溶血性链球菌的检验

链球菌属的特性及其检验作者：陆德胜来源：《中国当代医药》2010年第31期[摘要] 目的：总结链球菌属的特性及其检验技术，结合临床经验，进一步提高细菌分离及鉴定水平。

方法：采用显微镜检查、分离培养、细菌生化反应、血清学试验等进行分离和鉴定。

结果：根据菌体形态、菌落形态、溶血特征将链球菌分为甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型链球菌；按链球菌细胞壁中多糖抗原不同，可分成A、B、C、D等20个群。

结论：链球菌是临床常见的致病菌，正确掌握检验方法，科学地分离和鉴定，有助于临床做出合理的诊治决策。

[关键词] 链球菌属；特性；分离培养；生化反应；血清学试验[中图分类号] R446.5[文献标识码] B [文章编号] 1674-4721（2010）11（a）-080-02链球菌属细菌广泛分布于自然界、人及动物肠道和鼻咽部，大多数不致病。

其中A、B群及肺炎链球菌是本属的3种重要致病菌，可引起各种化脓性炎症、医源性伤口感染、新生儿败血症、细菌性心内膜炎以及风湿热、肾小球肾炎等超敏反应性疾病[1]。

另外草绿色链球菌为条件致病菌。

因此，本属细菌的鉴定、药敏试验是微生物检验工作的重要内容之一，临床上常见的标本包括咽拭子、痰液、分泌物、穿刺液、尿液、脑脊液和血液。

现将本属的特性及其检验总结如下：1 资料与方法1.1一般资料本院微生物实验室2009年共接收咽拭子样本299例、痰液样本1 319例、分泌物817例、穿刺液239例、尿液704例、脑脊液54例和血液培养815例，合计4 247例。

其中门诊患者样本239例，住院患者样本4 008例。

细菌培养阳性结果1 475例，阳性率为34.73%。

其中链球菌属阳性83例，占5.63%。

1.2 检验方法根据不同疾病采集不同标本。

1.2.1 显微镜检查咽拭子、痰液、脓液、穿刺液、脑脊液等标本可直接涂片革兰染色，镜检见链状排列革兰阳性球菌可初步报告，及时供临床参考。

1.2.2 分离培养血液标本需要先增菌培养，脓液、咽拭可直接接种血琼脂平板。

【GB/T 4789.11—1994】食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中溶血性链球菌的检验方法。

本标准适用于食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检验。

2 引用标准GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3.1 温箱：36±1℃。

3.2 水浴：36±1℃。

3.3 显微镜。

3.4 离心机。

3.5 试管架。

3.6 灭菌平皿。

3.7 灭菌小试管。

3.8 载玻片。

3.9 灭菌吸管：1mL、10mL。

3.10 灭菌镊子。

3.11 均质器。

3.12 酒精灯。

3.13 接种环。

4 培养基和试剂4.1 葡萄糖肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定，在肉浸液肉汤内加入1%葡萄糖。

4.2 肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定。

4.3 匹克氏肉汤：按GB 4789.28中4.62规定。

4.4 血琼脂平板：按GB 4789.28中4.6规定。

4.5 人血浆。

4.6 0.25%氯化钙。

4.7 灭菌生理盐水。

4.8 杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。

5 检验程序（图略）6 操作步骤6.1 样品处理称取25g固体检样；称取25mL液体检样，加入225mL灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。

6.2 一般培养将上述混悬液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤；或直接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36±1℃培养24h，接种血平板，置36±1℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。

6.3 形态与染色本菌呈球形或卵圆形，直径0.5～1μm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。

链球菌属及其检验「微生物检验」链球菌属(Streptococcus)细菌，呈链状排列的革兰阳性球菌，个别种成双排列。

广泛分布于自然界、人及动物肠道和健康人鼻咽部，大多数不致病，致病菌可引起各种化脓性炎症、猩红热、新生儿败血症、细菌性心内膜炎以及风湿热、肾小球肾炎等超敏反应性疾病。

下面是yjbys店铺为大家带来的关于链球菌属细菌的知识，欢迎阅读。

⒈分类链球菌的分类方法尚未统一。

常用下列两种方法。

⑴根据溶血现象：分为3类。

①甲型溶血性链球菌(α-hemolytic streptococcus)：菌落周围有1～2mm宽的草绿色溶血环，称甲型溶血或α溶血，该类菌又称草绿色链球菌，为条件致病菌。

②乙型溶血性链球菌(β-hemolytic streptococcus)：菌落周围有2～4mm宽的透明溶血环，称乙型溶血或β溶血，该类菌又称溶血性链球菌，致病性强，常引起人和动物多种疾病。

③丙型链球菌(γ-streptococcus)：菌落周围无溶血环，因而又称不溶血性链球菌，一般不致病。

⑵根据抗原结构：按链球菌细胞壁中多糖抗原不同，可分成A、B、C、D …等20个群。

同群链球菌间，因表面蛋白质抗原不同又分若干型。

如A群根据其M抗原不同，可分成约100个型;B群分4个型。

对人致病的链球菌菌株，主要是 A群，多数呈现乙型溶血。

⒉细菌特性⑴链球菌① 形态染色球形或椭圆形，直径0.5～1.0μm，链状排列，链的长短与细菌的种类和生长环境有关，在液体培养基中形成的链较长。

无芽胞，无鞭毛。

多数菌株在培养早期(2～4h)形成透明质酸的荚膜。

革兰染色阳性。

②分离培养要求较高，培养基中需加入血液或血清、葡萄糖、氨基酸、维生素等物质。

多数菌株兼性厌氧，少数为专性厌氧。

在液体培养基中呈沉淀生长，在血平板上，37℃18～24h后可形成灰白色、圆形、凸起、光滑、直径为0.5mm～0.75mm的细小菌落，菌落周围出现不同类型的溶血环。

③生化反应触酶阴性、一般不分解菊糖，不被胆汁溶解，这两特性可用来鉴别甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌。

抗链球菌溶血素“O"试验参考范围：免疫比浊法：0～200 u/ml临床评价：1．链球菌溶血素“O”（ASO）是A群链球菌的代谢产物之一，它是一种具有酶活性的蛋白质，能溶解红细胞，也能破坏白细胞和血小板。

溶血素“O”具有很强的抗原性，机体受A群链球菌感染后可产生溶血素“O”抗体，这种抗体可以抑制溶血素“O”的溶血作用。

通过测定血清中ASO水平，有利于A群链球菌感染的诊断。

2．当ASO试验呈阳性反应，且抗体滴度有逐步增高趋势时，即具有诊断参考价值。

主要见于A群链球菌感染后引起的变态反应性疾病，如风湿热、急性肾小球肾炎等，还可见于A群链球菌感染所致的上呼吸道炎症(咽炎或扁桃体炎)。

85％～90％的患者感染后2周左右到病愈后数月至年余血清中均可测到ASO。

应用ELISA可检测患者血清中的IgM型和IgG 型ASO特异性抗体，IgM-ASO多见于感染的急性期，IgG-ASO见于恢复期。

抗体效价逐步下降时为疾病缓解期，抗体恒定在高效价水平多为非活动期。

3．咽拭培养直接分离病原菌是诊断A群链球菌感染的可靠方法，急性风湿热发作时阳性率可高达70％～90％。

进行多项链球菌抗体试验，可提高对A群链球菌感染诊断的准确率。

这些试验包括抗链球菌激酶(ASK)，抗脱氧核糖核酸酶B(ADNase B)，抗链球菌二磷酸吡啶核苷酸酶(ADPNase)和抗透明质酸酶(AH)等，其中ASK试验是新近链球菌感染的一个非常敏感的指标。

其它实验室检查还有红细胞沉降率，血清C-反应蛋白试验，血清补体C3、C4成分测定等，上述项目联合应用对A群链球菌感染所致疾病有一定辅助诊断意义。

4．影响本试验结果的因素(1)单一次试验结果对诊断意义不大。

(2)链球菌溶血素“O”在Ph6.5环境中活性最强，偏酸或偏碱都可影响其活性。

(3)在溶血抑制法中，血清溶血、黄疸、高胆固醇或血清保存过久污染长菌者，皆可致试验结果偏高，胆固醇有抑制溶血素活性的作用。

溶血性链球菌检验操作规程溶血性链球菌（英文简称：S. pyogenes）是一种常见的革兰氏阳性球菌，通常引起咽峡炎、皮肤感染和淋巴结炎等疾病。

准确的检测和鉴定溶血性链球菌对于诊断和治疗这些疾病至关重要。

下面是关于溶血性链球菌检验的操作规程。

一、检验前准备1. 检验人员需佩戴好防护用具，如实验手套、隔离眼镜和口罩。

2. 准备好所需的检验试剂和材料，包括培养基、琼脂培养基、草莓牛血琼脂、货架刀等。

3. 仔细核对标本的标签和信息，确保和病人信息一致。

二、标本采集和处理1. 从患者口咽部或其他可疑感染部位采集标本，如咽拭子或分泌物样本。

2. 将标本稀释或切碎，使其与培养基充分混合。

3. 使用棉签或货架刀，将混合好的标本涂抹在琼脂培养基上。

三、培养和鉴定1. 将含有标本的琼脂培养基置于37℃恒温箱中培养18-24小时。

2. 观察培养基上是否有溶血环形形成，表明有溶血性链球菌的存在。

3. 将溶血环形的菌落或单个菌落划取到草莓牛血琼脂上。

4. 再次置于37℃恒温箱中培养18-24小时。

5. 观察草莓牛血琼脂上生长的菌落形态和特征。

6. 进一步进行革兰染色，观察菌形和细胞特征。

四、药敏试验对已鉴定的溶血性链球菌，可以进行药敏试验以确定对何种抗生素敏感。

1. 用细菌悬浮液调整到0.5～0.6麦克法尔兰（McFarland）标准。

2. 使用含有不同抗生素的纸片置于琼脂平板上。

3. 用择菌钳将纸片粘贴于琼脂平板上。

4. 将准备的溶血性链球菌悬液均匀涂抹在琼脂平板上。

5. 将琼脂平板置于37℃恒温箱中培养18-24小时。

6. 观察菌落的生长和抗生素纸片周围的抑制圈，根据直径大小判断菌株的抗药性。

五、结果判定和记录根据溶血环形、菌落形态、革兰染色和药敏试验的结果，判定溶血性链球菌的存在和鉴定结果，并将结果准确记录在检验报告中。

操作规程中的注意事项：1. 检验过程中应严格遵守无菌操作，避免交叉感染。

2. 确保检验室设备和培养基的质量，以及培养温度和时间的准确控制。

一、编制目的为规范本单位β型溶血性链球菌的检测编制本作业指导书。

二、适用范围本指导书适用于食品中β型溶血性链球菌的测定。

三、编制依据GB/T 4789.11-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验》四、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：36℃±1℃；b)冰箱：2℃~5℃；c)厌氧培养装置；d)天平：感量0.1g；e)均质器与配套均质袋；f)显微镜：10×～100×；g)无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头h) 三角烧瓶；i)无菌培养皿：直径90mm；j)pH计或pH比色管或精密pH试纸；k)水浴装置：36℃±1℃；l)微生物生化鉴定系统。

五、培养基和试剂5.1.改良胰蛋白胨大豆肉汤5.2 哥伦比亚CNA血琼脂5.3 哥伦比亚血琼脂5.4 革兰氏染色液5.5 胰蛋白胨大豆肉汤5.6 草酸钾血浆5.7 0.25%氯化钙（CaCl2）溶液5.8 3%过氧化氢（H2O2）溶液5.9生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡六、检验程序溶血性链球菌检验程序见图1图1溶血性链球菌检验程序七、操作步骤7.1样品处理及增菌以无菌操作取样25g（ml），加入装有灭菌225mlmTSB的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000 r/min均质；或加入装有225ml mTSB的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可。

于36℃±1℃，厌氧培养18h～24h。

7.2 分离将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂，36℃±1℃，厌氧培养18h～24h，观察菌落形态。

溶血性链球在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约2mm~3mm,灰白色、半透明、光滑、表面凸起、圆形、边缘整齐，并产生β型溶血。

7.3 鉴定7.3.1分纯培养挑取5个（如小于5个则全选）可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃，培养18h～24h。