外泌体提取方法比较

peg离心法分离外泌体的步骤好啦，今天咱们聊聊一个挺有意思的东西——PEG离心法分离外泌体。

哎，别一听这些名字就觉得头大，其实呢，说白了就是通过一种简单的离心方式，把外泌体给分离出来。

可能你会想，什么是外泌体啊？别急，听我慢慢给你讲。

你知道，外泌体其实是细胞分泌出来的小小泡泡，啥意思呢？就是那些细胞通过它们把一些信号、蛋白质或者RNA等信息“寄出去”。

外泌体这玩意儿可在医学研究里大有用途，尤其是在疾病诊断和治疗领域。

那要是想把这些小泡泡给单独提取出来怎么办？这时候，PEG离心法就显得特别给力了！想要分离这些小小的外泌体，咱们得准备一些东西。

想象一下，咱们要做个小实验，首先得有细胞培养液。

这个细胞培养液就像是外泌体的“母亲”，细胞们在里面生长、分泌，外泌体就从中跑出来了。

好啦，得了这些液体后，接下来你要加入一种叫做PEG的东西。

PEG，哦，那可不是你在跑步机上跳的那个P.E.T.，它是一种叫聚乙二醇的化学物质，别看它名字拗口，其实PEG就像一位会魔法的“聚会策划师”，它能通过改变液体的浓度，让外泌体们聚集在一起。

加入PEG之后，我们开始转动离心机啦。

这时候，离心机就像个旋转木马上，能通过强大的离心力把细胞里的各种成分按大小和密度给甩开。

PEG就像磁铁一样，把外泌体聚集到一起，其他的杂质就会被甩到一边。

你想，所有的东西都在旋转，里面的液体各种高低起伏，外泌体通过这个过程就被浓缩了。

不过，离心这个过程得特别小心，你得掌握好时间和速度，要不然你辛辛苦苦分离出来的外泌体就成了“渣渣”，没啥用。

完成了离心之后，咱们就可以把沉淀物（也就是外泌体）从上面的液体中分离出来。

嗯，这一部分看似简单，但其实很考验手劲儿，要轻轻地把液体倒掉，不然外泌体说不定就跟着一起跑了。

小心点，千万不要掉以轻心，毕竟这可是细胞的“心血”，咱得珍惜它。

然后呢，剩下的就是把这些外泌体洗净。

为啥要洗呢？你可能会想，外泌体这么小，干净不干净不都一样吗？洗净是为了去掉那些还在液体中的杂质，有的可能是其他细胞的残骸或者是一些不太“友好”的分子，得把它们甩掉，留下纯净的外泌体。

外泌体，带来革命变革的小不点（三）——外泌体捕获分离外泌体天然存在于体液中，在包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中广泛分布，而且，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体；但是，想要研究这个分布广泛的小不点可不是一件容易的事情，其中，最为困难的就是从体液或者细胞培养基中分离出高纯度的外泌体。

今天，小优专题给您带来的就是外泌体研究的最关键步骤——外泌体捕获与分离这一部分的技术讲解与解决方案。

外泌体分离的传统方法为差速超速离心法和密度梯度超速离心法等，差速超速离心法是目前外泌体提取最常用的方法。

简单来说是将细胞培养液或体液等样本依次在300 g、2 000 g、10 000 g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得到外泌体。

此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，质量不好，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。

另一种常用的外泌体分离方法为密度梯度离心法，将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法。

用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。

实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100 000 g离心16 h，外泌体会沉降到等密度区(1.10~1.18 g/ml)。

用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。

而且，这两种传统方法都需要用到超速离心机，设备昂贵，耗时长，一次最多只能做6个样品，效率低，并且需要大量的样品才能得到足够多的外泌体。

接下来小优就为您带来优宁维为您提供的高效外泌体捕获与分离技术，帮您远离枯燥乏味的超速离心，快速高效制备高质量的外泌体。

话不多说，亮技术，上产品：首先闪亮登场的是简单的一步法分离外泌体，实验原理如下图：一步法分离外泌体原理示意图该技术的优势有节省时间，小体积样本适用（可从100 μl血浆中分离出足量外泌体），无需超速离心和其他预富集方式，试剂方便储存于运输（4℃保存）等。

外泌体鉴定蛋白介绍外泌体是一类赖以解决细胞间相互作用难题的细胞外囊泡，它们包含了细胞产生的多种生物分子，如蛋白质、核酸和脂质等。

这些分子可通过外泌体释放到细胞外，进而影响周围环境中的细胞和组织。

研究发现，外泌体中所含有的蛋白质在细胞信号传递、免疫调节以及疾病发生发展等方面扮演着重要的角色。

因此，鉴定外泌体中的蛋白质成为研究者的一个重要课题。

外泌体鉴定方法外泌体的鉴定方法主要包括以下几种：1. 质谱法质谱法是当前外泌体鉴定蛋白质的主要方法之一。

通过质谱仪对外泌体样本进行分析，可以获得蛋白质的质量谱图。

然后通过与数据库中的质谱数据进行比对，可以鉴定出样本中存在的蛋白质。

这种方法准确性高，但需要较为复杂的实验设备和分析技术。

2. 免疫印迹法免疫印迹法是一种常用的蛋白质检测方法，也可用于外泌体中蛋白质的鉴定。

首先将外泌体样本进行蛋白质提取，并使用SDS-PAGE进行分离。

然后将分离后的蛋白质转移到膜上，并使用特定的抗体进行检测。

通过观察特定蛋白质与抗体的结合情况，可以确定其是否存在于外泌体中。

3. RNA测序除了蛋白质外，外泌体还携带有丰富的核酸，如mRNA和miRNA。

通过对外泌体中RNA的测序，可以鉴定出外泌体中存在的特定蛋白质的编码基因。

这种方法可以提供一种从基因水平上鉴定外泌体蛋白质的手段。

4. 免疫荧光染色免疫荧光染色是一种用于检测蛋白质分布和定位的方法。

对于外泌体鉴定，可以通过标记特定蛋白质的荧光标记物（如荧光抗体）与外泌体进行共染色，然后使用荧光显微镜观察标记物的分布情况。

这种方法提供了一种直观的方式来确定外泌体中的特定蛋白质。

外泌体鉴定蛋白的意义外泌体中所含有的蛋白质在许多生物学过程中发挥着重要的作用。

下面列举了外泌体鉴定蛋白的几个意义：1.细胞间通讯：外泌体释放的蛋白质可以作为信号分子在细胞间进行通讯。

通过鉴定外泌体中的蛋白质，可以了解细胞间通讯的机制及其调控因子。

2.免疫调节：外泌体中的蛋白质在炎症和免疫反应过程中发挥重要作用。

外泌体研究常见问题外泌体（Exosome）发现于1986 年，是⼀种直径约30~100nm 的双层膜囊泡状结构⼩体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、⼲细胞、⼼⾎管细胞、⽹织红细胞、⾎⼩板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产⽣，⼴泛分布于外周⾎、尿液、唾液、乳汁、腹⽔、⽺⽔等体液中。

外泌体携带⼤量特异性的蛋⽩质（如细胞因⼦、⽣长因⼦）以及功能性的mRNAs、miRNAs等⽣物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促⾎管新⽣和抗肿瘤免疫等⽣理过程，与多种疾病的发⽣和进程密切相关。

由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应⽤价值，⼀⽅⾯可以作为诊断多种疾病的⽣物指标，另⼀⽅⾯也可以作为治疗⼿段，未来有可能作为药物的天然载体⽤于临床治疗。

01外泌体研究，应选⽤⾎浆还是⾎清？答：⾎清是⾎液凝固之后收集的液体，所以其中少了纤维蛋⽩原，凝⾎因⼦，以及多了很多凝⾎产物。

纤维蛋⽩原可转化为纤维蛋⽩，具有凝⾎功能。

在凝⾎过程中⾎⼩板会分泌⼤量的外泌体，有研究发现⾎清中有接近50%的外泌体来⾃额外的分泌。

⾎浆=⾎液-⾎细胞⾎清=⾎浆-纤维蛋⽩原-凝⾎因⼦所以⼀般实验选择⾎浆，在特殊情况下，如研究与⾎⼩板相关的疾病的时候，当然是⾎清更适合。

02外泌体的分离⽅法这么多，选择哪种更好？答：外泌体的分离纯化⼀直是科研⼯作者关注的问题，获得⾼纯度的外泌体对后续的研究⾄关重要。

据了解，⽬前⼈们多采⽤超速离⼼、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等⽅法实现外泌体的提取分离：1、超速离⼼法（差速离⼼）超离法是最常⽤的外泌体纯化⼿段，采⽤低速离⼼、⾼速离⼼交替进⾏（如图所⽰），可分离到⼤⼩相近的囊泡颗粒。

超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多⽽⼴受欢迎，但过程⽐较费时，且回收率不稳定（可能与转⼦类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离⼼操作还有可能对囊泡造成损害，从⽽降低其质量。

2、密度梯度离⼼在超速离⼼⼒作⽤下，使蔗糖溶液形成从低到⾼连续分布的密度阶层，是⼀种区带分离法。

外泌体正规操作方法
外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一类具有膜包裹的细胞外体，可以通过分泌进入细胞外液。

以下是外泌体的正规操作方法：
1. 细胞培养和外泌体收集：
- 选择适合外泌体比较丰富的细胞系，如癌细胞系等。

- 使用含有足够营养物质的培养基进行培养，在细胞生长到80-90%的密度时进行收集外泌体。

2. 细胞外泌体的分离和富集：
- 低速离心：对细胞上清和培养基进行低速离心，将细胞碎片和大颗粒物质沉淀。

- 高速离心：将低速离心上清进行高速离心，以沉淀分离出外泌体。

- 滤膜过滤：可以使用0.2至0.8微米的滤膜，通过滤膜将外泌体分离出来。

3. 外泌体的纯化和浓缩：
- 过滤：使用0.2至0.45微米的滤膜，将外泌体悬液过滤以去除细胞碎片和大颗粒物质，得到纯化的外泌体。

- 超速离心：将外泌体悬液进行超速离心，将外泌体沉淀。

- 液氮冷冻：将外泌体悬液进行液氮冻结保存，以便后续分析或实验操作。

4. 外泌体的鉴定和表征：
- 电镜观察：使用透射电子显微镜观察外泌体形态和结构。

- 免疫学鉴定：使用外泌体表面标记物的抗体进行免疫学检测，如CD63、CD81等。

- 蛋白质分析：使用质谱分析等方法对外泌体中的蛋白质进行分析。

需要注意的是，在操作过程中应避免外泌体的污染和损伤，同时应遵循生物安全操作规范。

干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径摘要：外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外小囊泡，携带核酸、蛋白质、脂质等生物活性物质，在机体的生理病理过程中发挥作用。

与脂质体、纳米颗粒等合成载体相比，外泌体的内源性和异质性使其在疾病诊断和治疗领域具有广泛而独特的优势。

直径约 40-100nm 的外泌体是由细胞分泌的生物纳米级球形脂质双层囊泡，以 1.13-1.19 g ∙ mL-1 的密度漂浮在梯度溶液中。

1981 年，科学家Trams 等将质膜来源的囊泡统称为外泌体，并首次提出了“外泌体”的概念，将其视为具有5'-核苷酸酶活性的膜囊泡，可能具有生理功能，起源于各种细胞系培养物的分泌物。

外泌体 Exosomes目前定义的外泌体（40-100nm）于1983年首次在绵羊网织红细胞中发现，科学家Johnstone 等人追踪了网织红细胞成熟过程中的转铁蛋白受体，发现外泌体的形成是成熟红细胞中转铁蛋白受体丢失的机制细胞。

为了将它们与其他类型的细胞外囊泡(EV) 区分开来，它们被命名为外泌体。

然而，值得注意的是，根据ISEV 2018 指南，“外泌体”一词即使被广泛使用，也被建议替换为“小细胞外囊泡(sEVs)”一词，由于分离方法上的困难。

研究发现，外泌体含有核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子受体等生物活性物质。

其中，外泌体蛋白成分主要分为两类，一类是公共成分，参与这一过程囊泡的形成和分泌，即外泌体无处不在，包括膜转运和融合相关蛋白（如Rab、GTPases）、热休克蛋白（如HSP70、HSP90）、四跨膜蛋白超家族（如CD63、CD81）、 ESCRT 复合物相关蛋白（如 Tsg101、Alix）、整合素等；另一种是特异性成分，与其祖细胞密切相关，即细胞特异性，如抗原呈递细胞来源的CD45和MHC-II。

随着外泌体研究的深入，其应用越来越广泛。

外泌体可以在生理和病理过程中发挥作用，充当细胞间通讯和物质交换的介质。

藻类细胞eps提取方法摘要：一、引言二、藻类细胞eps的提取方法1.传统提取方法2.现代提取方法三、提取过程中的注意事项四、提取方法的优缺点对比五、结论正文：【引言】藻类细胞eps（外泌体）提取技术在生物科学研究中具有重要意义，其广泛应用于细胞通讯、信号传导、疾病诊断和治疗等领域。

随着研究的深入，提取藻类细胞eps的方法也不断更新和发展。

本文将对藻类细胞eps的提取方法进行综述，以期为相关研究提供参考。

【藻类细胞eps的提取方法】1.传统提取方法传统提取方法主要包括离心、过滤、沉淀等。

这种方法操作简便，但提取效率较低，且容易受到样本中其他生物大分子的干扰。

2.现代提取方法（1）超声波法：通过高频振荡破碎细胞膜，释放细胞内物质。

超声波法具有快速、高效、无损等特点，但设备成本较高。

（2）化学法：利用表面活性剂、酶等化学物质破坏细胞膜，使eps 释放。

化学法提取效率较高，但可能影响eps的生物活性。

（3）微流控法：通过微流控芯片实现细胞分离和破碎，提取eps。

该方法具有高通量、高纯度等优点，但设备较为复杂。

【提取过程中的注意事项】1.选择合适的提取方法，根据实验目的和样本特点选择最佳方法。

2.注意提取过程中的操作技巧，避免样本污染和活性损失。

3.优化提取条件，提高提取效率。

【提取方法的优缺点对比】1.传统提取方法：操作简便，成本低，但提取效率低，易受干扰。

2.现代提取方法：提取效率高，纯度较高，但成本较高，操作复杂。

【结论】藻类细胞eps提取方法的研究不断发展，为生物科学研究提供了有力支持。

在实际应用中，需根据实验目的和样本特点选择合适的提取方法，注意提取过程中的操作技巧和条件优化，以提高提取效率和纯度。

动物营养学报２０２０，３２（１１）：５４４１⁃５４４７ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ㊀ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０２０．１１．０５１差速超速离心法与试剂盒法提取娟姗牛乳源性外泌体的分析比较范士杰１㊀马㊀露１㊀卜登攀１，２∗（１．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京１００１９３；２．中国农业科学院与世界农用林业中心农用林业与可持续畜牧业联合实验室，北京１００１９３）摘㊀要：本试验旨在探究不同方法提取娟姗牛乳源性外泌体的优缺点㊂采用差速超速离心法和试剂盒法２种提取方法对娟姗牛乳源性外泌体进行提取，通过透射电镜（ＴＥＭ）㊁Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量㊁免疫印迹（ＷＢ）和粒径分析（ＮＴＡ）方法对２种提取方法得到的外泌体进行比较鉴定，并采用细胞毒性试验对试剂盒法提取的外泌体进行细胞毒性评估㊂结果显示：２种提取方法均获得了茶托样结构的囊泡，但ＴＥＭ视野下试剂盒法提取的外泌体较差速超速离心法多㊂试剂盒法提取的外泌体蛋白浓度显著高于差速超速离心法（Ｐ＜０．０５）㊂２种提取方法均能够检测到外泌体的标志性蛋白凋亡连接基因２相互作用蛋白Ｘ（ＡＬＩＸ）和四次跨膜蛋白（ＣＤ８１）；差速超速离心法提取的外泌体ＣＤ８１蛋白丰度极低，且并未鉴定出标志性蛋白肿瘤敏感基因１０１蛋白（ＴＳＧ１０１），但试剂盒法检测到了ＴＳＧ１０１㊂２种提取方法得到的外泌体粒径分布均符合外泌体的正常粒径大小（３０ １５０ｎｍ）㊂进一步通过细胞毒性试验发现，试剂盒法提取的外泌体对细胞的增殖分化几乎没有影响㊂因此，基于本试验条件下，试剂盒法更适用于提取娟姗牛乳源性外泌体㊂关键词：外泌体；娟姗牛乳；差速超速离心法；试剂盒法中图分类号：Ｓ８２３㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０２０）１１⁃５４４１⁃０７收稿日期：２０２０－０３－２４基金项目：国家重点研发计划（２０１８ＹＦＤ０５０１６００）；中国农业科学院科技创新工程（ＡＳＴＩＰ⁃ＩＡＳ０７）；北京市奶牛产业创新团队（ＢＡＩＣ０６⁃２０１８）；畜产品安全工程安徽省重点实验室开放基金（Ｎｏ．ｘｍ２００１）作者简介：范士杰（１９９２ ），男，河南鲁山人，硕士研究生，研究方向为养殖㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｍ１８８１１５２７１１６＠１６３．ｃｏｍ∗通信作者：卜登攀，研究员，博士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｕｄｅｎｇｐａｎ＠１２６．ｃｏｍ㊀㊀外泌体是大多数细胞都能够主动分泌的直径为３０ １５０ｎｍ的双层膜结构的囊泡状小体［１］，含有大量的蛋白质㊁ＲＮＡ㊁脂质和ＤＮＡ等［２－４］㊂大多数细胞可以通过内吞作用方式吸收外泌体，从而进行细胞间信息交流［５］，外泌体在血管生成［６］㊁免疫应答［７］㊁抗肿瘤［８］等方面发挥重要的功能㊂尽管有大量的研究表明，培养细胞可以收集大量的外泌体［９］，但是其产量还是不足以满足需求，从细胞培养到收集外泌体是一个费时费力又昂贵的过程，在提取过程中外泌体的质量也是一个不可控制的问题，这种情况阻碍了外泌体的功能研究［１０］㊂㊀㊀最近的研究表明，牛乳中含有大量的外泌体［１１］㊂通过蛋白质组学功能富集分析，牛乳中外泌体富含与免疫相关的蛋白质，从而介导免疫应答［７］；牛乳外泌体富含微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），可抵抗胃酸环境，从而被肠道吸收并发挥作用［１２］；牦牛乳来源的外泌体可以提高细胞抵抗缺氧环境的能力［１３］；骆驼乳来源的外泌体可以抑制乳腺癌肿瘤细胞生长［８］㊂除此之外，牛乳源性外泌体可作为囊泡运送抗癌药物［１４］，这些研究为乳源性外泌体的应用提供了理论依据㊂㊀㊀在外泌体的研究过程中，已经开发了多种分㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷离方法，如超速离心法［１５］㊁尺寸排阻色谱法［１６］㊁免疫捕获法［１７］等，但是提取出来的外泌体纯度以及浓度均没有经过仔细评估㊂因此，有必要研究各种提取方法的利弊㊂㊀㊀娟姗牛作为世界五大奶牛品种之一［１８］，具有乳蛋白含量高等特点［１９－２０］㊂然而，有关娟姗牛乳中外泌体的研究鲜有报道，其相关功能有待于进一步研究㊂由于目前提取乳中外泌体的方法多样，且不同提取方法的优缺点不一㊂因此，本研究比较分析了差速超速离心法和试剂盒法提取娟姗牛乳源性外泌体的优缺点，并采用透射电镜（ＴＥＭ）㊁Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量㊁免疫印迹（ＷＢ）和粒径分析（ＮＴＡ）方法鉴定所提取的外泌体㊂此外，有研究证实，差速超速离心法提取得到的乳源性外泌体对细胞没有毒性［１０］，而关于试剂盒法提取得到的乳源性外泌体细胞毒性的研究未见报道㊂因此，本试验进一步通过细胞毒性试验评估了试剂盒法提取得到的乳源性外泌体的细胞毒性，旨在确定提取娟姗牛乳中外泌体较佳的方法，为进一步开发娟姗牛乳中外泌体功能奠定技术基础㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料㊀㊀娟姗牛乳采自河北某奶牛场，挑选４８头健康的泌乳中期娟姗牛，用无菌瓶采集牛乳，用冰袋快速带回实验室，储存于－８０ħ冰箱㊂荷斯坦奶牛乳源性外泌体由本实验室前期通过差速超速离心法提取，储存于－８０ħ冰箱，提取方法与娟姗牛乳源性外泌体差速超速离心法相同㊂１．２㊀提取方法１．２．１㊀差速超速离心法㊀㊀将娟姗牛乳从－８０ħ冰箱取出，于２５ħ恒温水浴锅解冻，完全融化后，将４８头娟姗牛乳等体积混匀，１２００ˑｇ㊁４ħ㊁１０ｍｉｎ离心２次，除去脂肪；２１５００ˑｇ㊁４ħ分别离心３０㊁６０ｍｉｎ，去除蛋白质和细胞碎片，转移上清到超速离心管（３６１６２５，Ｂｅｃｋｍａｎ，美国）中，使用超速离心机（ＯｐｔｉｍａＬＥ－８０Ｋ，Ｂｅｃｋｍａｎ，美国）１０００００ˑｇ㊁４ħ离心９０ｍｉｎ，去除上清，加磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ）１０００００ˑｇ㊁４ħ㊁９０ｍｉｎ离心２次，将上清倒出，用ＰＢＳ重悬沉淀，得到外泌体［１５］㊂外泌体保存于－８０ħ冰箱㊂本过程使用完全独立的样品重复３次㊂１．２．２㊀试剂盒法㊀㊀使用外泌体提取试剂盒（４４８４４５３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）提取娟姗牛乳源性外泌体，所有的步骤按照说明书操作，具体如下：将娟姗牛乳从－８０ħ冰箱取出，于２５ħ恒温水浴锅解冻，完全融化后，将４８头娟姗牛乳等体积混匀，２０００ˑｇ室温离心１０ｍｉｎ，除去脂肪；１００００ˑｇ室温离心３０ｍｉｎ，转移上清；１００００ˑｇ室温离心１０ｍｉｎ，除去蛋白和大的细胞碎片；转移上清到新的离心管，添加等量的ＰＢＳ，加入等体积的外泌体提取试剂，充分混匀；室温孵育３０ｍｉｎ，１００００ˑｇ室温离心１０ｍｉｎ，小心移去上清，外泌体沉淀在离心管管底；１００００ˑｇ室温离心５ｍｉｎ，移除剩余上清；用适量的ＰＢＳ重悬外泌体，１００００ˑｇ室温离心５ｍｉｎ，转移上清到新的离心管中，收集得到的上清即是外泌体㊂外泌体保存于－８０ħ冰箱㊂本过程使用完全独立的样品重复３次㊂１．３㊀外泌体鉴定１．３．１㊀ＴＥＭ方法鉴定外泌体㊀㊀取出－８０ħ冰箱中冻存的外泌体，室温解冻直至完全融化，吸取２０μＬ外泌体滴加在１００目的铜网上，滴１滴２％的醋酸双氧铀，负染外泌体，染色时间３０ｍｉｎ，日光灯下干燥，透射电镜（Ｈｉｔａ⁃ｃｈｉＨ－７５００，Ｈｉｔａｃｈｉ，日本）下观察［２１］㊂电压选择８０ｋＶ，先从直径为０．５μｍ下找到合适的视野，调整直径为２００ｎｍ，拍照保存㊂本过程使用完全独立的样品重复３次㊂１．３．２㊀Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量方法鉴定外泌体㊀㊀外泌体使用蛋白裂解液进行裂解，超声破碎１０ｍｉｎ，冰上放置３０ｍｉｎ，丙酮过夜沉淀，１２０００ˑｇ离心２０ｍｉｎ，５ｍｏｌ／Ｌ尿素复溶，用Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量试剂盒（ＰＣ００１０，北京索莱宝公司）测出外泌体的蛋白浓度，所有步骤按照说明书操作㊂本过程使用完全独立的样品重复３次㊂１．３．３㊀ＷＢ方法鉴定外泌体㊀㊀外泌体蛋白与５ˑ蛋白上样缓冲液混匀后１００ħ煮沸５ｍｉｎ，蛋白上样量为２０μｇ；Ｍａｒｋｅｒ上样量为５μＬ，电压１４０Ｖ，时间为６０ｍｉｎ，考马斯亮蓝染色１ｈ，用水脱色１２ｈ，获得清晰的条带，扫描，保存㊂㊀㊀裁剪适当大小的聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜并在甲醇中浸泡１ｍｉｎ，２００ｍＡ转膜２ｈ，５％的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）封闭液［５ｇＢＳＡ＋１００ｍＬ含吐温２４４５１１期范士杰等：差速超速离心法与试剂盒法提取娟姗牛乳源性外泌体的分析比较２０的Ｔｒｉｓ缓冲盐水（ＴＢＳＴ）］室温封闭１ｈ；肿瘤敏感基因１０１蛋白（ＴＳＧ１０１，ＡＢＰ５６４５４，Ａｂｂｋｉｎｅ，美国）㊁四次跨膜蛋白（ＣＤ８１，ＳＡＢ３５００４５４，Ｓｉｇ⁃ｍａ，美国）㊁凋亡连接基因２相互作用蛋白Ｘ（ＡＬＩＸ，ａｂ２２５５５５，Ａｂｃａｍ，英国）和钙黏连蛋白（Ｃａｌｎｅｘｉｎ，ａｂ７５８０１，Ａｂｃａｍ，英国）［１２，２２］，用５％的ＢＳＡ封闭液稀释，ＴＳＧ１０１和ＡＬＩＸ按１ʒ１０００稀释，ＣＤ８１按１ʒ１５００稀释，４ħ孵育过夜；ＴＢＳＴ室温洗５遍，每遍５ｍｉｎ，随后，分别加入山羊抗鼠二抗（Ａ９０４４，Ｓｉｇｍａ，英国）和山羊抗兔二抗（Ａ９１６９，Ｓｉｇｍａ，美国），二抗（按１ʒ５０００的比例稀释）室温孵育１ｈ，ＴＢＳＴ室温洗５遍，每遍１０ｍｉｎ，使用天能ＷＢ超敏化学发光显色液（１８０－５０１，上海天能科技有限公司）显色后采集图像（Ｔａｎｏｎ－５２００Ｍｕｌｔｉ，上海天能科技有限公司）㊂本过程使用完全独立的样品重复３次㊂１．３．４㊀ＮＴＡ方法鉴定外泌体㊀㊀取出－８０ħ冰箱中冻存的外泌体，２５ħ水浴解冻，冰上放置㊂用ＰＢＳ稀释８０００倍上机，粒径分析仪（ＺｅｔａｖｉｅｗＳ／Ｎ１７－３１０，ＰａｒｔｉｃｌｅＭｅｔｒｉｘ，德国）通过实时地对悬浮液中直径５０ １０００ｎｍ特定的外泌体和囊泡进行逐个的直接成像和观察，最终通过Ｚｅｔａｖｉｅｗ８．０４．０２软件计算出外泌体粒径分布［２３］㊂本过程使用完全独立的样品重复３次㊂１．３．５㊀细胞毒性试验㊀㊀大鼠小肠上皮细胞购自上海细胞库（ＢＦＮ６０８００６４０４）㊂使用添加１０％胎牛血清和１００μＬ／ｍＬ双抗（青霉素和链霉素）的ＤＭＥＭ高糖培养基（Ｃ１１９９５５００ＢＴ，Ｇｉｂｃｏ，美国）进行培养㊂将细胞接种在９６孔板中（２ˑ１０４细胞／孔），设置由试剂盒法提取的外泌体添加浓度梯度，分别为０（对照）㊁５０㊁１００㊁２００μｇ／ｍＬ，添加到细胞中，３７ħ培养２４ｈ，使用ＭＴＴ试剂盒（Ｍ１０２０，北京索莱宝公司）测量细胞活力，细胞活力计算公式为：细胞活力（％）＝（添加外泌体组细胞吸光度／对照组细胞吸光度）ˑ１００㊂㊀㊀本过程使用完全独立的样品重复３次㊂１．４㊀数据统计分析㊀㊀试验数据采用ＳＡＳ９．４软件ＭＩＸＥＤ模型进行统计分析，统计模型中包括蛋白浓度及２种提取方法，以Ｐ＜０．０５作为差异显著㊂２㊀结果与分析２．１㊀ＴＥＭ方法鉴定不同方法提取的娟姗牛乳源性外泌体的形态结构㊀㊀从图１可以看出，通过ＴＥＭ方法分别对差速超速离心法及试剂盒法提取得到的外泌体进行了鉴定，２种提取方法得到的外泌体都拍到了典型的茶托样结构，电镜下观察到的囊泡大小在１００ｎｍ左右㊂图１－Ａ为差速超速离心法提取得到的外泌体，电镜下观察到的外泌体较少；图１－Ｂ为试剂盒法提取得到的外泌体，电镜下观察到的外泌体较多㊂㊀㊀Ａ：差速超速离心法提取的外泌体透射电镜图；Ｂ：试剂盒法提取的外泌体的透射电镜图㊂㊀㊀Ａ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃ⁃ｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｂ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．图１㊀外泌体的透射电镜图Ｆｉｇ．１㊀Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ２．２㊀Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量方法鉴定不同方法提取的娟姗牛乳源性外泌体的蛋白浓度㊀㊀从图２可以看出，试剂盒法提取的外泌体浓度显著高于差速超速离心法（Ｐ＜０．０５）㊂２．３㊀ＷＢ方法鉴定不同方法提取的娟姗牛乳源性外泌体的标志性蛋白㊀㊀从图３可以看出，通过对不同提取方法提取的外泌体的蛋白进行鉴定发现，图３－Ａ中差速超速离心法提取的蛋白条带很杂，在相对蛋白分子量大的部分，蛋白条带很弱，在相对蛋白分子量小的位置，条带不规则；试剂盒法提取的各蛋白条带都比较清晰，蛋白条带也较多㊂通过ＷＢ方法对差速超速离心法和试剂盒法提取的外泌体进行了标志性蛋白ＣＤ８１㊁ＡＬＩＸ和ＴＳＧ１０１的鉴定，结果显示，２种提取方法均能够检测到外泌体的标志性３４４５㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷蛋白ＡＬＩＸ和ＣＤ８１，但差速超速离心法提取的外泌体标志性蛋白ＣＤ８１蛋白丰度特别低，且并未鉴定出标志性蛋白ＴＳＧ１０１，但试剂盒法检测到了标志性蛋白ＴＳＧ１０１，Ｃａｌｎｅｘｉｎ作为外泌体阴性对照，２种提取方法均未检测到Ｃａｌｎｅｘｉｎ（图３－Ｂ）㊂㊀㊀ＵＣ：差速超速离心法提取的外泌体蛋白浓度；Ｋｉｔ：试剂盒法提取的外泌体蛋白浓度㊂㊀㊀ＵＣ：ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｋｉｔ：ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎ⁃ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．图２㊀外泌体的蛋白浓度Ｆｉｇ．２㊀Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ２．４㊀ＮＴＡ方法鉴定不同方法提取的娟姗牛乳源性外泌体的粒径㊀㊀从图４可以看出，通过ＮＴＡ方法对外泌体进行粒径大小的检测，差速超速离心法提取得到的外泌体，其粒径大小为（１１４．６ʃ４２．６）ｎｍ（图４－Ａ）；试剂盒法提取得到的外泌体，其粒径大小为（１３０．４ʃ４４．２）ｎｍ（图４－Ｂ）㊂２种提取方法提取得到的外泌体，都符合外泌体的正常粒径大小（３０ １５０ｎｍ）㊂２．５㊀细胞毒性试验检测外泌体细胞毒性㊀㊀从图５可以看出，添加不同浓度的由试剂盒法提取的外泌体后，各组的细胞活力都高于对照组㊂３㊀讨㊀论㊀㊀当前，乳源性外泌体的提取方法主要是差速超速离心法［１３，２４］，差速超速离心法提取外泌体的方法是通过不断提高离心速度，收集不同的组分，从而将乳中的脂肪㊁蛋白㊁细胞碎片等去除，然后使用超速离心法，将外泌体分离下来［１５］㊂本试验通过差速超速离心法对娟姗牛乳进行外泌体提取，根据国际外囊泡学会（ＩＳＥＶ）发布的细胞外囊泡研究所需的鉴定标准［２５］，对外泌体的形态结构㊁标志性蛋白㊁粒径分析进行鉴定发现，虽然结构符合双层膜结构，但是电镜下只找到了少量的外泌体；标志性蛋白只鉴定到ＡＬＩＸ㊁ＣＤ８１，且ＣＤ８１的蛋白丰度很低㊂而且并未鉴定到外泌体标志性蛋白ＴＳＧ１０１㊂因此，差速超速离心法提取的外泌体浓度较低，难以满足后续蛋白和核酸提取的需求，使用差速超速离心法并不适用于娟姗牛乳中外泌体的提取㊂本试验采取的另一种方法试剂盒法，与差速超速离心法相比，电镜下观察到了大量的外泌体，ＷＢ方法鉴定到标志性蛋白ＴＳＧ１０１㊁ＣＤ８１和ＡＬＩＸ，且丰度较高㊂粒径分析测得２种方法提取得到的外泌体粒径均符合外泌体的正常粒径大小范围（３０ １５０ｎｍ）［１］㊂而通过蛋白定量结果可以看出试剂盒法提取的娟姗牛乳外泌体的浓度显著高于差速超速离心法㊂因此，可确定试剂盒法提取娟姗牛乳中的外泌体的方法优于差速超速离心法㊂㊀㊀此外，已有研究证明细胞中添加差速超速离心法提取得到的乳源性外泌体的细胞活力与对照组相比没有差异；通过在大鼠小肠上皮细胞中添加差速超速离心法提取的乳源性外泌体，细胞活力高于对照组，因此，差速超速离心法提取得到的外泌体对细胞没有毒性［１０－１１］㊂本试验通过对试剂盒法提取的外泌体开展细胞毒性研究，并将试剂盒法提取的外泌体浓度提高至２００μｇ／ｍＬ，结果显示，细胞活力仍较对照组高，与上述研究相符，不同添加浓度无明显差异，进一步证实了试剂盒法提取的外泌体无细胞毒性，可适用于开展细胞试验研究㊂㊀㊀鉴于乳源性外泌体在经过酸奶发酵工艺后仍能保持稳定，并激活丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）信号通路［２６］㊂即使在缺氧环境下，仍可提高小肠上皮细胞的增殖分化［１３］㊂且其内含有大量与免疫相关的ｍｉＲＮＡ［１２］，作为细胞间交流的媒介，其携带的核酸能被细胞吸收，从而发挥其生物学作用［２７］㊂因此，选取更合适的外泌体提取方法可为进一步研究外泌体的功能提供技术保障㊂本试验探究并证实了较佳的应用于娟姗牛乳中外泌４４４５１１期范士杰等：差速超速离心法与试剂盒法提取娟姗牛乳源性外泌体的分析比较体的提取方法，为娟姗牛乳源性外泌体进一步研究提供技术基础㊂㊀㊀Ａ：蛋白凝胶电泳比较不同方法提取的娟姗牛乳中外泌体蛋白；Ｂ：ＷＢ方法鉴定不同方法提取的娟姗牛乳中外泌体㊂Ｍ为蛋白ｍａｒｋｅｒ的简写；ＨＣＭ为差速超速离心法提取的荷斯坦奶牛乳中外泌体；ＪＭ１为差速超速离心法提取的娟姗牛乳中外泌体；ＪＭ２为试剂盒法提取的娟姗牛乳中外泌体；ＡＬＩＸ为凋亡连接基因２相互作用蛋白Ｘ；ＣＤ８１为四次跨膜蛋白；ＴＳＧ１０１为肿瘤敏感基因１０１蛋白；Ｃａｌｎｅｘｉｎ为钙黏联蛋白㊂㊀㊀Ａ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｐｒｏｔｅｉｎｉｎＪｅｒｓｅｙｍｉｌｋｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｂｙｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ⁃ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ⁃ｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ｂ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎＪｅｒｓｅｙｍｉｌｋｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｍｅｔｈｏｄ．Ｍｉｓｔｈｅａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；ＨＣＭｉｓｅｘｏｓｏｍｅｓｏｆＨｏｌｓｔｅｉｎｍｉｌｋｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ＪＭ１ｉｓｅｘｏｓｏｍｅｓｏｆＪｅｒｓｅｙｍｉｌｋｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ＪＭ２ｉｓｅｘｏｓｏｍｅｓｏｆＪｅｒｓｅｙｍｉｌｋｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｋｉｔｅｘ⁃ｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ＡＬＩＸｉｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ⁃ｌｉｎｋｅｄｇｅｎｅ⁃２ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＸ；ＣＤ８１ｉｓｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ；ＴＳＧ１０１ｉｓｔｕｍｏｒｓｕｓ⁃ｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅ１０１ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｃａｌｎｅｘｉｎｉｓｃａｌｎｅｘｉｎ．图３㊀外泌体蛋白标志物的鉴定Ｆｉｇ．３㊀Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓ㊀㊀Ａ：差速超速离心法提取的外泌体的粒径分布图；Ｂ：试剂盒法提取的外泌体粒径分布图㊂㊀㊀Ａ：ｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｂ：ｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｄｉａ⁃ｇｒａｍｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．图４㊀外泌体的粒径检测结果Ｆｉｇ．４㊀Ｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ４㊀结㊀论㊀㊀针对娟姗牛乳源性外泌体的提取，差速超速离心法得率较低，不适用提取娟姗牛乳中外泌体；而试剂盒法只需要少量的娟姗牛乳样本，便可得到较多的外泌体，且外泌体的纯度高，同时对细胞没有毒性㊂因此，试剂盒法更适用于提取娟姗牛乳中的外泌体㊂５４４５㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷图５　外泌体的体外细胞毒性Ｆｉｇ．５㊀Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｖｉｔｒｏ参考文献：［１］㊀ＧＵＲＵＮＡＴＨＡＮＳ，ＫＡＮＧＭＨ，ＪＥＹＡＲＡＪＭ，ｅｔａｌ．ＲｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅＩｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄｍｕｌｔｉｆａｒｉｏｕｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌｓ，２０１９，８（４）：３０７．［２］㊀ＴＫＡＣＨＭ，ＴＨÉＲＹＣ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｂｙｅｘｔｒａｃｅｌｌｕ⁃ｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｗｈｅｒｅｗｅａｒｅａｎｄｗｈｅｒｅｗｅｎｅｅｄｔｏｇｏ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２０１６，１６４（６）：１２２６－１２３２．［３］㊀ＳＫＯＴＬＡＮＤＴ，ＳＡＮＤＶＩＧＫ，ＬＬＯＲＥＮＴＥＡ．Ｌｉｐｉｄｓｉｎｅｘｏｓｏｍｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔｋｎｏｗｌｅｄｇｅａｎｄｔｈｅｗａｙｆｏｒｗａｒｄ［Ｊ］．ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，６６：３０－４１．［４］㊀ＫＡＬＬＵＲＩＲ，ＬＥＢＬＥＵＶＳ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｄｏｕｂｌｅ⁃ｓｔｒａｎｄｅｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｉｎｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｅｘｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉａｏｎＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＢｉｏｌｏ⁃ｇｙ，２０１６，８１：２７５－２８０．［５］㊀ＨＯＲＩＢＥＳ，ＴＡＮＡＨＡＳＨＩＴ，ＫＡＷＡＵＣＨＩＳ，ｅｔａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｃｉｐｉｅｎｔｃｅｌｌ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｅｘｏｓｏｍｅｕｐｔａｋｅ［Ｊ］．ＢＭＣＣａｎｃｅｒ，２０１８，１８：４７．［６］㊀ＡＮＤＥＲＳＯＮＪＤ，ＪＯＨＡＮＳＳＯＮＨＪ，ＧＲＡＨＡＭＣＳ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｓｅｎ⁃ｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｅｘｏｓｏｍｅｓｒｅｖｅａｌｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎ⁃ｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｖｉａｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ⁃ｋａｐｐａＢｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，２０１６，３４（３）：６０１－６１３．［７］㊀ＳＡＭＵＥＬＭ，ＣＨＩＳＡＮＧＡＤ，ＬＩＥＭＭ，ｅｔａｌ．Ｂｏｖｉｎｅｍｉｌｋ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｃｏｌｏｓｔｒｕｍａｒｅｅｎｒｉｃｈｅｄｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｉｃａｔｅｄｉｎｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ，２０１７，７：５９３３．［８］㊀ＢＡＤＡＷＹＡＡ，ＥＬ⁃ＭＡＧＤＭＡ，ＡＬＳＡＤＲＡＨＳＡ．ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｍｅｌｍｉｌｋａｎｄｉｔｓｅｘｏｓｏｍｅｓｏｎＭＣＦ７ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．ＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｉｅｓ，２０１８，１７（４）：１２３５－１２４６．［９］㊀ＷＡＴＳＯＮＤＣ，ＢＡＹＩＫＤ，ＳＲＩＶＡＴＳＡＮＡ，ｅｔａｌ．Ｅｆ⁃ｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｔｕｍｏｒｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｅｎ⁃ｇｉｎｅｅｒｅｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１６，１０５：１９５－２０５．［１０］㊀ＳＯＭＩＹＡＭ，ＹＯＳＨＩＯＫＡＹ，ＯＣＨＩＹＡＴ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔ⁃ｉｂｉｌｉｔｙｏｆｈｉｇｈｌｙｐｕｒｉｆｉｅｄｂｏｖｉｎｅｍｉｌｋ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｔｒａｃｅｌ⁃ｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＶｅｓｉｃｌｅｓ，２０１８，７（１）：１４４０１３２．［１１］㊀ＭＩＹＡＫＥＨ，ＬＥＥＣ，ＣＨＵＳＩＬＰＳ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｍｉｌｋｅｘｏｓｏｍｅｓａｔｔｅｎｕａｔｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄａｍａｇｅ［Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔ⁃ｒｉｃＳｕｒｇｅｒｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０２０，３６（２）：１５５－１６３．［１２］㊀ＢＥＮＭＯＵＳＳＡＡ，ＬＥＥＣＨＣ，ＬＡＦＦＯＮＴＢ，ｅｔａｌ．ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌｄａｉｒｙｃｏｗｍｉｌｋｍｉｃｒｏＲＮＡｓｒｅｓｉｓｔｄｉｇｅｓ⁃ｔｉｏｎｕｎｄｅｒｓｉｍｕｌａｔｅｄｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１６，１４６（１１）：２２０６－２２１５．［１３］㊀ＧＡＯＨＮ，ＧＵＯＨＹ，ＺＨＡＮＧＨ，ｅｔａｌ．Ｙａｋ⁃ｍｉｌｋ⁃ｄｅ⁃ｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅｓｐｒｏｍｏｔｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉ⁃ｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎａｎｈｙｐｏｘｉｃｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，２０１８，１０２（２）：９８５－９９６．［１４］㊀ＡＧＲＡＷＡＬＡＫ，ＡＱＩＬＦ，ＪＥＹＡＢＡＬＡＮＪ，ｅｔａｌ．Ｍｉｌｋ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅｓｆｏｒｏｒａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌ［Ｊ］．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７，１３（５）：１６２７－１６３６．［１５］㊀ＩＺＵＭＩＨ，ＴＳＵＤＡＭ，ＳＡＴＯＹ，ｅｔａｌ．Ｂｏｖｉｎｅｍｉｌｋｅｘ⁃ｏｓｏｍｅｓｃｏｎｔａｉｎｍｉｃｒｏＲＮＡａｎｄｍＲＮＡａｎｄａｒｅｔａｋｅｎｕｐｂｙｈｕｍａｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒｙＳｃｉ⁃ｅｎｃｅ，２０１５，９８（５）：２９２０－２９３３．［１６］㊀ＬＯＢＢＲ，ＭÖＬＬＥＲＡ．Ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ⁃ｐｈｙ：ａｓｉｍｐｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｘｏｓｏｍｅｐｕｒｉｆｉ⁃ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］／／ＫＵＯＷ，ＪＩＡＳ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ：ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，２０１７，１６６０：１０５－１１０．［１７］㊀ＺＥＲＩＮＧＥＲＥ，ＢＡＲＴＡＴ，ＬＩＭ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｉ⁃ｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏ⁃ｓｉａｏｎＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙ，２０１５，２０１５（４）：３１９－３２３．［１８］㊀汪翔．娟姗牛的杂交应用研究进展［Ｊ］．中国奶牛，２０１６（９）：１２－１９．［１９］㊀梁霄，刘鹭，张书文，等．不同品种原料乳理化特性分析［Ｊ］．食品科学，２０１３，３４（５）：５０－５４．［２０］㊀王洋，于静，王巍，等．娟姗牛品种特性及适应性饲养研究［Ｊ］．中国奶牛，２０１１（１１）：４７－４８．［２１］㊀ＡＳＡＤＩＪ，ＦＥＲＧＵＳＯＮＳ，ＲＡＪＡＨ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｉｍａｇｉｎｇｏｆｌｉｐｉｄｒｉｃｈｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｅｍｂｅｄｄｅｄｉｎｍｅｔｈ⁃ｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅｆｉｌｍｓｆｏｒｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｕｓｉｎｇｍｉｘｔｕｒｅｓｏｆｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｎ，２０１７，９９：４０－４８．［２２］㊀ＶＡＳＷＡＮＩＫ，ＫＯＨＹＱ，ＡＬＭＵＧＨＬＬＩＱＦＢ，ｅｔａｌ．Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄ６４４５１１期范士杰等：差速超速离心法与试剂盒法提取娟姗牛乳源性外泌体的分析比较ｂｏｖｉｎｅｍｉｌｋｅｘｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙ，２０１７，１７（４）：３４１－３４８．［２３］㊀ＨＯＣＫＡ，ＭＩＹＡＫＥＨ，ＬＩＢ，ｅｔａｌ．Ｂｒｅａｓｔｍｉｌｋ⁃ｄｅ⁃ｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅｓｐｒｏｍｏｔｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃＳｕｒｇｅｒｙ，２０１７，５２（５）：７５５－７５９．［２４］㊀ＲＥＩＮＨＡＲＤＴＴＡ，ＬＩＰＰＯＬＩＳＪＤ，ＮＯＮＮＥＣＫＥＢＪ，ｅｔａｌ．Ｂｏｖｉｎｅｍｉｌｋｅｘｏｓｏｍｅｐｒｏｔｅｏｍｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１２，７５（５）：１４８６－１４９２．［２５］㊀ＬÖＴＶＡＬＬＪ，ＨＩＬＬＡＦ，ＨＯＣＨＢＥＲＧＦ，ｅｔａｌ．Ｍｉｎｉｍａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：ａｐｏｓｉｔｉｏｎｓｔａｔｅｍｅｎｔｆｒｏｍｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＶｅｓｉｃｌｅｓ，２０１４，３：２６９１３．［２６］㊀ＹＵＳＲ，ＺＨＡＯＺＨ，ＳＵＮＬＭ，ｅｔａｌ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｉｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｍｉｌｋ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏ⁃ｓｏｍｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７，６５（６）：１２２０－１２２８．［２７］㊀ＬＩＡＯＹＬ，ＤＵＸＧ，ＬＩＪ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｍｉｌｋｅｘｏ⁃ｓｏｍｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｉｃｒｏＲＮＡｓｓｕｒｖｉｖｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏａｎｄａｒｅｔａｋｅｎｕｐｂｙｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃ⁃ｕｌａｒＮｕｔｒｉｔｉｏｎ＆ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，６１（１１）：１７０００８２．∗Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｕｄｅｎｇｐａｎ＠１２６．ｃｏｍ（责任编辑㊀武海龙）ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＪｅｒｓｅｙＭｉｌｋＤｅｒｉｖｅｄＥｘｏｓｏｍｅｓＥｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄａｎｄＫｉｔＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄＦＡＮＳｈｉｊｉｅ１㊀ＭＡＬｕ１㊀ＢＵＤｅｎｇｐａｎ１，２∗（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＷｏｒｌｄＡｇｒｏｆｏｒｅｓｔｒｙＣｅｎｔｅｒＪｏｉｎｔＬａｂｏｎＡｇｒｏｆｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＳｕｓｔａｉｎａｂｌｅＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｉｍｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈ⁃ｏｄｓｕｓｅｄｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｅｘｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍＪｅｒｓｅｙｍｉｌｋ．Ｅｘｏｓｏｍｅｓｗａｓｆｉｒｓｔｌｙｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕ⁃ｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＴＥＭ），Ｂｒａｄｆｏｒｄｐｒｏｔｅｉｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ＷＢ）ａｎｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｔｒａｃｋｉｎｇａ⁃ｎａｌｙｓｉｓ（ＮＴＡ）ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｔｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｆｏｒｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｗｏｅｘｔｒａｃｔｍｅｔｈｏｄｓｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｓａｕｃｅｒ⁃ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｖｅｓｉｃｌｅｓ，ｂｕｔｕｎｄｅｒｔｈｅＴＥＭｆｉｅｌｄｏｆｖｉｓｉｏｎ，ｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｍｏｒｅｔｈａｎｔｈｏｓｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｍａｒｋｅｒｐｒｏｔｅｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓ⁃ｌｉｎｋｅｄｇｅｎｅ⁃２ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＸ（ＡＬＩＸ）ａｎｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＤ８１）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｗｏｅｘｔｒａｃｔｍｅｔｈｏｄｓ；ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＣＤ８１ｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａ⁃ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｌｏｗ，ａｎｄｔｈｅｔｕｍｏｒｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅ１０１ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ１０１）ｗａｓｎｏｔｉ⁃ｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｂｕｔｔｈｅＴＳＧ１０１ｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｗｏｅｘｔｒａｃｔｍｅｔｈｏｄｓｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍａｌｓｉｚｅｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓ（３０ｔｏ１５０ｎｍ）．Ｆｕｒ⁃ｔｈｅｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｈａｄｎｏｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ，ｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｉｓａｓｕｉｔａｂｌｅｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｅｘｏｓｏｍｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＪｅｒｓｅｙｍｉｌｋｂａｓｅｄｏｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．［ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０２０，３２（１１）：５４４１⁃５４４７］Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｘｏｓｏｍｅｓ；Ｊｅｒｓｅｙｍｉｌｋ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ｋｉｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ７４４５。

外泌体提取方法及鉴定分析研究进展外泌体是细胞分泌的一种微小膜泡，包含了多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。

近年来，随着生物技术的不断发展，外泌体提取方法和鉴定分析研究取得了显著的进展。

本文将对外泌体提取方法及鉴定分析研究进展进行简要综述。

外泌体是由细胞分泌的一种直径约30-100nm的膜泡，由细胞内吞摄取并加工处理形成。

外泌体在细胞间通讯、物质运输以及疾病诊断等方面具有重要作用。

化学法是一种常用的外泌体提取方法，主要采用离心和沉淀相结合的方法。

首先将细胞培养液进行高速离心，去除细胞和较大的膜泡，然后加入沉淀剂沉淀获得外泌体。

该方法的优点是操作简单、提取量较大，适合大量样本的处理。

但是，该方法纯度较低，可能会影响后续的鉴定和分析。

生物法是一种利用细胞表面标志物进行免疫吸附的外泌体提取方法。

将外泌体进行免疫吸附，再通过洗脱得到纯度较高的外泌体。

该方法的优点是纯度高、对细胞损伤小，适用于珍贵样本的提取。

但是，该方法操作复杂，提取量较小，需要大量的抗体。

基因工程法是一种利用细胞表达特定基因的外泌体提取方法。

将目的基因转染到细胞中，通过表达特定膜蛋白，诱导细胞分泌出外泌体，再对其进行纯化和提取。

该方法的优点是纯度高、提取量较大，适用于具有特定功能的外泌体提取。

但是，该方法需要特定的基因工程技术和细胞系，操作较为复杂。

蛋白质组学在外泌体研究中的应用不断深入。

通过蛋白质组学技术，可以鉴定外泌体中的蛋白质种类、相对丰度以及修饰情况等。

通过比较不同条件下外泌体蛋白质组学的差异，可以研究外泌体的生物学特征和功能。

随着二代测序技术的不断发展，基因序列分析在外泌体研究中也得到广泛应用。

通过对外泌体中的核酸进行测序，可以鉴定其中的基因序列和表达水平。

通过比较不同条件下外泌体基因序列的差异，可以研究外泌体在细胞间通讯和疾病诊断等方面的作用。

转录组测序转录组测序可以分析外泌体中的mRNA、lncRNA和miRNA等转录本。

巨噬细胞外泌体提取方法摘要：一、引言二、巨噬细胞外泌体的功能与作用三、巨噬细胞外泌体的提取方法1.细胞培养2.收集细胞培养液3.离心分离4.制备外泌体富集液5.纯化外泌体四、提取过程中的注意事项五、外泌体的应用领域六、总结正文：一、引言巨噬细胞外泌体（Macrophage exosomes）作为一种具有生物活性的纳米级囊泡，含有丰富的生物信息物质，如蛋白质、核酸和代谢物等。

在生物学、医学研究领域备受关注。

本文将介绍一种简便、有效的巨噬细胞外泌体提取方法，以供研究者参考。

二、巨噬细胞外泌体的功能与作用巨噬细胞外泌体具有多种生物学功能，如传递信号、调控免疫反应、参与细胞间通讯等。

此外，外泌体在疾病发生与发展过程中起着关键作用，如肿瘤发生、炎症反应和神经退行性疾病等。

因此，对巨噬细胞外泌体的研究有助于深入探讨相关疾病的发病机制，为临床诊断和治疗提供新思路。

三、巨噬细胞外泌体的提取方法1.细胞培养：选择合适的巨噬细胞株，如RAW264.7，进行体外培养。

可用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行传代培养。

2.收集细胞培养液：将培养皿中的细胞培养液倒入离心管中，注意避免剧烈振荡，以免破坏外泌体结构。

3.离心分离：将收集到的细胞培养液进行低速短时间离心，如300×g离心5分钟，以去除细胞碎片和其他杂质。

4.制备外泌体富集液：将离心后的上清液转移至新的离心管中，再次进行高速长时间离心，如1000×g离心30分钟，使外泌体富集于上清液中。

5.纯化外泌体：采用超速离心法，如10000×g离心1小时，收集沉淀物，即为纯化的巨噬细胞外泌体。

四、提取过程中的注意事项1.细胞培养过程中要保证无菌操作，避免外源性污染。

2.离心过程中，根据实验需求选择合适的离心速度和时间。

3.制备外泌体富集液时，可采用多次离心方法，以提高外泌体富集效果。

4.纯化外泌体时，注意超速离心的条件，避免过度离心导致外泌体破裂。