一种抗原具有多种抗原决定簇

多抗制备的基本流程
多克隆抗体的制备，即多抗制备，是一种获取具有多种抗原决定簇抗体的方法。

基本流程如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备具有多种抗原决定簇的抗原。

这些抗原可以是蛋白质、多肽、糖、脂类等生物大分子或小分子。

2. 动物免疫：将制备好的抗原注射到动物体内，激发其免疫系统产生抗体。

常用的免疫动物有兔子、小鼠、大鼠等。

3. 收集血清：在免疫动物后，收集其血清。

血清中含有多种抗体，即多克隆抗体。

4. 抗体的分离和纯化：将收集的血清进行分离和纯化，以获得目标抗体。

常用的方法有离心、层析、电泳等。

5. 鉴定和评价抗体：通过酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫荧光等方法，对分离出的抗体进行鉴定和评价，确定其特异性和灵敏度。

6. 抗体应用：经过鉴定和评价后的多克隆抗体可应用于生物医学研究、诊断、治疗等领域。

需要注意的是，多克隆抗体的制备过程较为复杂，涉及多个环节，如抗原制备、动物免疫、血清收集等。

在实际操作中，需严格控制实验条件，以确保制备出的多克隆抗体具有较高的质量和应用价值。

抗原、抗体、免疫标记介绍免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。

在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。

1.1　抗原 抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。

抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。

在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。

能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质。

小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原（hapten）。

例如某些激素、药物等。

抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenic determinant），或称为表位（epitope）。

一个抗原分子可带有不同的决定簇。

1.2　抗体1.2.1　抗体的结构 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。

Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。

与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。

Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。

Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。

五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。

IgG和IgM 的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。

IgG的结构见图。

IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。

每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。

另一区段称Fc 段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。

IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab''）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。

IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。

IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000。

免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。

由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。

制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。

因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。

测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。

第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。

Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。

可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。

在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。

【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。

一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。

2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。

第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。

考试题型：填空题，选择题，名词解释（4题），问答题（3题）《免疫学实验》复习题1、多克隆抗体：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。

所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。

2、免疫血清：将抗原注入机体所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，含有这种特异性抗体的血清。

3、再次应答：免疫系统对感染病原的首次入侵产生记忆作用，在相同病原体再次入侵时，产生更快和更强的应答，称之为再次免疫应答。

4、补体溶血反应:动物接受异种红细胞注射而免疫，于血清中产生特异性抗体（即溶血素），此红细胞与相应特异抗体结合，在电解质存在时能发生凝集，若再有补体参与，红细胞则被溶解，称溶血反应。

5、ELISA：即酶联免疫吸附试验，是一种把抗原抗体反应的特异性和酶的专一高效催化底物的能力通过化学方法两者相结合后，再将可溶性抗原或抗体吸附在固相载体上，使免疫反应在载体上进行，然后借助特异结合的标记抗体上显示的酶活性，通过测定酶催化底物所得的产物来判断抗原或抗体的量。

6、包被：抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。

7、封板：包被好的固相载体表面常留有少量未吸附位点，可非特异地吸附测定时加入的标本和酶标记物中的蛋白质，导致本底偏高。

因此需用1％～5％牛血清白蛋白或5％～20％小牛血清等包被一次，消除上述干扰，此过程称为封闭。

8、直接凝集反应：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。

9、间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联与免疫无关大小适当的颗粒性载体的表面，使之成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应。

10、E玫瑰花环试验：正常人的T淋巴细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽相结合的受体（E受体），即CD2分子，是T细胞所特有的表面标志，在体外一定条件下T细胞能直接与SRBC结合，形成玫瑰花样细胞团，称为E花环。

抗原的认识摘要：抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。

抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。

是引起所有免疫反应开始的物质。

关键词：抗原；免疫应答；开始Antigen awarenessAbstract: antigen, can stimulate the body to produce immune response (specificity) and product antibodies and sensitized lymphocytes immune response occurred in vivo immune effector substances (specific response). There are two basic characteristics of the antigen, First, the ability to induce the immune response, that is, the immunogenicity, the second is the product reacts with the immune response, that is antigenic. Is caused by the start of all immune responses.Keywords: antigen; immune response; begin一、抗原的概念抗原是一类诱导机体免疫应答并能与相应抗体或T细胞手提发生特异反应的物质。

这些物质对机体来说是外源的，即非自身的，但在特定条件下，机体某些自身成分也能被免疫系统当成抗原来识别。

一个抗原可有多个抗原决定簇。

抗原有完全抗原、不完全抗原和超抗原。

凡具有免疫原性和对抗体或致敏淋巴细胞起反应的物质称为完全抗原，如细菌、病毒和大分子蛋白质等。

抗原决定簇的概念及数量
抗原决定簇，也称为抗原表位，是一种存在于抗原分子表面的结构域，是免疫系统所识别和结合的部分。

抗原决定簇有助于识别和区分不同的抗原，从而触发和调节免疫反应。

抗原决定簇的数量是多种多样的，取决于抗原分子的复杂性和特征。

通常情况下，一个较小的抗原会具有一个或几个较小的决定簇，而一个较大的抗原则可能有多个决定簇。

不同类型的抗原决定簇分为线性决定簇和立体决定簇。

线性决定簇是由抗原表面上连续的氨基酸残基组成，它们可以通过多肽序列的顺序被结合和识别。

立体决定簇则是由分散在抗原分子表面上的氨基酸残基组成，它们通过彼此相互作用的三维空间结构来被免疫系统所识别和结合。

抗原决定簇的数量对于免疫系统的识别和免疫应答起着重要的作用。

一个具有多个决定簇的抗原可以被不同的免疫细胞识别，从而引发更强烈的免疫反应。

此外，多个决定簇也可以增加免疫系统对抗原的特异性，使其能够更好地区分不同的抗原。

在疫苗研发和免疫诊断中，对抗原决定簇的认识和研究也起着重要的作用。

通过了解抗原决定簇的数量和位置，科学家可以设计和选择更有效的疫苗，以产生更好的免疫效果。

此外，利用抗原决定簇的特异性，可以开发出高效的诊断试剂，
用于检测和识别特定的病原体。

总结起来，抗原决定簇是存在于抗原分子表面的结构域，用于免疫系统的识别和结合。

其数量取决于抗原分子的复杂性和特征，有助于免疫系统区分不同的抗原并触发免疫反应。

对抗原决定簇的研究对于疫苗研发和免疫诊断具有重要意义。

第一章抗原1．抗原：是一类能刺激机体的免疫系统产生特异性免疫应答，并能与免疫应答的产物在体内外发生特异性结合的物质。

2．抗原决定簇：存在于抗原分子表面，决定抗原特异性的特殊化学基因，又称表位，它的种类、数目、空间构型决定了抗原的特异性。

（一个抗原分子可以有一种或多种不同的抗原决定簇AD）3．免疫原性：是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答的性质4．抗原结合价：是指能和抗体分子结合的抗原决定簇的总数。

5．抗原性：指抗原分子与免疫应答产物发生特异性结合的性质6．半抗原：又称不完全抗原，无免疫原性，只有抗原性的物质。

7．载体：载体赋予半抗原以免疫原性的蛋白质8．异物性：异物性是指来源于体外的抗原，绝大多数抗原属于异物，但也存在自身抗原。

是免疫原性的核心。

9．特异性：抗原特异性的物质基础是抗原决定簇（亦称表位）11.超抗原（SAg）：某些抗原与MHC-Ⅱ类分子结合以后，与TCR Vβ链结合，只需极低浓度，即可激活大量的T细胞克隆，产生极强的免疫应答效应。

12.载体效应：在免疫应答中，B细胞识别半抗原，并提呈载体给Th细胞，Th细胞活化后再辅助激活B细胞，即以载体把特异T-B细胞连接起来，T细胞才能激活B细胞，称载体效应（B细胞识别半抗原决定簇，是抗体产生细胞，T细胞识别载体决定簇，辅助B细胞产生抗体）13.共同抗原：两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇。

14.类属抗原：亲缘关系很近的生物之间存在的共同抗原称为类属抗原15.异嗜性抗原：是指在无种属关系生物间存在的共同抗原。

16.交叉反应：指抗体除与其相应的抗原反应发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。

1．抗原表面能与相应抗体结合的特殊化学基因称为表位或抗原决定簇2．抗原决定簇的化学组成，排列，空间结构决定着抗原的特异性。

3．半抗原具有免疫反应性，而无免疫原性，半抗原与载体结合后成为完全抗原，具有免疫原性。

免疫学一.填空题（每空0.5分，共15分）1.B淋巴细胞系前体细胞在哺乳动物的___骨髓____或在家禽___法氏囊____增殖发育为B细胞。

2.特异性免疫应答可分为B细胞介导的____体液免疫___和T细胞介导的____细胞免疫__两种类型。

3.机体初次体液免疫反映最先出现的Ig 类别是__IgM__。

亲细胞的Ig类别是______。

唯一能通过胎盘的Ig 类别是__ IgG___。

4.机体免疫应答过程是通过三个阶段完毕的，第一阶段为_致敏阶段，第二阶段为__反映阶段_，第三阶段为效应阶段5.II型变态反映又称为__细胞毒型_型变态反映，III型变态反映又称为_免疫复合物型_型变态反映。

6.举出两种与标记抗体有关的血清学反映_荧光免疫实验__、_酶联免疫吸附实验_。

7.常见的T细胞亚群有__辅助性_T细胞、___细胞毒性_T细胞和克制性T细胞。

8.参与I型变态反映的细胞为_嗜碱性粒细胞_、___肥大细胞__。

9.α干扰素（IFN-α）来源于_白细胞_；β干扰素（IFN-β）来源于_成纤维细胞_。

10.机体非特异性免疫的构成涉及_皮肤、粘膜_屏障、血脑、血胎、血睾屏障、正常菌群、炎症和吞噬作用以及正常体液因素。

11.一个TD抗原分子表面具有_多个__不同的抗原决定簇，一个抗原决定簇可诱导机体产生一种_抗体_。

12.T淋巴细胞又称为_胸腺_依赖性淋巴细胞，它是由_胸腺诱导素诱导、分化而来的。

13.经木瓜蛋白酶水解后的Ig单体分子，其中仍能保持与抗原分子结合的片段简称为_ Fab _片段，另一部分称为_ Fc片段。

14.ADCC是_ K _细胞与结合靶细胞的特异性IgG的_ Fc _片段结合后，释放穿孔素、颗粒酶等发挥细胞毒作用，破坏靶细胞。

1. 免疫的三大功能涉及：免疫防御、_自身稳定、_免疫监视。

2.在获得性免疫中_人工自动_免疫的连续时间长，__人工被动_免疫连续时间短。

3.哺乳动物的中枢免疫器官是___骨髓__、___胸腺_。

抗原设计原理为产生有效的抗体，第一步是设计好的抗原，此抗原可以来源于整个蛋白质的一部分：一个或几抗原决定簇区域的序列。

（1） 什么是抗原决定簇？蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

（2） 选择抗原决定簇为选择好的抗原决定簇，应符合以下三点：1．亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的；2．处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合；3．有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N端及C端是很好的抗原决定簇区域。

（3） 抗原性与免疫原性单独的抗原决定簇是不能产生免疫反应，它只有抗原性但没有免疫原性，为使它能具有免疫原性，它必须偶联在载体蛋白上。

（4） 抗原决定簇的预测对每个氨基酸的表面可接触性(Surface Accessibility)、亲水性(Hydrophilicity)和弹性(flexibility)进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域，抗原决定簇区域应综合以上三个特点。

目前市面上有几个专业测定软件满足需要：如MacVestor , Protean , GCG等。

（5） 设计合成多肽一旦抗原序列决定后，接下来就是设计所需合成的多肽了，设计时除了注意其序列外，同时应考虑一些产生免疫机制问题，如：1．载体蛋白的接入位置；2．如果其序列是位于蛋白C端的，此多肽C端一定是自由的羧基团，而N端被掩盖。

同时如果载体蛋白是通过半胱氨酸偶联，此半胱氨酸应处于N端位置，使C端完全暴露给免疫系统。

3．相反，如果其序列是位于蛋白质N端，此多肽C端应掩盖，暴露出N 端，而载体蛋白应在C端。

（6） T细胞抗原决定簇不是所有多肽序列是用来直接产生抗体的，特别是一些序列短、并通过多抗原肽系统获得的免疫原性的肽。

而这些是通过T辅助细胞抗原决定簇来产生免疫。

一个T辅助细胞抗原决定簇多肽序列可以增强B细胞产生抗体能力，但是又是由其遗传背景所决定的，设计此类多肽必须知道其抗原决定簇和被免疫动物的遗传背景。