重组质粒的构建

重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。

重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。

在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。

但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。

在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。

所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。

一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。

首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。

然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。

这是常识，不赘述。

2、保护碱基数目的问题。

在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。

但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。

这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。

NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。

重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。

以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。

目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。

根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。

2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。

根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。

常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。

3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。

通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。

4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。

连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。

连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。

5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。

常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。

转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。

转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。

6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。

通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。

常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。

7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。

序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。

重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。

质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。

尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。

这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。

蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。

常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。

福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。

1）促表达/促溶标签2）信标标签3）纯化标签我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。

4）酶切位点以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。

特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。

一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。

标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。

在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。

重组质粒的构建实验流程—质粒构建基因提取—1、2、3基因提取—1、2、3PCR反应扩增目的基因—4、3PCR反应扩增目的基因—4、3DNA片段回收—5、3DNA片段回收—5、3重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5测序测序重组质粒提取—2、 3重组质粒提取—2、 3菌种保藏—7菌种保藏—7目的片段与载体连接及转化—6目的片段与载体连接及转化—6实验操作1、 LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。

其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。

【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract） 0.5gNaCl 1g琼脂（Agar） 1.5g单蒸水 100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。

2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。

3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。

灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。

5、 LB固体培养基倒板配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。

抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

重组质粒的构建（beta版）一、引物设计:1.选择合适的载体。

酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒;注意ATG和stop codon）。

2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。

1，使用word2，设计引物：primer-upPrimer-down3，另设计一对引物扩增CDS区，引物位于CDS区之外，扩增产物包含完整的CDS区。

引物长度约20个碱基。

4，核对----送公司合成。

5，对公司合成的引物快速离心，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（dd2H2O），配成100umol/ul(100uM),-20℃保存。

使用时按1：3比例稀释成25uM工作浓度。

二、PCR（P出目的片段）：（一）、PCR P出目的片段：2,pcr: cDNA 1ul10x PFU buffer 2.5ul ℃ 5mindNTP 1ul ℃ 30secF’-Primer 1ul ℃ 30secR’-Primer 1ul ℃ X minPFU 0.5ul ℃ 5mindd2H2O 18ul（X是根据片段的长度设定，1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值5℃）3，跑胶、回收:（1），配胶：0.6g 琼脂糖60ml 1X TAE0.6ul (待温度降到50-60℃左右时)25分钟后，即可点样跑胶。

（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。

（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，胶回收（胶回收试剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，放在37℃温箱中2min。

对胶回收的产物跑胶验证。

可建立10ul的体系：回收产物5ul、6xloading buffer 2ul、dd2H2O 5ul。

三、酶切、链接：1，目的片段酶切：（酶切时间根据酶的活性,70℃15-20min灭活）insert (胶回收产物) 10ul10 x buffer 2ul20ul的体系dd2H2O 6ulEcoRI 1ulHindⅢ1ul2，载体酶切：（1~2小时）Vector （1ug/ul）：5 ul（总量5ug）10 x buffer 2ul20ul的体系dd2H2O 11ulEcoRI 1ulHindⅢ1ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。

构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。

构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。

一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。

质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。

质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。

二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。

引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。

引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。

引物可以使用商业引物合成公司合成。

三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。

PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。

根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。

四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。

连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。

限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。

连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。

五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。

质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。

重组质粒构建流程导言在分子生物学研究中，质粒是一种重要的工具，可用于携带外源DNA，转导到靶细胞内进行表达或操纵基因。

在许多应用中，需要从头开始构建特定的质粒来满足实验需求。

本文将介绍重组质粒的构建流程，包括质粒设计、DNA片段的合成、连接和转化等步骤。

质粒设计重组质粒的构建首先需要进行质粒设计。

在设计过程中，需要考虑以下几个方面：质粒拓扑结构、宿主细胞、选择标记、启动子、终止子等。

其中，质粒拓扑结构是质粒构建的基础，可以选择环状质粒或线性质粒；宿主细胞是质粒的宿主细胞，需要考虑宿主细胞的特性和适用范围；选择标记是用于筛选携带外源DNA的宿主细胞，可以选择抗生素抗性标记、荧光蛋白标记等；启动子和终止子则是用于调控外源DNA的表达水平。

DNA片段的合成在质粒构建中，需要合成一系列DNA片段，包括载体骨架、选择标记、启动子、基因、终止子等。

DNA片段的合成可以通过多种方法进行，包括化学合成、PCR扩增、酶切和连接等。

在合成过程中，需要确保DNA片段的正确性和纯度，以保证后续的连接和转化效率。

连接连接是质粒构建的关键步骤，通过连接不同的DNA片段来构建目标质粒。

连接的方法包括酶切和连接、PCR扩增和连接、重组DNA技术等。

在连接过程中，需要确保连接效率和准确性，避免产生错误连接或杂交产物。

此外，对于大片段DNA的连接，还需要考虑连接的稳定性和转化效率。

质粒的放大和提取连接完成后，需要将质粒放大到足够的数量，并提取纯净的质粒DNA。

放大的方法可以选择细菌发酵、真菌发酵等，根据质粒的特性选择合适的宿主细胞进行放大。

质粒提取的方法包括碱裂解法、隐式裂解法等，确保提取的质粒DNA的纯度和完整性。

质粒的转化最后一步是将构建好的质粒转化到目标宿主细胞中，进行表达或操纵基因。

转化的方法可以选择化学转化、电转化、热激转化等，根据宿主细胞的特性和实验需求选择合适的转化方法。

在转化过程中，需要考虑转化效率、亲和性和表达水平等因素，确保转化的质粒可以稳定存在和表达。

重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。

重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。

质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。

尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。

这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。

蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。

常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。

福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。

我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。

以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。

特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。

⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。

标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。

在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。

初一生物重组质粒的构建过程在初一的生物学课程中，学生们将学习到生物重组质粒的构建过程。

生物重组质粒是一种重要的实验技术，被广泛应用于基因工程领域。

下面我们将详细介绍重组质粒的构建过程及其应用。

一、重组质粒的定义和价值重组质粒是由自然或人工合成的DNA片段通过体外重组技术构建而成的环状DNA分子。

它通常由两部分组成：载体DNA和插入DNA。

其中，载体DNA是一个可自主复制的DNA分子，插入DNA则是我们所关注的具有特定基因片段的DNA。

通过重组质粒的构建，我们可以将特定的基因片段导入到载体DNA中，使其能够在细胞中稳定复制。

这为我们的研究提供了一个有效的工具，可以用于分析和研究目标基因的功能以及其在生物体内的表达等方面。

二、重组质粒构建的基本步骤1. 选择适当的载体DNA在构建重组质粒之前，我们首先需要选择适当的载体DNA。

常用的载体包括质粒、噬菌体和人工合成的DNA片段等。

选择载体时需要考虑到其大小、复制能力、稳定性以及对细胞的适应性等因素。

2. 获得目标基因的DNA片段接下来，我们需要获得目标基因的DNA片段。

这可以通过PCR扩增、限制酶切或人工合成等方法来获取。

获得DNA片段后，我们需要进行酶切反应，将其制备成具有粘性末端的DNA片段。

3. 连接载体与目标基因片段连接过程中，我们使用DNA连接酶来将载体DNA和目标基因片段进行连接。

DNA连接酶具有连接末端的能力，可以将两条DNA片段通过磷酸二酯键连接起来形成一个完整的环状DNA分子。

连接完成后，我们需要进行酶切鉴定以确认连接的有效性。

4. 转化重组质粒最后一步是将重组质粒导入到宿主细胞中。

这一过程被称为质粒转化。

转化可以通过热冲击、电穿孔或利用嗜热菌的特殊性质等方法来实现。

转化完成后，我们还需要将细胞进行培养和筛选，以获得含有重组质粒的目标细胞。

三、重组质粒的应用重组质粒的构建为我们的研究提供了一个强有力的工具。

它在基因工程领域的应用非常广泛，并取得了许多重要的成果。