳具有异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除喂养牛犊之外，利用率非常低。

初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映。

因此，高效综合利用牛初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提取高纯度、高活性的天然活性蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重要的现实意义。

本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成本分离高纯度乳铁蛋白的目的。

1 原料与器材1.1 原料与试剂牛初乳：乳牛产犊3ｄ内收集的样品，CM-Sephadex C-50：进口分装BMK（Shanghai）Sci & Tech Ltd，CM-SEPHAROSE FAST FLOW，LF标准样品、电泳级丙稀酰胺Acr、电泳级甲叉双丙稀酰胺Bis、分析纯Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），化学纯SDS（十二烷基磺酸钠），分析纯TEMED（四甲基乙二胺），过硫酸胺Ap，分析纯甘氨酸，考马斯亮蓝R-250等。

《牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺研究》

《牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺研究》

《牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺研究》一、引言随着生活品质的不断提升，人类对营养与健康的追求逐渐加深。

作为生物活性蛋白的重要组成部分，乳铁蛋白具有较高的营养价值与保健功能，被广泛应用于食品、医药及化妆品等领域。

牛初乳作为天然的乳铁蛋白资源，因其独特的营养成分及生物学活性，正成为众多学者研究的焦点。

本论文针对牛初乳中乳铁蛋白的提取及分离纯化工艺进行研究，旨在为乳铁蛋白的工业化生产提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本研究所用材料为新鲜牛初乳，实验过程中所使用的试剂均为分析纯。

2. 方法（1）提取工艺：采用离心法、酶解法等手段对牛初乳进行初步处理，提取出乳铁蛋白。

（2）分离纯化工艺：通过超滤法、盐析法、凝胶过滤法等手段对提取出的乳铁蛋白进行纯化处理。

三、实验结果1. 提取工艺研究（1）离心法：通过离心分离法处理牛初乳，可得到初步的乳铁蛋白粗品。

此方法操作简便，但提取效率较低。

（2）酶解法：采用酶解法对牛初乳进行酶解处理，可使乳铁蛋白的提取率显著提高。

2. 分离纯化工艺研究（1）超滤法：采用超滤膜对提取出的乳铁蛋白进行超滤处理，可有效去除杂质，提高乳铁蛋白的纯度。

（2）盐析法：通过调整溶液的盐浓度，使乳铁蛋白与其他成分分离，达到纯化目的。

此方法操作简单，但纯化效果受盐种类及浓度影响较大。

（3）凝胶过滤法：利用凝胶过滤柱对乳铁蛋白进行分离纯化，可有效去除小分子杂质及大分子蛋白质，提高乳铁蛋白的纯度及生物活性。

四、讨论在提取工艺方面，离心法虽然操作简便，但提取效率较低；酶解法则可显著提高乳铁蛋白的提取率。

因此，在实际生产中，可结合两种方法，先通过离心法得到初步的乳铁蛋白粗品，再采用酶解法进一步提高提取率。

在分离纯化工艺方面，超滤法、盐析法及凝胶过滤法均可有效提高乳铁蛋白的纯度及生物活性。

其中，超滤法适用于大规模生产，盐析法则可根据具体需求选择合适的盐种类及浓度进行纯化；凝胶过滤法则适用于对纯度要求较高的产品。

乳铁蛋白的分离制备研究

乳铁蛋白的分离制备研究

乳铁蛋白的分离制备研究乳铁蛋白（lactoferrin）是乳汁中具有天然活性的非血红素铁结合糖蛋白,具有广泛的生物学活性,如抗氧化、消炎、广谱抗菌、抑制癌细胞生长以及免疫调节等。

因此乳铁蛋白的分离制备研究对乳铁蛋白产业的蓬勃发展具有重要意义。

近年来,国内乳铁蛋白的分离制备的原料主要为牛初乳,从鲜牛乳中分离制备乳铁蛋白的研究较少。

本文以鲜牛乳为原料,将酶法、膜技术和色谱技术联用,以乳铁蛋白纯度、回收率、膜效能为指标,确定最优工艺参数,为乳铁蛋白分离制备的工业化生产提供一定的理论依据。

1.酶凝乳法提取乳铁蛋白的工艺参数研究,得出以下结果:凝乳温度为38—46℃,凝乳pH值为5.8—6.6,凝乳时间为40—60min,凝乳酶添加量为0.005—0.007%时,乳铁蛋白纯度最高,乳清最澄清。

最优工艺参数:凝乳温度42℃,凝乳pH6.2,凝乳时间40min,凝乳酶添加量0.005%;验证试验的结果为:乳铁蛋白纯度为（2.24±0.25）%,乳清混浊度A<sub>500</sub>为0.25±0.05。

2.膜技术分离乳铁蛋白的工艺参数研究,得出以下结论:（1）0.45μm陶瓷膜微滤透过液的蛋白含量高于0.10μm陶瓷膜微滤透过液的蛋白含量,且在0—3h两种孔径的陶瓷膜的透过液蛋白含量都随着微滤时间的延长显著降低（P&lt;0.05）,3h后蛋白含量无明显变化（P&gt;0.05）,微滤膜不能继续正常发挥作用,因此选择每2h彻底清洗一次。

（2）膜效能（Y<sub>1</sub>）和乳铁蛋白纯度（Y<sub>2</sub>）与料液温度（X<sub>1</sub>）、操作压力（X<sub>2</sub>）和料液pH（X<sub>3</sub>）关系的二次多项回归方程:Y<sub>1</sub>=0.28+9.653×10<sup>-3</sup>X<sub>1</sub>+2.093×10<sup>-3</sup>X<sub>2</sub>-0.026X<sub>3</sub>+8.235×10<sup>-3</sup>X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>-2.430×10<sup>-3</sup>X<sub>1</sub>X<sub>3</sub>-1.080×10<sup>-3</sup>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>-0.038X<sub>1</sub><sup>2</s up>-0.022X<sub>2</sub><sup>2</sup>-0.085X<sub>3</sub><sup>2</sup>Y<su b>2</sub>=20.76+0.73X<sub>1</sub>+0.094X<sub>2</sub>-1.63X<sub>3</sub >-0.1X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>+0.31X<sub>1</sub>X<sub>3</sub>+0.18X< sub>2</sub>X<sub>3</sub>-1.81X<sub>1</sub><sup>2</sup>-0.095×X<sub>2</sub><sup>2</sup>-4.51X<sub>3</sub><sup>2</sup>（3）100kDa超滤膜超滤的最佳工艺参数为:料液温度35.65℃,操作压力0.202MPa,料液pH6.85,该条件下,膜效能为0.287g/（m<sup>2</sup>·min）。

乳铁蛋白的分离纯化方法研究

乳铁蛋白的分离纯化方法研究
皿匿圃
…
高 新 技 术
乳铁 蛋 白的 分 离 纯化 方 法研 究
（ 武汉软 件工 程职 业学院 摘 武 莹 浣 环境 与生 化工程 系 湖 北武汉 ４ ３ ０ ２ ０５ ） 要： 牛初乳 中含 有板 丰富的生物活 性糟质 ， 是提取和 利 用乳饺蛋 白的曩适来 源之一 。 乳铁 蛋 白的分 离纯化方 法较 多， 本 文概 速 了盐 析
度的 Ｌ ｆ 。 为强化 传 质和分 离过 程 ， Ｂ ｒ ｉ ｔｏ ｎ 等【 ４ ］ 乳 中的Ｌ ｆ 可用 ３ ３ ０ ｍＭＮ ａ Ｃ １ 洗脱 ， 吸附 容量
． ３ ４ ｍｇ ／ ｇ ， 纯 度为 ９ ６ ． ７ ％， 树 脂 对Ｌ ｆ 的 （ １ ａ ｃ ｔ ｏ ｆ ｅ ｒ ｒ ｉ ｎ ， Ｌ ｆ ） ， 又 称 乳转 铁 蛋 白， 主 要存 在 分 离过 程 中添 加 了一 个 外 加 电场 强化 膜 为８ 在 于 大 多数 哺 乳动 物 乳 汁 中 的铁 结 合糖 蛋 通 量 ， 降低膜 污 染 ， 可 用 于 组分 复 杂 的料 回收 率 为 ７ ４ ． ５ Ｏ ％。 Ｓ Ｐ Ｅ Ｃ Ｔ ０ Ｓ Ｌ Ｓ 树脂 被 美 Ｎｄ ｉ ａ ｙ ｅ 等ｆ Ｉ 用 电场 强化 的超 滤膜 过 滤 分 国 Ｆ Ｄ Ａ认 可 为 能 与 食 品接 触 的 物 质 ， 在 工 白。 Ｌ ｆ 分子 量 约 为８ ０ ０ ０ ０ ｕ， 多肽 链 上 有两 条 液 。 糖链 ， 包 括 半 乳 糖 甘 露 糖 Ｎ一 乙 酞 半 乳 糖 离 Ｌ ｆ ， 但其 中 含 有 Ｄ一 乳 球 蛋 白等 杂 蛋 白 ，
和有 机溶 剂法 ， 超 滤法 、 离子 交换 色谱法 ， 隶 和 色谱法 ， 吸 附色谱 法 ， 固定化单 克隆抗 体 法和混合 模 式扩张 床吸 附法等 ， 扰 其工 业化 生

南昌大学科技成果——牛乳中乳铁蛋白的分离及其抗菌活性

南昌大学科技成果——牛乳中乳铁蛋白的分离及其
抗菌活性
项目研究背景
乳铁蛋白是转铁蛋白家族中的成员之一，在人和哺乳动物的乳汁中含量较丰富，其中牛常乳中含量为0.02-0.35mg/mL。

乳铁蛋白因其晶体呈红色，又称“红蛋白”，具有多种生理功能，乳铁蛋白大多从牛乳加工奶酪时的副产物乳清中提取加工而成。

当前，我国在干酪发展过程中面临的很大问题是乳清的利用。

随着乳品工业的发展，乳清大量增加，这将成为乳铁蛋白的一个重要来源，本项目以牛常乳为原料，运用现代生物技术分离、纯化及干燥技术可得到高纯度的乳铁蛋白。

工艺流程
牛乳处理→脱脂→用酸调PH值→保温→乳清→提取→超滤→浓缩→纯化→杀菌→干燥→制品
市场预测
我国生产乳铁蛋白的原料廉价、丰富，利用本项目研制而成的乳铁蛋白可广泛应用于食品、生化、医药及化妆品等领域。

可行性研究报告表明，工业化生产乳铁蛋白可获得较好的经济效益。

投资规模
班产乳铁蛋白0.5公斤，年产150公斤，固定资产250万元（其中设备投资150万元），流动资金50万元，不可预见资金10万元。

合作方式技术转让。

牛初乳中乳铁蛋白与IgG的分离纯化

浙江大学硕士学位论文牛初乳中乳铁蛋白与IgG的分离纯化姓名：解大斌申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：吴绵斌20060301等微量元素缺乏，发育迟缓，免疫力低下，易患各种疾病。

而牛初乳是提取这类生物活性物质的最佳来源之一。

１．２乳铁蛋白乳铁蛋Ｉ！Ｉ（Ｌａｃｔｏｆｅｎ＇ｉｎ，Ｌ０又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。

尽管有“乳铁蛋白”的称谓，它并非乳汁所特有，在哺乳动物的很多外分泌物中都存在，如：眼泪、唾液和精液等。

只是除乳中外，其他分泌物中Ｌｆ含量甚微。

因其晶体呈红色，故也有学者称之为“红蛋白”。

１．２．１乳铁蛋白的结构人、牛、马等动物的乳铁蛋白三维构象己通过蛋白晶体ｘ射线衍射分析确定下来。

人乳铁蛋白与午乳铁蛋白结构相似，氨基酸残基组成单链，两端折叠成球形（Ｎ叶和Ｃ叶），中间由一段螺旋肽链连接呈现“二枚银杏叶型”结构，形成８０ｋＤ具高级结构的糖蛋白，铁结合部位在两叶的切入部分。

图１．１Ｌｆ三维空间结构乳铁蛋白两叶结构基本相似，不同之处在于表面环状叶结构，每叶都有２个相似的吖Ｂ区域，其中一叶基于６束１３一层状结构，另一叶基于５束ｐ一层状结构。

Ｎ端和Ｃ端的球状结构包括３个区域，每端可各与一个Ｆｅ２＋结合，此位点位于一个裂Ｅｌ内，直径约１０埃，与铁结合的同时结合一个Ｃ０３２。

（或２个ＨＣ０３一）离子，以保持电荷平衡。

在晶体结构中Ｐｈｅｌ７～Ｌｅｕ２９间肽链形成ｏｃ－螺旋结构，Ｓｅｒ３３～Ａｒ９３９间无规则卷曲结构并使一个平行Ｂ一折叠结构与Ｎ端相连。

Ｐｈｅｌ７－Ｌｅｕ２９间肽段具有较强的抗菌活性，如果将其∞螺旋变成ｐ一折叠结构抗菌活性有较大提高，可能是由于Ｂ一折叠结构易于细菌表面接触的缘故㈦。

⑦浙江大学硕士学位论文图３．１阳离子交换柱洗脱衄线Ｆｉｇ３．１ＮａＣｌｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｏｎｃａｔｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｎｍＭ～标准蛋白Ｍａｒｋｅｒ；Ｓ一标准牛Ｌｆ；１一Ｏ．８５ｍｏｌ／Ｌ蛋白峰图３．２阳离子交换柱洗脱蛋白ＳＤＳ。

牛初乳中乳铁蛋白粗提工艺的优化研究


ｉｏ ａ ｉ ｇ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｔ ｒ ｕ ｈ ｔ ｅ ｓｎ ｌ ａ ｔ ｒ ｎ ￣ ｏ ｏ ａ ｘ ｅ ｉ ｎ ｓ Ｔ ｅｒ ｓ ｌ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ａ ｔ ｕ ｔ Ｈ ． ｓ ｌｔ ｏ ｄ ｔ ｎ ｎ ｉ ｗｅ ｅ ｏ ｔ ｉ ｅ ｏ ｇ ｈ ｉ ｇ ｅ ｆ ｃｏ ｄｏ ｈ ｇ ｎ ｌ ｐ ｒｍｅ ｔ ． ｈ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｔ ｌ ｏ ｔ ８５ ｈ ａ ｅ ｈ ｓ － ａｐ
乳业科学与技术
２ １ 年第 １ ００ 期
（ 总第 １０ ） ４期
ｌ １
牛初 乳 中乳铁 蛋 白粗提工艺 的优 化研 究
罗 芳 ， 刘 成 国 ，徐 钦 ，成 亮
湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 ４ ０２ １ １８ 摘 要：利用盐析和有机溶剂沉淀相结合 的方法对 牛初乳 中的乳铁蛋白进行初步的分 离，采用单 因素试 验和 正 交试验 的方 法对 影响 分 离效 果的 因素进 行 了试验 研 究 ，研 究结 果表 明 ：用 ｐ Ｈ值 ８５ ０％的硫 酸 ．、８ 铵溶 液进 行盐 析 ，然后 用 ６ ０％的 乙醇 浓度 进 行 沉淀 ，分 离的效 果较 好 。Ｓ ．ＡＧ ＤＳＰ Ｅ凝 胶 电泳 结 果表 明 ，
能 ，增 强机 体 抗病 能 力 ；抑 制 人体 肿 瘤 细胞 的生
本 试验 的 目的是探 索 出一条 适 合 工业 化 生 产 乳 铁 蛋 白的 方法 ，通过 简 单 易 行 的硫 酸 铵沉 淀 和 有机 溶 剂 沉 淀对 牛 初 乳进 行 处 理 ，并 分 离 出乳铁
蛋 白。
长 ，具有 预 防及 治 疗肿 瘤 的作用 ；能 同多种 抗 生 素 及 抗丰 富 的牛初 乳 中提取 出 Ｌ ，把 它 作 ｆ

牛初乳中提取乳铁蛋白工艺的研究

牛初乳中提取乳铁蛋白工艺的研究
傅维琦;吴绵斌;陶银英
【期刊名称】《浙江大学学报（工学版）》
【年(卷),期】2006(040)001
【摘要】从牛初乳中分离提取乳铁蛋白,建立快速分离纯化乳铁蛋白的工艺.选择弱酸性阳离子交换剂CM-SEPHAROSE FAST FLOW装柱,脱脂牛初乳在4 ℃下进行动态吸附上柱后进行阶跃洗脱.通过对洗脱条件的比较优化,确定了分离提取乳铁蛋白的最佳工艺条件为:牛初乳料液pH 6.6,上柱速度300 mL/h,阶跃洗脱剂的体积分数分别为1.5%和5.0%的NaCl,洗脱体积流速200 mL/h.乳铁蛋白洗脱液经过超滤和冷冻干燥,得到冻干粉纯度可达98.98%,得率为29.0%.
【总页数】4页(P154-157)
【作者】傅维琦;吴绵斌;陶银英
【作者单位】浙江大学,化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027
【正文语种】中文
【中图分类】Q81
【相关文献】
1.牛初乳中乳铁蛋白粗提工艺的优化研究 [J], 罗芳;刘成国;徐钦;成亮
2.乳铁蛋白提取工艺研究及应用 [J], 李楠楠
3.从牛初乳中提取酪蛋白、免疫球蛋白、乳白蛋白、乳铁蛋白生产工艺的研究 [J], 马闯;苏政波;李瑞国;白云清;俞经福;胡和平
4.潍县萝卜中花青素的提取工艺及提取液的抗氧化活性研究 [J], 黄钰茹;魏铭芸;张妍;孙明宏;武文涛;杨延存
5.潍县萝卜中花青素的提取工艺及提取液的抗氧化活性研究 [J], 黄钰茹;魏铭芸;张妍;孙明宏;武文涛;杨延存
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初乳吸附前 pH 6. 37
Hale Waihona Puke 初乳吸附后 pH 6. 32
( LF 洗脱液) / ( g L- 1) 26. 25
L F 得率/ % 21. 5
CM- SEP HA RO SE FF
6. 84
6. 63
17. 13
29. 0
2. 2 CM-SEPHAROSE FF 与 CM-SEPHADEX C50 穿透曲线比较
( D ep ar tment of Chemical Eng ineer ing and B ioengineer ing , Zhej iang Univ er sity , H angz hou 310027, China)
Abstract: T o purify high pur it y lacto ferrin( L F) fro m bovine colost rums, a f ast separat ion t echnique w as est ablished by io n- ex chang e pro cess. Weak- acid cat ion- exchanger CM- SEPH AROSE F AST F L OW w as sel ected. At 4 , t he skim milk w as adsorbed dy nam ically t o t he ex chang er, and t hen deso rpt ion occurred in tw o stag es . T he optim al purif ying LF operat ional condit io ns w ere as t he f ollow ing : bovine colostr um s of pH 6. 6, sam ple flow- rat e of 300 m L/ h, 1. 5 % and 5. 0 % NaCl as the eluant respect ively in t he t w o st ag es and t he elut ion velocit y o f 200 mL / h. T he purit y of L F product reached 98. 98 % and t he to t al y ield of LF w as 29. 0 % . Key words: bovine co lost rum; lact of errin; ion- ex chang e; purif icat io n
表 1 CM- SEPHADEX C- 50 与 CM- SEPHAROSE FF 阶跃洗脱效果比 较
T ab. 1 Step elutio n com par ison of CM- SEPH A DEX C- 50 w ith CM- SEPH A ROSE FF
洗脱剂选择 CM- SEPH AD EX C- 50
超滤法[ 7] 虽适合大规模生产, 但还无法提取高 纯度( > 95% ) 的 L F; 色谱法[ 8] 是目前 提取高纯度 L F 的主要工艺, 但传统的方法一般是组合采用阴离 子交换色谱和分子排阻色谱, 产品成本较高, 工业化 困难. 本文通过对离子交换色谱不同洗脱工艺的优
收稿日期: 2004 07 02.
F ig . 2 Br eakthr ough cur ve of CM- SEPH A RO SE F F
2. 3. 1 不同洗脱离子的影响 利用体积分数分别 为 1. 5% 和 5. 0% 的洗脱离子进行阶跃洗脱的比较 如表 2 所示. 结果发现, N a+ 作为洗脱离子的洗脱效 果最好, L F 纯度达到 98. 98% , 得率为 29. 0% . 2. 3. 2 不同离子强度的影响 在进行阶跃洗脱的 第二步时, 将 NaCl 体积分数固定为 5. 0% , 进行第 一步 NaCl 离子强度选择优化的阶跃洗脱比较如表 3 所示. 结果发现, 当 NaCl 体积分数为 1. 5% 时, 洗脱 效果最好, L F 纯度达到 98. 98% , 得率为 29. 0% .
纯度 LF 非常有希望开发成生物天然药的原料[ 2-6] . 国内外在乳铁蛋白的结构和功能方面研究比较
深入, 而关于乳铁蛋白的分离纯化工艺的研究还比较 少. 虽然国外已经提取得到了高纯度的乳铁蛋白样 品, 但由于成本较高, 离工业化要求还有距离. 从牛初 乳中提取 LF 的工艺, 目前主要有色谱法和超滤法.
CM- SEP H AROSE C- 50 与 CM- SEP H ADEX FF 的穿透曲线见图 1 和 2, 经过比较发现, 两者的 实际吸附容量相差不大, 分别为 34. 5 g/ L 和 33. 9 g/ L . 因 此选用 CM- SEPH AROSE F F 作为离子 交 换剂是符合吸附容量要求的. 2. 3 洗脱条件优化
第 40 卷第 1 期 2006 年 1 月
浙 江 大 学 学 报( 工学版)
Journal o f Zhejiang U niv ersity ( Engineer ing Science)
V ol. 40 N o. 1 Jan . 2006
牛初乳中提取乳铁蛋白工艺的研究
傅维琦, 吴绵斌, 陶银英
7. 0的条件下, 牛初乳中质量密度最多的酪蛋白及乳 清蛋白、乳白蛋白等将带有负电荷, 而目标蛋白 L F 由于其等电点在 8. 0 附近将带有正电荷. 因此考虑 选用阳离子交换剂进行分离. 强阳离子交换剂应用 的 pH 范围广, 弱阳离子交换剂应用的 pH 范围窄. 但是强阳离子交换剂的选择性比弱阳离子交换剂的 选择性小. 故强酸性阳离子交换剂虽然可以与许多 种类的阳离子交换, 但对正电荷的胶体和高分子阳 离子都不易吸附或吸附很少. 由于牛初乳的 pH 稳 定性很好, 使用弱酸性阳离子交换剂来分离 LF 这 样的碱性蛋白质效果比较好. 初步选定 CM- SEP HADEX C- 50 ( Sof t ty pe ) 和 CM- SEPH AROSE FF ( H ard t ype) 两种离子交换介质.
浙江大学学报( 工学版) 网址: w w w . journals. z ju. edu . cn/ eng
基金项目: 浙江省科技厅资助项目( 2003C31036) .
作者简介: 傅维琦( 1982- ) , 男, 浙江湖州人, 博士生, 从事蛋白纯化研究. 通讯联系人: 吴绵斌, 男, 副教授. E-m ail : w umb @ z ju. edu . cn
从表 1 可以看 出, 相同 单位 量的 牛 初乳 原料 ( L F 体 积 浓 度 测 得 1. 05 g/ L ) 进 行 实 验, CMSEPH ADEX C- 50 作为交换剂所洗脱得到的 L F 与 CM- SEPH AROSE F AST F L OW 相比, 后者收率较 大. 而在使用相同的装柱方法时表明, CM- SEPH AROSE F AST FL OW 作为一种硬胶, 比 CM- SEP HADEX C- 50 更容易操作, 且在实验过程中体积不会 发生变化, 更利于实现工业化控制.
牛初乳是自然界免疫因子最为富集的生物资源 之一, 初乳资源的开发已越来越引起人们的兴趣, 但 目前初乳只是作为保健食品的原料, 产品中活性物 质的有效浓度不够高, 其生物活性在加工过程中损 失较大, 初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的 反映. 实际上牛初乳中很多免疫因子和生长因子具 有很大的药 用前 景, 如高 纯度 的乳 铁蛋 白 ( lact of errin, LF ) 具有很好的抗轮状病毒和艾滋病( H IV) 病毒的作用, 而且还具有很好的抗肿瘤作用[ 1] . L F 在初乳中的质量密度要比常乳高 10~ 100 倍, 可达 到 1. 00 g / L , 因此若能开发出合理的分离路线, 高
较优化, 确定了分离提取乳铁蛋白的最佳工艺条 件为: 牛初乳料液 pH 6. 6, 上柱速度 300 mL / h, 阶跃洗脱剂的体积
分数分别为 1. 5% 和 5. 0% 的 N aCl, 洗脱体积流速 200 mL / h. 乳铁蛋白洗脱液经过超滤和冷冻干燥, 得到冻干粉纯
度可达 98. 98% , 得率为 29. 0% .
对 CM- SEP H AROSE F AST FL OW 装柱进行
洗脱条件的优化.
图 1 CM- SEPHADEX C- 50 穿透曲线 F ig .1 Breakthrough curve of CM- SEPHADEX C- 50
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浙 江 大 学 学 报( 工学版)
第 40 卷
图 2 CM- SEPHAROSE FF 穿透曲线
1. 3 分析方法 利用放射免疫扩散法[ 9] 测定牛初乳中 L F 的含
量; SDS- P A G E 电 泳[ 10] 对 L F 进 行 鉴 定; 运 用 H P LC[ 11] 对 LF 进行定量纯度检测.
2 结果与讨论
2. 1 离子交换剂的选择 由牛初乳的理化性质可知, 当其 pH 在 6. 5~
( 浙江大学 化学工程与生物工程学系, 浙江 杭州 310027)
摘 要: 从牛初乳 中分 离 提取 乳 铁 蛋白, 建 立 快 速分 离 纯化 乳 铁 蛋白 的 工艺. 选择 弱 酸 性 阳离 子 交 换 剂 CM-
SEP HA RO SE F A ST FL OW 装柱, 脱脂牛初乳在 4 下进行动态吸附上柱后进行 阶跃洗脱. 通过对 洗脱条件的 比
第1期
傅维琦, 等: 牛初乳中提取乳铁蛋白工艺的研究
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化, 得到了采用一步离子交换色谱法分离高纯度 L F 的新工艺, 简化了分离路线和提取成本, 为以后高纯 度 LF 的产业化打下了基础.
1 材料与方法
1. 1 主要材料 牛初乳: 乳牛产犊后 72 h 内收集, 由杭州双峰
牧场提供; CM- Sepharo se F F: Phar macia ( U ppsala, Sw eden) 公司产 品; CM- Sephadex C- 50: Pharmacia ( Uppsala, Sw eden) 公司产品; LF 标样: ICN Biom edical Inc( Ohio, U SA) 公司产品. 1. 2 实验方法 1. 2. 1 工艺路线 原料乳过滤→脱脂→离子交换 层析→洗脱液→超滤浓缩→冷冻干燥 1. 2. 2 实验步骤 脱脂: 使用 T DL- 5000B 冷冻离 心机( 上海安亭科学仪器厂) 在- 4~ 4 进行离心 脱脂 30 min. 离子交换层析采用 Bio- Red 的 Biolo gic LP 系 统 ( 柱 型 1. 6 cm 50 cm ) , 脱 脂 乳 以 300 mL / h的流速在 4 条件下动态上柱吸附 8 h. 先用 去离 子水 以 200 mL / h 的流 速 进行 平衡, 约 10 h; 然后用质量分数为 1. 5% 的 NaCl 洗脱, 约需 5 h, 待杂蛋白被洗脱下来, 基线再度走平后, 使用质 量分数为 5. 0% 的 NaCl 溶液洗脱, 两步洗脱速度均 为 200 mL / h, 洗脱剂 pH 在 6. 7 左右, 洗脱产物为 LF , 出峰时间为 1 h 左右. 超滤浓缩: 利用 Labscale T F F Syst em( Millipore, U SA) , 采用截流相 对分子 量为5 000聚 砜膜 的超 滤膜. 冷 冻干 燥: 利 用 ALP H A1- 2L D 真空冷冻干燥机( mart in christ , germany) 进行- 55 冷冻干燥.