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抗原决定簇选择

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抗原表位.ppt

抗原表位.ppt
❖ 抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合， 从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。
❖ 抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。
C
抗原分子以其B细胞表位与抗体分子的抗原结合部位发生互补性结合 A.抗原--抗体复合物的立体构象； B.采用电脑技术将抗原和抗体分子分开，可见抗原和抗体分子的相互作用仅发生 在抗原分子的B细胞表位和抗体分子的抗原结合部位之间，两者呈现结构互补。 C.抗体的互补决定区与抗原表位结合示意图
抗原表位的确立 与选择（一）
报告内容
1
概念
2
研究意义
3
研究方法
抗原表位--定义
❖ 抗原表位，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，是 指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，因而表位代 表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫 细胞表面的抗原受体结合。严格说来，抗体的特异性是针对 表位而不是针对完整的抗原分子的。
✓ 对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相 载体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一 定条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结 合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段 以确定结果。
❖ 近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地 确定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原 表位。
❖ 该法研究表明，疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献。 ❖ 缺点是其所用的数据库有限，并且连续位点内的残基被认为
是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低 相关性。

抗原决定簇

抗原决定簇

免疫功能是免疫系统在识别和清除“非己”抗原的 过程中所产生的各种生物学作用的总称。主要包括：
1.免疫防御（Immune defence) 2.免疫自稳(Immune homestasis) 3.免疫监视(Immune surveillance)
功能
生理性（有利）
病理性（有害）
免疫防御
抵御病原微生物的侵袭
抗原结合价：指一个抗原分子上能与相应抗体分 子结合的抗原决定簇的总数
抗原决定基的类型
线性表位、构象表位
T细胞表位与B细胞表位特性比较
T细胞表位
B细胞表位
表位结构 线性决定基
构象/线性决定基
表位性质 经过加工处理的多肽片断 天然多肽、多糖、LPS等
表位大小 5~12个氨基酸（CD8+T细胞） 5~15个氨基酸、5~7个单
在某些情况下，抗原也可以表现为特异性的 负免疫应答，称为免疫耐受（immune tolerance）
有时，抗原还可能引起病理性的免疫应答即 超敏反应（hypersensitivity）
上述抗原分别被称为(rolerogen)性 异物性是指抗原与自身万分相异或与宿
共同抗原：带有共同决定簇的抗原称为～。
类属抗原：存在于同一种属或近缘种属间的 共同抗原，称为～。
异嗜性抗原：指不同种属生物之间的共同抗 原。
交叉反应：由共同抗原决定簇刺激机体产生 的抗体，可以和所有带有此决定簇的共同抗 原起反应，这种反应称为～。
第三节 几种重要的抗原
抗原决 定簇
TD -Ag
T细胞
超敏反应、易受感染或免疫缺陷病
免疫稳定 免疫监视
清除损伤或衰老的细胞 清除复制错误/突变的细胞
自身免疫性疾病 细胞癌变或持续性病毒感染

抗原表位

抗原表位
❖ 抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合， 从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。
❖ 抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。
C
抗原分子以其B细胞表位与抗体分子的抗原结合部位发生互补性结合 A.抗原--抗体复合物的立体构象； B.采用电脑技术将抗原和抗体分子分开，可见抗原和抗体分子的相互作用仅发生 在抗原分子的B细胞表位和抗体分子的抗原结合部位之间，两者呈现结构互补。 C.抗体的互补决定区与抗原表位结合示意图
❖ 用此法检测的抗原表位有人H铁蛋 白、蓝舌病病毒的外壳蛋白VP5等
。
研究方法
3 缩氨酸扫描技术 (Peptide Scan technology)
❖ 此技术于1992年由R. Frank发展出来，它主要是将涵盖所有 抗原氨基酸序列的缩氨酸合成于固定的表面，并与抗血清标 定，此法可鉴定线性抗原表位。
❖ 对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相 载体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一 定条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结 合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段 以确定结果。
❖ 近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地 确定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原 表位。
❖ 从软件预测出的抗原表位须用实验来进一步验证。
B 细胞构象表位的预测
❖ 以往合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位，这无疑会遗漏众 多的构象性表位信息。近些年来,随着生物信息学和分子生物学 技术的飞速发展，采用计算机预测和试验相结合的方法进行构 象性表位分析和定位得到了迅速发展，一些可用的基于Web的 预测软件已经公布，如 CEP软件、DiscTope 软件和 MEPS软件 。

抗原决定簇

抗原决定簇
自身抗原、异嗜性抗原。 4. 根据对胸腺（T细胞）的依赖性 分为胸腺依赖
性（TD）抗原和非胸腺依赖性（TI）抗原。 5. 根据化学性质 可分为蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、
脂质、多糖、脂多糖和核酸抗原。
重要的抗原
1. 微生物抗原 具有较强的抗原性，一般都能刺激机 体产生抗体。
细菌抗原：菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）、荚 膜抗原（K）和菌毛抗原、类毒素；
抗原的交叉性有三种情况： ① 不同物种间存在共同的抗原组成； ② 不同抗原分子存在共同的抗原表位； ③ 不同表位之间有部分结构相同。
抗原的分类
1. 依据抗原的性质 可分为完全抗原和不完全抗原
（即半抗原）。 2. 根据与抗原加工和递呈的关系 可分为外源性抗
原与内源性抗原。 3. 根据抗原来源 分为异种抗原、同种异型抗原、
在成熟的B细胞表面具有抗原受体（BCR），其 成分之一称为膜表面免疫球蛋白（mIg）。
抗体的基本结构
所有种类Ab的单体分子结构呈“Y”字形的分子。IgM是以 五个单体分子构成的五聚体，分泌型的IgA是以两个单体 构成的二聚体，其他Ab均以单体分子形式存在 。
抗体的功能区 VH-VL：抗体分子结合抗原的所在部位。决定抗体分子的
病毒抗原：囊膜抗原、衣壳抗原、核蛋白抗原等； 真菌、寄生虫都具有相应的特异性抗原。 保护性抗原、超抗原（superantigcn，SAg），如
金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素。 2. 非微生物抗原 主要有ABO血型抗原、动物血清与
组织浸液、酶类物质和激素。 3. 人工抗原 人工抗原包括合成抗原与结合抗原。
由感染病原微生物引起的免疫复合物迟发型t细胞与巨噬细胞jonesmote接触性结核菌素和肉芽肿抗感染免疫包括先天性免疫获得性免疫根据不同的病原体可将其分为抗细菌免疫抗病毒免疫抗真菌免疫抗寄生虫免疫等参与先天性免疫应答的因素多种多样主要有机体的解剖屏障可溶性分子与膜结合受体炎症反应nk细胞吞噬细胞等在抗微生物感染中起关键作用其效应比先天性免疫强分为体液免疫和细胞免疫

抗原表位

抗原表位

B细胞表位
BCR
无需
天然的多肽、多糖、脂 多糖、有机化合物 5-15个氨基酸，5-7个 单糖或5-7个核苷酸 构象、线性表位
表位位置
抗原分子任意部位
抗原分子表面
表位是蛋白质抗原性的基础 ，研究蛋白质抗原表位 ， 对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型 疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。
应用：多在诊断与疫苗的研究中,尤其是在制作良好 的特异性诊断试剂盒中更为重要。
构象50-200个 氨基酸 线状
10-20个氨基酸
必须建立肽库 完全绘制3-15
5 抗原表位的预测法
从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的 方法以来，已有许多参数、算法发表，对B细胞蛋白抗原表 位研究起到巨大的推动作用。现已被大众认可并具有较好预 测效果的方法，主要有以下6种：
(1)亲水性方案(Hydrophilicity)
Nozaki-Tanford scale，Eisenberg scale，KyteDoolittle scale，HPLC scale，Hopp-Woods scale
Hopp-Woods 方案认为：蛋白质抗原的氨基酸残基可分为 疏水性和亲水性两类。在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白 内部，而亲水性残基位于表面，因此蛋白的亲水部位与蛋白 抗原表位有密切的联系。
在研究构象性表位时的minotopes方法即采用类似的方法，通常从二肽 开始合成并逐渐增加肽链长度及置换氨基酸种类，直至达到与抗体的最 大结合为止。
研究方法
2.2 基因工程法（噬菌体随机肽筛选法）
该法先利用基因克隆技术将合成的 一组寡核苷酸混合物（小肽基因混 合物）克隆至线性噬菌体基因组中 ，使之以融合蛋白的形式在噬菌体 的外壳蛋白的氨基端表达。再利用 生物素或酶标记的抗体筛出特异的 噬菌体，并进行扩增，再筛选，从 结合特异抗体的噬菌体DNA序列推 断出氨基酸序列，并合成相应的短 肽，验证筛选结果。

抗原决定簇

抗原决定簇

抗原设计原理为产生有效的抗体，第一步是设计好的抗原，此抗原可以来源于整个蛋白质的一部分：一个或几抗原决定簇区域的序列。

（1） 什么是抗原决定簇？蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

（2） 选择抗原决定簇为选择好的抗原决定簇，应符合以下三点：1．亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的；2．处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合；3．有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N端及C端是很好的抗原决定簇区域。

（3） 抗原性与免疫原性单独的抗原决定簇是不能产生免疫反应，它只有抗原性但没有免疫原性，为使它能具有免疫原性，它必须偶联在载体蛋白上。

（4） 抗原决定簇的预测对每个氨基酸的表面可接触性(Surface Accessibility)、亲水性(Hydrophilicity)和弹性(flexibility)进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域，抗原决定簇区域应综合以上三个特点。

目前市面上有几个专业测定软件满足需要：如MacVestor , Protean , GCG等。

（5） 设计合成多肽一旦抗原序列决定后，接下来就是设计所需合成的多肽了，设计时除了注意其序列外，同时应考虑一些产生免疫机制问题，如：1．载体蛋白的接入位置；2．如果其序列是位于蛋白C端的，此多肽C端一定是自由的羧基团，而N端被掩盖。

同时如果载体蛋白是通过半胱氨酸偶联，此半胱氨酸应处于N端位置，使C端完全暴露给免疫系统。

3．相反，如果其序列是位于蛋白质N端，此多肽C端应掩盖，暴露出N 端，而载体蛋白应在C端。

（6） T细胞抗原决定簇不是所有多肽序列是用来直接产生抗体的，特别是一些序列短、并通过多抗原肽系统获得的免疫原性的肽。

而这些是通过T辅助细胞抗原决定簇来产生免疫。

一个T辅助细胞抗原决定簇多肽序列可以增强B细胞产生抗体能力，但是又是由其遗传背景所决定的，设计此类多肽必须知道其抗原决定簇和被免疫动物的遗传背景。

三、抗原决定簇


二、构成免疫原的条件
（一）异源性 1、异种物质 2、同种异体物质:如血型抗原 3、改变和隐蔽的自身物质（自身抗原）
（二）理化性状 1、分子大小 2、化学组成、分子结构和立体构象的复杂性 3、物理状态
三、抗原决定簇
（一）基本概念 1、抗原决定簇(antigen determinant)：抗原分子表面 具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团称为抗原 决定簇或抗原决定基，也称表位(epitopes) 2、构象决定簇和顺序决定簇 3、功能性决定簇和隐蔽的决定簇
PRRSV病毒粒子结构示意图
问题：下列各物质是否是好的免疫原，为什么？ 在什么情况下可以改变成好的免疫原？
1.化学药物注入机体。 2.铁钉刺入皮肤。 3.自身蛋白质。 4.牛奶给狗喝。 5.牛奶注入狗的皮下。 6.细菌病毒感染家禽。 7.细菌死苗投喂给猪。 8.gene-表达-产物-Ab。该表达蛋白具有很好的抗原性。
2、载体效应：半抗原与载体结合后首次免疫动物， 可测得半抗原的抗体，出现初次反应,但当第 二次免疫时，半抗原连接的载体只有和首次 免疫所用的载体相同时，才会有再次反应， 这种现象称为载体效应。
四、抗原的特异性与交叉性
（一）基本概念 1.特异性：一种抗原只能引起机体产生相应抗体，此抗
体也只能与相应抗原发生结合。
亚单位即CH1，CH2和CH3组成 （2）功能：表现各自的功能。 结合补体(CH2)，粘附C(CH3)，通过胎盘和粘膜，遗传标志的
五类免疫球蛋白
第二节 Ig的分子结构
一、Ig单体的分子结构
1.基本结构：
四条对称 多肽链
2 重链（H链） 450aa：50Kd
2 轻链（L链） 214 aa：25Kd
-S-SL-H-H-L

抗原表位

抗体多趋于碱性。
抗原表位的预测法


(6)二级结构预测方案(Secondary structure) 认为β转角结构为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，利 于与抗体嵌合，较可能成为抗原表位。而α螺旋、β片层结构 规则不易形变，较难嵌和抗体，一般不作为抗原表位。 可预测蛋白质β转角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等 方法。其中各种方法预测的成功率均不超过65%。一般认为 Cohen方法对转角的预测正确率很高，对于已知折叠类型的 蛋白质(αα类，ββ类，α/β类)正确率高达95%，对于未知结 构类型的蛋白质，可用3种类型分别预测，3类预测一致的转 角对预测表位有帮助。


水解后采用各种分离方法如SDS-PAGE、凝胶过滤、离子交换将水解片 段分开，然后用Western blot，ELISA等各种检测手段来检测。结果可通 过理论肽段分子量的推断或相应的氨基酸序列分析来判断。
利用该法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱酯酶、 玻璃体结合蛋白、磷脂酶基质蛋白等。
分类

按表位结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。
连续性表位又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成 通常这种结合比较弱，因为小肽并不含完整天然蛋白的构象，
在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位的一部分。对其
研究依赖于多肽固相化学合成技术。 后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续 的氨基酸组成。

研究方法


1.2 水解抗原-抗体复合物
这是一个直接的确定线性及构象性抗原表位的方法，又称为Protein footprinting。其理论依据为抗原--抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水 解。 根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。 对于蛋白酶水解位点较少的抗原，一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反 应，然后酶解，SDS-PAGE分离水解产物，分析结果。 对于蛋白酶水解位点较多的抗原，采用HPLC法，将抗原--抗体复合物的酶 解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰 高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。 对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相 载体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一 定条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结 合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段 以确定结果。 近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地 确定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原 表位。

医学课件抗原决定簇的确立和选择


抗原表位--分类
❖ 覆盖型和非覆盖型表位
某些抗原分子表面，不同表位之间相对分离，各自结合 特异性抗体，互不影响，这类表位被称为非覆盖型表位。
若某一表位与相应抗体结合会影响另一表位与抗体的结合， 此类表位称为覆盖型表位。
❖ 功能性和隐蔽表位
位于抗原分子表面的表位易被相应淋巴细胞所识别，即具 有易接近性，可直接启动免疫应答，故称为功能性表位。
根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。
✓ 对于蛋白酶水解位点较少的抗原，一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反 应，然后酶解，SDS-PAGE分离水解产物，分析结果。
✓ 对于蛋白酶水解位点较多的抗原，采用HPLC法，将抗原--抗体复合物的酶 解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰 高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。
➢ 后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续 的氨基酸组成。
分类
按照与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细 胞抗原表位。
特性
T细胞表位
B细胞表位
表位分子
TCR
BCR
MHC分子 表位性质 表位大小 表位类型
必需
主要是线性多肽 8-12氨基酸(CD8-TC) 12-17氨基酸(CD4-TC) 线性表位
❖ 一般情况下，一个多肽表位含5~6个氨基酸残基；一个多糖 表位含5~7个单糖；一个核酸半抗原的表位含6~8个核苷酸。
❖ 抗原表位的大小与相应抗体的抗原结合部位相适合。
❖ 一个抗原表位的特异性由组成它的所有残基共同决定，但其 中有些残基在与抗体结合时比其它残基起更大作用，这些残 基被称为免疫显性基团。
存在于抗原分子内部的表位无直接触发免疫应答的功能， 称为隐蔽表位。若通过理化因素处理抗原，使其结构发生改变， 内部的隐蔽表位被暴露，可能成为新的有功能的表位。

蛋白抗原表位预测算法及抗原多肽设计原则

蛋白抗原表位预测算法及多肽抗原设计原则概述为了获取识别天然蛋白的抗体，有两种方式可以选择。

一种是利用重组蛋白的方式获取尽可能接近天然条件下的重组蛋白，然后刺激试验动物免疫系统，进而获取相应抗体。

这种方式获取抗体的成功率较高且效价较好；另一种是预测天然蛋白的抗原决定簇，这种抗原决定簇最终体现为多肽形式，将其与相应的载体偶联后刺激试验动物免疫系统，也可以获取相应的抗体。

这种方式的选择有其特殊需要。

我们德泰生物科技南京有限公司提供这两种类型的抗体定制服务。

什么是抗原决定簇蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由 6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

蛋白抗原表位预测方法目前蛋白质抗原表位预测的方法大致可以分为两类，一类是基于蛋白质高级结构预测，像beta‐转角、膜蛋白跨膜区预测等；一种是基于氨基酸的统计学倾向性，像亲水性（hydrophilicity）、弹性（flexibility）、表面可接触性（surface accessibility）、抗原倾向性（antigenic propensity）。

具体算法请参考相关文献，部分文献如下：1)Chou, Fasman Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1978;47:45‐148.2)Hopp, T.P. and Woods, K.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824‐3828.3)Welling, G.W., Weijer, W.J., van der Zee, R. and Welling‐Wester, S. (1985) FEBS Lett. 188,215‐218.4)Karplus PA, Schulz GE. Naturwissenschafren 1985; 72:212‐3.5)Emini EA, Hughes JV, J Virol. 1985 Sep;55(3):836‐9.6)Parker, J.M.R., Guo, D. and Hodges, R.S. (1986) Biochemistry 25, 5425‐5432.7)Schmidt, A.M. (1989) Biotect. Adv. 7, 187‐213.8) A.S. Kolaskar and Prasad C. Tongaonkar (1990) FEBS 092109)K. Hofmann & W. Stoffel (1993)10)Paul Horton, Keun‐Joon Park, Takeshi Obayashi & Kenta Nakai, Proceedings of the 4th AnnualAsia Pacific Bioinformatics Conference, Taiwan. pp. 39‐48, 2006.11)Jens Erik Pontoppidan Larsen, Ole Lund and Morten Nielsen. Immunome Res. 2006选择多肽抗原的方法不同算法预测出的候选多肽序列有所不同，需要综合考虑各种预测方法，同时结合实际应用进行最终选择。

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表位类型
表位位置
线性表位
抗原分子任意部位
构象、线性表位
抗原分子表面
研究意义

表位是蛋白质抗原性的基础 ，研究蛋白质抗原表位 ， 对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型 疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。 应用：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在诊断与疫苗的研究中,尤其是在制作良好 的特异性诊断试剂盒中更为重要。

抗原表位研究方法


水解后采用各种分离方法如SDS-PAGE、凝胶过滤、离子交换将水解片 段分开，然后用Western blot，ELISA等各种检测手段来检测。结果可通 过理论肽段分子量的推断或相应的氨基酸序列分析来判断。
利用该法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱酯酶、 玻璃体结合蛋白、磷脂酶基质蛋白等。

研究方法


1.2 水解抗原-抗体复合物
这是一个直接的确定线性及构象性抗原表位的方法，又称为Protein footprinting。其理论依据为抗原--抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水 解。 根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。 对于蛋白酶水解位点较少的抗原，一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反 应，然后酶解，SDS-PAGE分离水解产物，分析结果。 对于蛋白酶水解位点较多的抗原，采用HPLC法，将抗原--抗体复合物的酶 解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰 高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。 对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相 载体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一 定条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结 合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段 以确定结果。 近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地 确定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原 表位。
抗原决定簇的确 立与选择（一）
报告内容
1
概念
2
研究意义
3
研究方法
抗原表位--定义

抗原表位，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，是 指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，因而表位代 表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫 细胞表面的抗原受体结合。严格说来，抗体的特异性是针对 表位而不是针对完整的抗原分子的。 抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合， 从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。 抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。

研究方法--表位作图
推荐使用表位作图方法和基本条件
方法 构象表位 线性表位 条件 精确度
竞争分析方法
是，但并非经常
是
标记抗体、抗 原 必须克隆， DNA(已知基因 序列) 必须建立肽库
仅确定空间位 置竞争 构象50-200个 氨基酸 线状 10-20个氨基酸 完全绘制3-15
基因片段表达 法
指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽链骨架有一定程度
的活动性，活动性强的氨基酸残基即可塑性大的位点，易形 成抗原表位。Karplas 和Schulz基于已知结构的31个蛋白质， 发展了一种预测蛋白质片段活动性的方法。


(5)电荷分布方案(Charge distribution)
认为对碱性抗原特异的抗体多趋于酸性，对酸性抗原特异的
是，但并非经常
是
合成肽库法
否
是
研究方法
5 抗原表位的预测法

从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的 方法以来，已有许多参数、算法发表，对B细胞蛋白抗原表 位研究起到巨大的推动作用。现已被大众认可并具有较好预 测效果的方法，主要有以下6种：
抗原表位的预测法

(1)亲水性方案(Hydrophilicity)
Nozaki-Tanford scale，Eisenberg scale，Kyte-Doolittle scale，HPLC scale，Hopp-Woods scale Hopp-Woods 方案认为：蛋白质抗原的氨基酸残基可分为疏 水性和亲水性两类。在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白内 部，而亲水性残基位于表面，因此蛋白的亲水部位与蛋白抗 原表位有密切的联系。 Hopp-Woods方案是以残基由有机相环境转移到水相环境的 自由能为依据计算各个氨基酸的亲水性。现已明确，亲水性 部位与抗原表位并无很好的一致性，即高亲水性部位不一定 是表位，表位也不一定是亲水性部位。
分类
按照与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细 胞抗原表位。
特性 表位分子 MHC分子 表位性质 表位大小 T细胞表位 TCR 必需 主要是线性多肽 8-12氨基酸(CD8-TC) 12-17氨基酸(CD4-TC) B细胞表位 BCR 无需 天然的多肽、多糖、脂 多糖、有机化合物 5-15个氨基酸，5-7个 单糖或5-7个核苷酸

B 细胞构象表位的预测

以往合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位，这无疑会遗漏众 多的构象性表位信息。近些年来,随着生物信息学和分子生物学 技术的飞速发展，采用计算机预测和试验相结合的方法进行构 象性表位分析和定位得到了迅速发展，一些可用的基于Web的 预测软件已经公布，如 CEP软件、DiscTope 软件和 MEPS软件。
分类

按表位结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。
连续性表位又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成 通常这种结合比较弱，因为小肽并不含完整天然蛋白的构象，
在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位的一部分。对其
研究依赖于多肽固相化学合成技术。 后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续 的氨基酸组成。
用此法检测的抗原表位有人H铁蛋 白、蓝舌病病毒的外壳蛋白VP5等。
研究方法
3 缩氨酸扫描技术 (Peptide Scan technology)
此技术于1992年由R. Frank发展出来，它主要是将涵盖所有 抗原氨基酸序列的缩氨酸合成于固定的表面，并与抗血清标 定，此法可鉴定线性抗原表位。
1.传统化学“切割”法或酶法（classical epitope mapping）

通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克 隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段。


1.1 用化学法或酶“切割”抗原，分离抗原肽段
该法对蛋白质的一级结构不作要求，但测定结果只能是抗原的线性表位 。 化学切割法中常用的试剂：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。 酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8 蛋白酶等。
抗体多趋于碱性。
抗原表位的预测法


(6)二级结构预测方案(Secondary structure) 认为β转角结构为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，利 于与抗体嵌合，较可能成为抗原表位。而α螺旋、β片层结构 规则不易形变，较难嵌和抗体，一般不作为抗原表位。 可预测蛋白质β转角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等 方法。其中各种方法预测的成功率均不超过65%。一般认为 Cohen方法对转角的预测正确率很高，对于已知折叠类型的 蛋白质(αα类，ββ类，α/β类)正确率高达95%，对于未知结 构类型的蛋白质，可用3种类型分别预测，3类预测一致的转 角对预测表位有帮助。
应用肽合成技术合成连续的重叠的5～7肽，将这些合成的肽 与相应的抗体反应，分析检测结果，以确定阳性反应片段。 这一技术要求有明确的抗原的一级结构，并且检测结果为抗 原线性表位。 该法应用广泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生虫 蛋白、烟草花叶病毒(TMV)、Fy6蛋白、鸭肝炎B病毒(DHBV) 等。


基被称为免疫显性基团。
抗原表位--分类

覆盖型和非覆盖型表位
某些抗原分子表面，不同表位之间相对分离，各自结合 特异性抗体，互不影响，这类表位被称为非覆盖型表位。 若某一表位与相应抗体结合会影响另一表位与抗体的结合， 此类表位称为覆盖型表位。

功能性和隐蔽表位
位于抗原分子表面的表位易被相应淋巴细胞所识别，即具 有易接近性，可直接启动免疫应答，故称为功能性表位。 存在于抗原分子内部的表位无直接触发免疫应答的功能， 称为隐蔽表位。若通过理化因素处理抗原，使其结构发生改变， 内部的隐蔽表位被暴露，可能成为新的有功能的表位。
在抗原区的频率描述，此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中
的频率就可推出此刻度值。

该法研究表明，疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献。

缺点是其所用的数据库有限，并且连续位点内的残基被认为
是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低 相关性。
抗原表位的预测法


(4)可塑性方案(Flexibility)
研究方法
4 表位作图

早期表位作图或定位(epitopemapping)是基于蛋白质修饰和 降解的原理，可经侧链化学修饰法选择性地标记氨基酸，失 去结合的部分将被测出。蛋白质抗原被降解为小片段，经测 序后确定抗体结合的位点。 要确定某一抗原的全部表位需要大量的时间。 现已可以通过诱变、蛋白质合成或蛋白竞争结合方法鉴定其 表位。此外，表位序列测定的应用对抗体结合表位的分析具 有显著的优越性。


研究方法


2.2 基因工程法（噬菌体随机肽筛选法）
该法先利用基因克隆技术将合成的 一组寡核苷酸混合物（小肽基因混 合物）克隆至线性噬菌体基因组中， 使之以融合蛋白的形式在噬菌体的 外壳蛋白的氨基端表达。再利用生 物素或酶标记的抗体筛出特异的噬 菌体，并进行扩增，再筛选，从结 合特异抗体的噬菌体DNA序列推断 出氨基酸序列，并合成相应的短肽， 验证筛选结果。