下载文档原格式
外泌体提取的方法外泌体是一种小型的胞外囊泡，它们由细胞释放出来，带有许多生物分子，如蛋白质、RNA和DNA等。
这些外泌体在很多生物体中都被发现，包括植物、动物和微生物等，而研究它们已经成为了一个热门课题。
因此，外泌体提取方法的研究也愈发重要。
1. 已有的外泌体提取方法目前已经开发出了几种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心和超滤等。
这些方法每一种都有其优点和限制。
下面将分别介绍这三种方法。
差速离心法这是当前最常用的外泌体提取方法。
差速离心法利用一个多步骤的过滤和离心过程来提取外泌体。
此方法通过圆盘刷子离心除去大的细胞残留和细胞碎片，然后再通过速度梯度离心 Pellet 小径的微粒（包括外泌体）。
最终，被Pellet收集的微粒经过洗涤和再次离心以获得纯化的外泌体。
但这种方法也存在一些问题。
例如：外泌体含量极小，容易堵塞过滤器，处理时间也较长等。
密度梯度离心法这种方法是通过使用梯度浓度离心的离心管来纯化和分离外泌体。
这种方法可以强制微粒沉降到其密度梯度离心中与之匹配的密度位置。
密度高的梯度位置收集纯化的外泌体。
但是，密度梯度离心法也存在一些限制，由于梯度的浓度特性，产生相当多的上清液需要处理。
超滤法超滤法可以使用聚酰胺膜筛，把自然和添加的物质、基质等从水或反向微乳液中移除。
超滤法是一种最新的外泌体提取方法。
此方法是通过微孔膜以外泌体大小排除液体中的大分子物质，而留下外泌体和其他小分子在膜上。
最后，外泌体可以从膜上收集。
但是此方法也存在缺陷，需要更昂贵的设备，如超滤膜和超滤器等。
2. 未来发展方向虽然以上方法都有其优点和缺陷，但随着技术的发展和研究的深入，可能会出现新的外泌体提取方法，以更快捷、更准确、更方便的方式提取外泌体。
例如，利用氮氧化物处理方法，可以在不使用离心机和过滤器的情况下，快速提取外泌体。
这种方法可以在较少的研究时间内提取足够数量的外泌体。
随着技术的不断发展，人们希望设计出更加高效的方法，以便更好地应用于外泌体的研究中，更广泛地使用这些方法，并更好地理解外泌体的分子机制。
外泌体提取方法外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，它们在细胞间传递信息，参与调控细胞的生理活动，对于细胞间的相互作用和信号传导起着重要的作用。
因此，外泌体的提取方法对于细胞生物学和临床医学研究具有重要意义。
下面将介绍几种常用的外泌体提取方法。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液进行低速离心，去除细胞残渣和细胞碎片，然后将上清液进行高速离心，将外泌体沉淀下来。
最后，用洗涤液洗涤沉淀物，得到纯净的外泌体。
这种方法操作简单，提取效率高，适用于大规模提取外泌体。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜对细胞培养液进行过滤，将外泌体从培养液中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，操作简便，适用于小规模外泌体提取。
但是需要注意的是，选择合适的超滤膜孔径和分子量截留率，以确保外泌体能够有效地被提取出来。
3. 密度梯度离心法。
密度梯度离心法是利用不同密度的梯度液体将外泌体与其他细胞成分分离开来。
首先，将细胞培养液加入密度梯度离心管中，然后进行超速离心，外泌体会沉淀在不同密度的梯度液体中。
通过调整离心参数，可以将外泌体从其他细胞成分中有效地提取出来。
这种方法提取的外泌体纯度较高，适用于对外泌体纯度要求较高的实验。
4. 免疫亲和法。
免疫亲和法是利用外泌体表面蛋白与特定抗体的结合来提取外泌体。
首先，将抗体固定在亲和树脂上，然后将细胞培养液与亲和树脂进行免疫反应，外泌体会与抗体结合，然后通过洗涤等步骤将外泌体从亲和树脂上提取出来。
这种方法可以选择特定的外泌体蛋白进行提取，适用于对外泌体特定蛋白的研究。
总结。
外泌体的提取方法多种多样，可以根据实验的需要选择合适的方法。
在进行外泌体提取时，需要注意操作规范，避免外泌体的污染和损失。
同时，根据实验要求选择合适的提取方法，可以提高外泌体的提取效率和纯度，为后续的实验研究提供可靠的样品。
希望以上介绍的外泌体提取方法能够对您的研究工作有所帮助。
外泌体提取鉴定1. 介绍外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一种由细胞分泌的小型膜囊泡，具有重要的生物学功能。
它们主要通过胞吐（exocytosis）的方式释放到细胞外，可以携带多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
外泌体的提取鉴定是一项关键的研究技术，可以帮助我们了解外泌体的组成、功能以及其在疾病诊断和治疗中的潜在应用。
2. 外泌体提取方法外泌体的提取方法有多种，常用的方法包括超速离心法、密度梯度离心法、尺寸排除柱法等。
2.1 超速离心法超速离心法是最常用的外泌体提取方法之一。
该方法通过多次离心步骤，逐渐提高离心速度，使外泌体沉淀。
离心步骤通常包括低速离心、高速离心和超高速离心。
低速离心一般在300g-2000g的离心力下进行，用于去除细胞碎片和大颗粒物质。
高速离心一般在10000g-20000g的离心力下进行，用于沉淀较大的外泌体。
超高速离心一般在100000g以上的离心力下进行，用于沉淀较小的外泌体。
2.2 密度梯度离心法密度梯度离心法利用外泌体与离心液中不同密度的物质在离心过程中的分层原理，实现外泌体的提取。
常用的密度梯度离心液包括葡萄糖、蔗糖和乳酸等。
离心过程中，外泌体会在离心液中沉淀到特定的密度层，然后可以通过离心收集到外泌体。
2.3 尺寸排除柱法尺寸排除柱法是一种基于外泌体粒径的提取方法。
该方法利用尺寸排除柱的特殊结构，可以将大颗粒物质和细胞碎片滞留在柱中，而将外泌体通过柱床，实现外泌体的提取。
尺寸排除柱法操作简便，提取效果较好，适用于小样本量的外泌体提取。
3. 外泌体鉴定方法外泌体的鉴定方法主要包括电子显微镜观察、蛋白质分析、核酸分析和功能鉴定等。
3.1 电子显微镜观察电子显微镜是观察外泌体形态和结构的重要工具。
通过电子显微镜观察，可以看到外泌体的膜结构、大小和形状等特征。
电子显微镜观察可以直观地确认提取到的颗粒是否为外泌体。
3.2 蛋白质分析蛋白质分析是外泌体鉴定的重要手段之一。
外泌体提取方法比较外泌体是一种细胞外膜囊泡，通过一系列特殊的细胞分泌机制，从宿主细胞中释放出来。
外泌体中富含多种生物活性分子，如蛋白质、核酸、脂质和代谢产物等，对细胞间信息传递、免疫反应、炎症调节等生理和病理过程具有重要作用。
因此，外泌体的提取和分离成为研究其功能和应用的重要步骤。
目前常用的外泌体提取方法包括差速离心、超滤、密度梯度离心、覆膜及抗体磁珠法等。
以下将对这些方法的原理、优缺点进行详细介绍。
1.差速离心法：差速离心是一种简单且常用的外泌体提取方法。
它是通过逐步增加离心力，将细胞碎片和大颗粒物质从上清液中分离出来，最后得到外泌体的方法。
优点是操作简单、效果可靠，适用于大规模外泌体提取。
缺点是纯度较低，提取得到的外泌体中可能夹杂有其他细胞碎片和蛋白质聚集体。
2. 超滤法：超滤法是利用滤膜孔径选择性筛选颗粒物质的方法。
通常使用滤孔直径为20-100 nm的滤膜进行过滤，将大颗粒物质和细菌滤出，实现外泌体的提取。
优点是简便快速，可以得到较高纯度的外泌体。
缺点是容易因滤膜堵塞导致提取效果不佳，并且只能得到一部分外泌体。
3.密度梯度离心法：密度梯度离心法是根据物质密度的差异进行分离的方法。
通常使用等体积或等体积百分比的梯度溶液（如葡萄糖或蔗糖）进行离心，不同密度的物质会在梯度中分层沉淀。
外泌体的密度较低，往往在低密度梯度中聚集。
优点是可以分离得到高纯度的外泌体，并且可以细致分离不同类型的外泌体。
缺点是操作复杂，耗时较长。
4.覆膜法：覆膜法是指通过将培养基中的细胞和碎片离心去除后，直接在细胞上清液上方加入覆盖材料（如覆膜、多孔膜等），使外泌体通过覆盖材料进入上清液的方法。
优点是操作简单，不需要额外的离心步骤。
缺点是提取得到的外泌体纯度较低，可能夹杂有其他颗粒物质。
5.抗体磁珠法：抗体磁珠法是利用表面覆盖特定抗体的磁性微珠，通过与外泌体表面标记物质的特异性结合来实现外泌体的提取。
优点是提取效果稳定，纯度较高，可以选择性地提取一些类型的外泌体。
??外泌体（Exosome）发现于1986年，是一种直径约30~100nm的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。
外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关[1][2]。
由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。
据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：1、超速离心法（差速离心）超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。
超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量[3]。
2、密度梯度离心在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。
通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。
此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。
3、超滤离心[4]由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。
超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。
4、磁珠免疫法外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白）[5]，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。
外泌体提取方法比较外泌体（extracellular vesicle，EVs）是一类广泛存在于体液中的细胞外小囊泡，它们由细胞释放并包裹着细胞膜，可携带细胞成分如蛋白质、核酸、脂质等，具有重要的生物学功能。
因此，外泌体提取方法的研究和比较对于深入了解和应用外泌体具有重要意义。
目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、凝胶过滤法、免疫亲和法、磁珠法和化学法等，下面将对这些常用的方法进行比较。
超速离心法是提取外泌体最常用的方法之一，其主要步骤包括差速离心和超速离心。
由于外泌体的大小范围相对较小（30-150 nm），因此要通过不同的转速和不同的时间对样品进行逐步的离心，以获得纯化的外泌体。
超速离心法的优点是提取到的外泌体数量较多，但存在一定的缺点，如操作复杂、时间长、成本高以及无法彻底除去离心的其他细胞碎片。
凝胶过滤法是利用凝胶纤维通过外泌体的大小选择性提取外泌体。
它的优点是简单易行，不需要专门的设备和耗材，但提取到的外泌体数量较少，可能存在一定的纯度问题。
免疫亲和法是通过特异性抗体与特定外泌体表面标志物的结合，利用磁珠等载体进行外泌体的提取。
免疫亲和法的优点是操作简单、提取到的外泌体纯度较高，但需要进行专门的抗体标记和染色，成本较高。
磁珠法是利用具有亲和性的磁性材料提取外泌体。
这种方法具有操作简单、纯度较高的优点，但对于部分磁性材料的购买和使用有一定的限制。
化学法主要是利用有机溶剂和离子液体等化学方法来提取外泌体。
这种方法相对较新，属于非常规的提取方法之一、虽然其操作简便，但由于存在一定的化学毒性和对溶剂残留的担忧，目前该方法的应用还相对较少。
总的来说，不同的外泌体提取方法各有优缺点，具体选择哪一种方法需要根据实际需求进行评估。
超速离心法、凝胶过滤法和免疫亲和法是目前应用较广泛的方法，它们在纯度、操作简便和提取效率等方面各有优劣。
未来的研究可以探索新的、更高效的提取方法，以满足外泌体研究的不断需求。
两种提取细胞外泌体方法的比较周昌娈;谭磊;谢军;丁铲【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)002【摘要】近期研究发现外泌体在很多生理病理过程中起着重要作用,因而外泌体已成为当前的科研热点.本研究从外泌体形态、标志蛋白的表达方面比较了HeLa细胞外泌体的两种常用提取方法,以期获得更有效地提取Hela细胞中的外泌体方法.利用电镜观察两种方法提取的外泌体形态;动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测定外泌体颗粒大小及分布,蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测外泌体标志蛋白CD63、CD81的表达.结果显示,差速离心法与PEG沉淀法所提外泌体都呈茶托样双层膜结构,直径约30~150 nm,无明显形态差异,外泌体标志蛋白正常表达,但PEG沉淀法要引入PEG,有可能影响外泌体生物活性,可见,差速离心法是一种更可靠的有效提取外泌体的方法.%Recent studies have found that exosomes play an important role in many physiological and pathological processes. Thus, exosomes have become a current research hotspot. We compared two common methods of extracting HeLa exosomes to obtain some reliable and effective exosomes. The morphology of exosomes extracted by differential centrifugation method and polyethylene glycol (PEG) precipitation method was observed by electron microscopy. The size and distribution of particles from the samples was detected by dynamic light scattering (DLS). The expression of the exosome marker protein,CD63 and CD81, was analyzed by Western blot. We found that exosomesextracted with differential centrifugation method and PEG precipitation method both have saucer like membrane structure, and their diameters are around 30~150 nm. There are no significant morphological differences between exosomes isolated with these two methods. The exosome marker proteins were normally expressed. Thus, compared with PEG precipitation method, differential centrifugation method could be a more reliable and effective method of extracting exosomes.【总页数】4页(P64-67)【作者】周昌娈;谭磊;谢军;丁铲【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;西北民族大学,兰州730030;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较 [J], 郭莹;王秀伟;牛玉虎;王莉;周楠;李佰一;王振东;张蘋;高亚杰;牛勃;2.两种人脐带间充质干细胞源外泌体分离方法的比较 [J], 刘高米洋;潘兴华;和法莲;陆容;刘菊芬;何洁;王红阳3.超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞培养上清外泌体的方法学比较 [J], 范维肖;刁艳君;马越云;郝晓柯4.两种提取小鼠血清来源外泌体方法的比较 [J], 孙有良; 王宇童5.肝星状细胞来源外泌体不同提取方法的比较 [J], 黄小莉; 赵颖; 刘莹莹; 丛敏; 李长英; 王晓凡; 刘琳; 刘天会; 王萍; 王宇童因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血清外泌体提取方法(一)血清外泌体提取方法1. 超速离心法•使用超速离心机将血清样本离心，离心速度一般在10,000 g以上。
•离心后，将上清液转移到新的离心管中，避免沉淀物的干扰。
2. 滤膜法•将血清样本通过0.22微米的滤膜过滤器进行过滤，以去除大部分细胞和碎片。
•过滤后的上清液就是富含外泌体的样本，可以用于进一步提取和研究。
3. 差速离心法•使用差速离心机，先进行低速离心，去除大部分细胞和碎片。
•然后将上清液转移到新的离心管中，进行高速离心，富集外泌体。
•最后将上清液转移至新的离心管中，以去除杂质，得到纯净的外泌体样本。
4. 密度梯度离心法•制备不同密度梯度的离心液，将血清样本与离心液混合。
•使用超速离心机进行离心，外泌体会在不同密度梯度的离心液层中分布。
•取出目标密度层中的外泌体，进行后续研究。
5. 抗体亲和法•利用特定的抗体对外泌体表面的蛋白进行识别和结合。
•通过结合特定的抗体，可以将外泌体与其他细胞碎片和蛋白质区分开来。
•进一步使用离心等方法，将外泌体富集提取。
6. 生物素链霉亲和法•将生物素链霉素与其他蛋白结合，并加入血清样本中。
•生物素链霉素会特异性地结合外泌体表面上的生物素结合受体。
•利用生物素链霉素的亲和性，将外泌体富集提取出来。
7. 电泳法•使用凝胶电泳将血清样本进行分离。
•外泌体会在凝胶中迁移，形成独特的带状图案。
•通过裁剪目标带进行提取和研究。
以上是一些常用的血清外泌体提取方法，每种方法都有其优缺点和适用范围。
在选择方法时，需要根据实验目的和具体情况进行综合考虑。
8. 静电荧光法•利用外泌体表面的电荷性质，通过静电作用将外泌体富集提取。
•常用的静电荧光染料有山萸苷、草酸黄等，可与外泌体表面的负电荷相互吸引。
•通过荧光信号的增强，可以富集和检测外泌体。
9. 残余血小板法•血浆中存在大量的残余血小板，这些血小板上富集有很多外泌体。
•使用低速离心法去除大部分细胞和碎片后，对残余血小板进行高速离心，获取外泌体样本。
血清外泌体提取方法血清外泌体（extracellular vesicles, EVs）是细胞释放的一类小型膜囊泡，内含丰富的蛋白质、核酸和代谢产物，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
为了从血清中提取血清外泌体，以下是十种常用的方法，并对每种方法进行详细描述：1. 超速离心法：将血清进行低速离心，去除细胞碎片和大的膜囊泡，然后再将上清液进行高速离心，获得血清外泌体。
2. 密度梯度离心法：将血清样品与密度梯度溶液混合，进行离心，血清外泌体会分布在不同密度的梯度区域，然后可以分层收集血清外泌体。
3. 尺寸排除色谱法：使用尺寸排除色谱柱来分离血清外泌体，根据外泌体的大小，使得外泌体能够通过或滞留在柱上，然后收集滞留在柱上的外泌体。
4. 抗体磁珠法：使用特定外泌体表面标记的抗体磁珠，在血清中捕获外泌体，并通过磁力分离的方法将外泌体与其他成分分离。
5. 商业试剂盒法：市面上有很多专门用于提取血清外泌体的商业试剂盒，这些试剂盒通常包含了提取和富集外泌体的试剂和相关操作步骤。
6. 过滤法：使用不同孔径的滤膜，将血清进行过滤，外泌体会在滤膜上滞留，然后收集滞留的外泌体。
7. 微流控芯片法：使用微流控芯片，通过微流体的操控来分离和富集外泌体。
8. 电泳法：将血清样品进行电泳，根据外泌体的电荷和尺寸差异，使其在电泳过程中迁移，并在特定位置收集外泌体。
9. 裂解法：以裂解细胞膜的方法来释放细胞内外泌体，然后通过离心等方法来获得纯净的血清外泌体。
10. 光学方法：利用光学原理和技术，如光操控、光拉曼等，来分离和富集外泌体。
这些方法各有优劣，选择哪种方法取决于实验室的具体需求和仪器设备的可用性。
提取血清外泌体的方法也是一个不断发展和改进的领域，未来可能会出现更多的提取方法和技术。
不同离心方法提取及鉴定精浆外泌体的效果比较郭文彬，张万松，杨诚，卞军，杨建昆，刘存东，亓涛，王春艳［摘要］目的超速离心法、ExoPerfect TM ⁃MU 法和PEG6000法比较提取精浆外泌体的应用报道较少。
文中旨在比较及鉴定超速离心法，ExoPerfect TM ⁃MU 法及PEG6000法提取的精浆外泌体，为外泌体的研究提供不同的选择方法。
方法收集2017年3月至7月南方医科大学南方医院检验中心30例正常志愿者的精浆样本。
随机平均分成3份，分别采用超速离心法，ExoPerfect TM ⁃MU 法及PEG6000法获取提取物，随后采用纳米颗粒跟踪分析仪分析其大小，透射电子显微镜观察其形态，蛋白印迹法检测其典型标志蛋白质。
结果超速离心法提取的精浆外泌体中CD63、TSG101含量[（3.29±0.22）、（0.84±0.03）]最多，其次分别是ExoPerfect TM ⁃MU 法[（3.25±0.17）、（0.75±0.02）]、PEG6000法[（2.62±0.06）、（0.54±0.10）]，差异有统计学意义（P <0.05）。
纳米颗粒跟踪分析仪结果提示MODE 曲线线性流畅，精浆外泌体直径大小较为集中,粒径峰值平均值分别为105、102、115nm ，差异无统计学意义（P >0.05）。
PEG6000法提取精浆外泌体的浓度、电镜下数量[（11.90±1.78）×108/mL 、（4.7±1.7）个]较超速离心法[（21.20±0.98）×108/mL 、（7.0±1.6）个]，ExoPerfect TM ⁃MU 法[（19.74±1.45）×108/mL 、（6.0±1.63）个]均明显降低（P <0.01）；ExoPerfect TM ⁃MU 法离心时间[（30±5）min]较超速离心法、PEG6000法[（140±20）、（120±10）min]明显缩短（P <0.001）。
广东化工 2019年第2期第46卷总第388期-23 -大鼠血清外泌体不同提取方法的比较罗哲斯，钟成勇，秦转，李艳文，毛建文**［收稿日期］2018-11-28［基金项目］广东省高等学校“千百十工程”人才培养项目(2015cxqx214)［作者简介］罗哲斯(1992-),女，广东清远人，硕士研究生，主要研究方向为分子药理学。
*为通讯作者：毛建文，男，湖南人，博士，教授，主要从事离子通道蛋白与疾病及外泌体功能的研究。
(广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州510006)［摘 要］目的：比较大鼠血清外泌体的不同提取方法，优化PEG 聚沉法。
方法：分别采用差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法及优化后的PEG 聚沉法提取分离血清外泌体。
通过Western Blotting 检测外泌体标记蛋白：透射电镜观察形态。
结果：Western Blotting 检测出外泌体 的标记蛋白：电镜下观察到差速超速离心法和优化后的PEG 聚沉法提取的外泌体粒径在100 nm 左右，呈双层膜结构，试剂盒法和PEG 聚沉法 提取的外泌体形态大小不一，杂质偏多。
结论：优化后的PEG 聚沉法能成功提取血清外泌体，此方法操作简便、耗时短、成本低，是可靠且有 效的外泌体提取方法。
［关键词］血清；外泌体；PEG ；差速超速离心；试剂盒［中图分类号］TQ ［文献标识码］A［文章编号］1007-1865(2019)02-0023-02Comparison and Optimization of Different Methods for the Extraction of RatSerum-derived ExosomesLuo Zhesi, Zhong Chengyong, Qin Zhuan, Li Yanwen, Mao Jianwen *(School of Life Sciences and Biopharmaceuticals, GuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou 510006, China)Abstract: Objective: To compare different extraction methods of rat serum-derived exosomes and optimize PEG coagulation to obtain more efficient and practical extraction techniques. Methods: Serum exosomes were extracted and separated by differential ultracentrifugation method, kit method, PEG coagulation method and optimized PEG coagulation method. The exosomal marker proteins were detected by Western blotting; the morphology was observed by transmission electron microscope.Results: The expression of exosome labeled protein HSP70, CD63 and TSG101 in exosomes protein obtained by all four extraction methods could detected by Western blotting. The exosomes extracted by differential ultracentrifugation method and optimized PEG coagulation method show a particle size of about 100 nm and a double-layer membrane structure under transmission electron microscope. The exosomes extracted by the kit method and PEG coagulation method were impurities and not uniform in size. Conclusion: The optimized PEG coagulation method was successfully used to extract and separate rat serum-derived exosomes. Compared with the existing methods, this method has the advantages of easy operation, short time-consuming, low-cost and effective.Keywords: Serum ； exosomes ； PEG ； differential ultracentrifugation ； Exo Quick1前言外泌体是指包含了多种mRNA 、miRNA 和蛋白质的微小囊 泡，直径在30〜150nm 之间，呈茶托形或一侧凹陷的半球形结构。
1987年，Johnstone 将其命名为"exosome"⑴。
其主要来源于细 胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜 融合后释放到胞外基质中［2】。
Tucci M 等人研究发现，转移性黑素 瘤患者的血清中能提取到黑色素瘤细胞分泌的外泌体，并检测岀 所患转移性黑色素瘤是否对化疗药物敏感⑶。
与此类似,Repiska G 等人发现，从孕妇血清中提取的外泌体能检测到胎儿的DNA 【4】。
由此可见，血清外泌体能够参与到病理生理过程中。
目前我们对血清外泌体的研究尚处于初级阶段，要想实现最 终的临床上的指导应用，还有许多亟待解决的难题。
其中，从成 分复杂的血清中获得结构完整，形态大小均一，并保留其生物学 特性的外泌体，是目前的一个重难点⑸。
现阶段外泌体的提取方 法主要有：超速离心法、密度梯度离心法、色谱法、过滤离心和 试剂盒提取法等。
本文就将差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚 沉法和优化后的PEG 聚沉法用于血清外泌体的提取并进行比较， 期望获得简便快捷和性价比高的提取方式。
2实验材料与方法2.1试剂及仪器PEG 6000(E125BA0029)购自生工生物工程股份有限公司； Total Exosome Isolation (00520032)购自 Invitrogen 公司；CD63 抗 体(BA1584)和TSG101抗体(PB0550)购自武汉博士德生物工程有 限公司，HSP70抗体(AH728)购自上海碧云天生物技术有限公司； L-100XP 低温超速离心机购自美国Beckman 公司；透射电镜 (H7650)购自日本Hitachi 公司。
2.2实验方法2.2.1差速超速离心法提取外泌体取1 mL 大鼠血清，加入19 mL PBS, 300 g, 4 °C 离心10 min 。
取上清转移到新的离心管中，2000 g, 4 °C 离心10 mine 取上清 转移至新的离心管，10000 g, 4 °C 离心30 min ；取上清置于超离 管中，100000 g, 4 °C 离心70 min,去上清，加入20 mL PBS 重悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。
2.2.2试剂盒法提取外泌体按照Total Exosome Isolation (00520032)试剂盒说明书进行提取。
2.2.3 PEG 聚沉法提取外泌体16 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 超纯水配制成 8%PEG 6000(2X)溶液；10 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 痼纯水配制 成 5%PEG6000(2X)溶液。
取ImL 大鼠血清,2000g,4 °C 离心30 min 。
取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。
去除上清，用PBS 重悬后加入5%PEG6000(2X), 4匸静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h,底部沉淀即外泌体。
2.2.4 PEG 聚沉法经超速离心法优化提取外泌体取1 mL 大鼠血清，2000 g,4 °C 离心30 min 。
取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。
去除上清，用20 mL PBS 重悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。
2.2.5提取外泌体总蛋白及免疫印迹裂解上述外泌体并提取其总蛋白，以等样蛋白浓度跑10%丙 烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 2 h, 4 °C 孵育HSP70、CD63和TSG101 —抗过夜，加入相应二 抗室温孵育lh 后，于蛋白成像系统中进行曝光成像，拍摄图片。
2.2.6形态学分析取上述外泌体于铜网上，负染后在透射电镜下观察其形态。
3结果3.1外泌体标记蛋白HSP70、CD63、TSG101表达的检测差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法、经超速离心法优 化的PEG 聚沉法所提的外泌体中均检测到外泌体标记蛋白 HSP70、CD63和TSG101的表达，四种方法没有明显差别，见图 lo广东化工2019年第2期第46卷总第388期•24•UC Exo Q PEG PEG+UC HSP70CD63TSG101UC：差速超速离心法；ExoQ：试剂盒法；PEG：PEG聚沉法；PEG+UC：经超速离心法优化的PEG聚沉法图1HSP70、CD63、TSG101在不同方法所提的外泌体中的表达Fig.1The expression of HSP70,CD63and TSG101in exosomesisolated from different methods3.2外泌体透射电镜下形态学检测在透射电镜下观察，四种方法所提取的外泌体形态如图2所示。
