细胞外泌体提取方法
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外泌体提取详细步骤及方法
1、差速离心
差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。该方法包括几个步骤,包括低速离心去除细胞和凋亡碎片;更高速离心以消除更大的囊泡;最后高速离心沉淀外泌体:
300×g离心10分钟,取上清。
2000×g离心10分钟,取上清。
10,000×g离心30分钟,取上清。100,000×g,在4℃下持续离心90分钟,去掉上清,留下的沉淀PBS重悬后,再次以100,000×g离心90分钟。
2、密度梯度离心
该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合,实现外泌体与非囊泡颗粒分离,例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。因此,该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开,能够提取含量低的外泌体。但是,合适的离心时间非常重要,否则如果它们具有相似的密度,则仍可在外泌体中发现污染颗粒。
3、尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱(Size-exclusion chromatography,SEC)是基于大小而非分子量实现分离大分子。该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子,分子根据其直径通过微球,半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移,而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。此外,可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。与离心方法相比,色谱分离已被证明具有更多优势,因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响,这可能会改变囊泡的结构。目前,SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。不过,该方法耗时较长,不适合大量样本处理。
4、过滤
超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小,从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径,可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体,也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体:不过,该方法由于过滤膜的粘附,可能会损失外泌体,并且过滤时的压力和剪切力,可能会使外泌体变形受损。
5、基于聚合物的沉淀技术
基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合,在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇(PEG)。用
这种聚合物沉淀具有许多优点,包括对分离的外泌体影响小、pH中性等。目前大多数快速分离外泌体的商品化试剂盒都是基于此方法。然而基于聚合物的沉淀方法可能会同时分离非囊泡污染物(包括脂蛋白)而且,聚合物材料的混杂可能会影响下游分析。
6、免疫分离技术
免疫分离外泌体的原理大多是通过抗体包被的微球,特异性结合外泌体。例如使用抗肿瘤相关HER2和EpCAM的抗体从肿瘤细胞中分离出肿瘤来源的外泌体。然而,使用抗体包被珠子的分离不适合从大量样本中获得外泌体。
还有将抗体包被于ELISA中的那种板上面,直接分离后检测、分析、定量。最近的一项研究已应用免疫亲和超顺磁性纳米粒子(ISPN)来结合外泌体,研究人员通过连接抗CD63抗体和纳米粒子生成ISPN,并用它们从体液中分离外泌体。
7、通过筛分分离
该技术利用压力或电场,通过膜从样本中筛出外泌体:该方法分离时间短,可以提供较高纯度的外泌体。但是回收率低。