高等分析化学7.免疫分析

这些抗体分子的组成、结构、和抗原的 亲和力、结合部位、产物均有所不同，所以抗 血清中是各种免疫球蛋白的混合物。这种抗体 称之为〝多克隆抗体〞。 因此，要使免疫分析有高度的选择性、 很高的精密度，必须避免多克隆抗体的产生， 而只克隆一种专有的、针对一种它可识别的并 与之反应的抗原的抗体。这种抗体被称为〝单 克隆抗体〞。有了这种单克隆抗体，可以将其 在体外培养液中继续培养，或接种在小鼠腹腔 内传代，大量制备。这是免疫分析的难题和前 沿技术。
7.3.2 多抗与单抗
从抗血清中获得的抗体多为各免疫球蛋白 的混合物。虽然用于免疫分析的效果良好， 但缺点是抗体不唯一，分布也不均匀，来源 是间断的。对不同批次的同种样品的检测， 存在较大的偏差，即数据重现性不很好。根 本原因是：生物体受到抗原刺激后，抗原分 子上的许多抗原决定簇分别激活具有不同基 因的B淋巴细胞，这些被激活的不同类型的B 淋巴细胞将产生不同的细胞分裂、增殖形成 不同类型的抗体分子。
7.5 免疫分析法 7.5.1 非标记免疫分析
〝非标记免疫分析〞又称为〝传统免疫分 析〞。抗体和抗原结合后，抗体可具有某些催 化特性，理化性质也有一些变化。若反应产物 缺乏高灵敏度的分析信号(电、磁、光、色、热 等) ，仍然难以检测。非标记免疫分析唯一可 利用的分析信号就是沉淀现象。这需要抗原与 抗体结合形成大分子沉淀，以此定性和定量分 析抗原。沉淀反应并不是那么灵敏，因此非标 记免疫分析的应用受到限制。
在抗原－抗体的反应体系中引入探针技 术，这种技术称作〝标记技术〞，用这种技 术进行检测。由于探针分子或离子信号的多 样化及高灵敏度，使得免疫分析可以进行痕 量和超痕量分析。 (1) 放射性免疫分析(RIA) 探针有放射性，这种免疫分析称为〝放 射性免疫分析〞。放射性免疫分析法具有突 出的优点： a) 灵敏度非常高，可检测的含量范围为 10-9~10-12g/g。
第七章 免疫分析
7.1 免疫分析概述
在人与脊椎动物体内，存在着具有免疫 识别功能的生物组织，称为〝免疫系统〞。 主要组织有：淋巴组织、免疫活性细胞、免 疫活性介质等。当外源性物质即〝抗原〞入 侵高等生物体后，免疫系统就会被其激活， 会有针对性地产生一类蛋白质即〝抗体〞， 对外源性物质进行结合，起到分解、破环抗 原的作用，这种反应称为〝免疫反应〞。减 低和消灭抗原物质对生物体的危害作用，达 到〝免疫〞的效果。
7.3.1 免疫球蛋白分子的基本结构
免疫球蛋白结构的确定是免疫化学最大 成果之一。例如：免疫球蛋白IgG由4条多肽 链组成。其中2条多肽链相同，分子量较大， 分别称为重链或H链；另2条多肽链也相同， 但分子量较小，称为轻链或L链。H链与L链 之间或H链与H链之间均借二硫键相连，加上 分子内的氢键等非共价键，共同维系免疫球 蛋白分子的稳定存在。
(2) 分子的大小 完全抗原一般都是大分子物质，小分子 物质大多数是半抗原，需与大分子蛋白结合 才能成为完全抗原。完全抗原分子量越大， 其免疫原性越强。一般讲，分子量>105的蚕 白质才是较强的免疫原；分子量<104的蚕白 质则是弱的免疫原。利用2,4-二硝基苯-寡聚 赖氨酸做免疫实验。当多肽分子为六个以上 氨基酸残基时，能引起免疫响应的最小分子 是升血糖类，即免疫系统被刺激应答了，其 对应的抗原的分子量为3480。一般认为，它 是完全抗原的最小分子量。
免疫反应的最大特点是：抗体对抗原的高度特 异性识别。即有一种抗原，生物体就产生一种特殊 专一的抗体与之结合，而且这种结合非常稳定，稳 定常数一般在109数量级，更有甚者可达1010~1015。 这是一般化学反应不可比拟的。这种专一性水平可 超过酶对底物的识别水平。 例如：对于苯胺环上的取代物，同一位置不同 的取代基苯胺各对应于不同的唯一抗体。抗对氨基 苯磺酸血清只与对氨基苯磺酸反应，而与对氨基苯 甲酸、对氨基苯砷酸均不作用。苯胺环上同一取代 基在不同位置的取代物也各对应于不同的唯一抗体。 抗对氨基苯甲酸血清只与对氨基苯甲酸反应，而与 邻氨基苯甲酸、间氨基苯砷酸均不作用。
7.2.3 影响抗原免疫原性的因素 (1) 异物性 动物种属关系越远，其化学组成和组织 结构差别越大。一种属动物所没有的抗原物 质进入该种属动物后，该动物的免疫原性就 越强。例如：鸡蛋清蛋白对家禽(不同种类的 鸡或鸭、鹅等)是弱免疫原，即对这些家禽类 动物的免疫系统刺激不大，产生的抗体很少。 鸡蛋清蛋白进入家兔体内，则它是一种强免 疫原。所以，很多人工合成的抗原都是动物 体内所没有的物质，它们很容易是强免疫原。
自然界存在的细菌、病毒、蛋白质、多糖和结 合蛋白大多有免疫原性和免疫反应性。这是医学、 生物生命学科、药学等所关注和研究的天然抗原。
(2)人工抗原 通过人工合成的方法，将半抗原(大多数 为有机小分子物质)结合到蛋白质上形成完全 抗原即免疫原。这不仅为医学、生物生命学 科、药学等所关注，而且也被分析化学所关 注与应用。有些有机小分子物质由于种种原 因，不便分析，若将它制成完全抗原，与抗 体结合，可大大提高选择性和灵敏度，使分 析顺利进行。 (3) 合成抗原 人工合成的多肽类化合物，是一种广泛 应用的抗原。
HO3S－Ar－NH2 + HNO2 + HCl →
HO3S－Ar－N≡N+ClHO3S－ArN≡N+Cl- + HOArCH2CH－(HN…)C(=O)… → HOArCH2CH－(HN…)C(=O)…蛋白质酪氨酸残基 | HO3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ－ArN= N (偶氮苯磺酸蛋白)
载体蛋白本身必须是一种完全抗体。因 此产物偶氮苯磺酸蛋白分子量更大，结构更 复杂，也一定是一个完全的抗原。更会诱导 动物体产生抗结合蛋白的抗体和抗氨基苯磺 酸的抗体而存于血清中。 含有抗体的血清称为〝抗血清〞。在抗 血清中既有衍生物抗原的抗体，也有载体蛋 白的抗体。在抗血清中加入载体蛋白，载体 蛋白与载体蛋白抗体将以沉淀的形式被除去， 从而纯化了半抗原抗体(即衍生物抗原所产生 的抗体)。
7.4 抗原－抗体反应 7.4.1抗原－抗体反应的特点
抗体－抗原反应实质上是抗原决定簇与抗体结合 部位的结合，且只限于大分子的表面特定部位，其间 并无共价键形成，只是由氢键、范德华力、静电作用 力和疏水作用等相互作用而结合在一起。分子结构上 的互补性，决定了反应的特异性。 抗体－抗原的结合强度，常用免疫球蛋白的亲和 力的大小来衡量。反应在溶液中是可逆的： Ag (抗原) + Ab(抗体) <=> Ag－Ab(抗原－抗体结合物) 平衡常数为 K = [Ag－Ab] / ([Ag][Ab]) 显然K越大，结合能力越强 。
(3) 化学组成和结构
抗原除要求分子量必须很大外，还应有 复杂的化学组成(有各种化学官能团)和立体结 构(空间位置与构象)。分子量越大、分子空间 结构越复杂即官能团种类、手性对映体越多 的可溶性蛋白质，其免疫原性就越强。如纤 维素虽分子量很大，但结构并不够复杂、单 糖等糖类或因分子量较小，或因结构简单， 都没有免疫原性。而杂多糖类物质因其结构 比多糖复杂得多，具有免疫原性。
在化学和药物分析中，小分子的物质争， 是重要的检测对象。用选择性极强的免疫分 析法，就必须使这些小分子物质具有免疫原 性，才能诱导动物体产生抗体。
例如：小分子的氨基苯磺酸没有免疫原 性，可利用重氮化反应使其重氮化，再与合适 的蛋白质肽链上的酪氨酸残基偶氮化而结合。 产物因蛋白质肽而有了免疫原性。这种将无 免疫原性的物质通过反应结合成有免疫原性 抗体的蛋白叫〝载体蛋白〞。
许多抗原分子易受酶、加热、幅射 及化学试剂的影响，导致立体结构发生 变化，使抗原的免疫原性也发生变化。 一般讲，蛋白质因上述原因变性后，免 疫原性会大大降低。
(4) 物理状态
球形蛋白比线性蛋白免疫原性强； 凝聚颗粒状抗原比溶解抗原的免疫原性 强。
7.2.4 半抗原和载体效应
小分子物质如化学药物、激素、农药、化 学试剂、有机试剂、环境有机污染物等(可称 为半抗原) ，由于分子量<3500，它们没有免 疫原性。它们进入动物体内，不能诱导动物 体产生抗体物质。但它们却可以和某些抗体 产生反应。
7.4.2 抗血清的效价
抗血清的效价，又称〝滴度〞，是标志抗体 性能的主要参数之一。 抗血清的效价的定义：对给定的测试反应， 能观察到抗原与抗体反应时，抗血清的最大稀 释程度。 显然，效价越高，抗血清的质量越高，免疫 分析的灵敏度越高。可用琼脂凝胶双扩散法和 酶联免疫吸附法测定抗血请的效价。但各种方 法间的测定值没有可比性，在表达抗血清效价 时，需注明检测方法。和测化学耗氧量一样，应 注明采用的是高锰酸钾法还是重铬酸钾法。
7.2 抗原 7.2.1 抗原定义与概述 能够刺激动物机体的免疫系统产生 响应并产生体液免疫物并与之反应的外 源物质称为〝抗原〞。 用〝免疫原性〞和〝免疫反应性〞 来描述由抗原引起的免疫反应的特性。 〝免疫原性〞：抗原引起动物体免 疫系统响应而产生抗体的能力。 免疫原性越强的抗原诱导动物免疫 系统产生的抗体越多。
沉淀反应可分为絮状沉淀、环状沉 淀、单向扩散沉淀和双向扩散沉淀。以 双向扩散为最常用。双向扩散又称为〝 琼脂扩散〞，是利用琼脂凝胶作为介质 的一种沉淀反应。由于琼脂凝胶透明度 高，可直接观察到抗原－抗体复合物的 沉淀线。可根据沉淀线定性抗原，也是 测定抗体效价的一种方法。此法的灵敏 度很低。
7.5.2 标记免疫分析
在载体效应的应用中，最常用的是
偶联的方法。偶联的方法有很多种。一 般都是利用小分子有机物(半抗原)上的活 性部位(各种官能团)与蛋白质分上的氨基、 羧基、酚基、巯基、羟基进行化学反应, 而反应途径往往是重氮化法、碳二亚胺 法、混合酸酐法、戊二醛法等。
7.3 抗体
抗体在抗原刺激动物体后，由淋巴细胞 等合成的一类能与该抗原发生特异性结合的 球蛋白。这种球蛋白称为〝免疫球蛋白〞。 已发现的人类〝免疫球蛋白〞有5类：分别记 作IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。抗体主要分布 在动物体内的血清中。如前所述，含有某种 特异抗体的血清，称之为〝抗血清〞。由于 抗原与抗体反应的高度选择性，所以可无需 纯化抗血清而可以直接检测。