实验二_暗视野显微镜

暗视野显微镜实验原理暗视野显微镜是一种常用于生物学和医学领域的显微镜，其原理是利用特殊的光学技术，使样品在显微镜下呈现出明暗对比度，从而增强细胞和组织的观察效果。

下面将详细介绍暗视野显微镜实验的原理和操作步骤。

一、原理1. 暗视野显微镜的光路设计与普通显微镜有所不同。

在普通显微镜中，光线通过样品后被物镜聚焦到目镜，而在暗视野显微镜中，光线经过样品后，穿过一个特殊的光阑，使得未被样品散射的直射光被完全屏蔽，只有散射光通过光阑进入目镜。

2. 光阑是暗视野显微镜中的关键部分，它由一个圆形光阑和一个同心圆环组成。

圆形光阑用于屏蔽直射光，而同心圆环则用于引导散射光进入目镜。

通过调节光阑的大小和位置，可以调整样品的明暗对比度。

3. 在样品中，光线会被细胞和组织中的不同结构和成分所散射。

这些散射光通过光阑进入目镜后，会与直射光相干叠加，形成明暗对比度。

由于散射光的相位和振幅与直射光不同，因此在目镜中观察到的样品会呈现出明暗不一的图像。

二、操作步骤1. 准备样品：将待观察的生物样品制备成薄片或薄片切片。

在制备过程中，需要注意避免样品过厚或过薄，以免影响观察效果。

2. 装载样品：将样品放置在载玻片上，并加入适量的显微镜目标液，以保持样品湿润，并提高观察的清晰度。

3. 调整光源：打开显微镜的光源，根据需要调节亮度。

对于暗视野显微镜，需要将光源调暗，以减少直射光的干扰。

4. 调整光阑：通过旋转光阑的大小和位置，调整样品的明暗对比度。

一般来说，光阑的直径应略大于样品的直径，以确保散射光能够完全进入目镜。

5. 调焦观察：通过调节显微镜的焦距，使样品处于清晰的焦平面上。

可以通过调节物镜和目镜的焦距来实现。

6. 观察记录：通过目镜观察样品，并记录所见到的结构和细胞。

可以使用目镜上的刻度盘来测量样品的大小。

三、应用领域暗视野显微镜广泛应用于生物学和医学领域，特别是在细胞学、组织学和病理学研究中起着重要作用。

通过暗视野显微镜，研究人员可以观察到细胞内部的结构、细胞器的分布以及细胞和组织的形态和结构变化。

细胞生物学实验指导编者梁亦龙张继承生物信息学院2004年9月前言细胞是一切生物(包括人类)最基本的结构和功能单位。

生命科学中的各个学科领域，甚至非生命科学的许多学科领域中的学者们，越来越多地投入到对细胞生命现象的研究。

细胞是生命的载体，不理解细胞就不理解生命。

在现代生命科学教学中，不设置细胞生物学课，所培养出来的学生就称不上是完全的生命科学家。

在细胞生物学放学中，实验课不可或缺。

实验课的基本任务是，让学生学习细胞生物学基本技术，使他们具有一定的实验操作技能，并培养他们树立独立设计实验的思考观念和进行科研的基本素质。

我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本《细胞生物学实验指导》•，供我院开设的各专业选用。

由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。

编者梁亦龙2004年9月目录实验是规则与操作要求 (1)实验一细胞形态及大小的观测 (2)实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察 (5)实验三荧光显微镜原理及应用 (9)实验四电镜参观 (12)实验五植物细胞骨架的显示及光镜观察 (14)实验六人淋巴细胞染色体标本制作 (15)实验七人淋巴细胞姐妹染色体区分染色 (17)实验八碱性磷酸酶的显示 (19)实验九叶绿体的制备及其对染料的还原 (22)实验十人体细胞核型图的制作 (24)实验十一线粒体的分离及活性测定 (27)实验十二联会复合体的染色与观察 (32)实验十三细胞融合 (33)实验十四死、活细胞鉴别 (39)实验十五细胞固定染色法 (41)实验十六早熟染色体凝集（PCC） (43)实验十七细胞同步化 (46)实验十八动物染色体分带技术 (48)实验十九线粒体的显示 (50)实验二十植物愈伤组织培养以及再分化 (52)实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤 (57)实验二十二细胞器的分离 (62)实验二十三石蜡切片的制作 (66)实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。

暗视野显微镜实验原理引言：暗视野显微镜是一种常用的显微镜技术，它能够观察无法被普通显微镜观察到的样品。

本文将详细介绍暗视野显微镜的实验原理和工作原理，并探讨其在科学研究和生物医学领域的应用。

一、暗视野显微镜的实验原理暗视野显微镜利用了相位差干涉原理，通过对样品和背景之间的相位差进行测量，实现对样品的观察。

相位差是光束通过不同介质或不同部分时产生的光程差的一种度量。

在普通显微镜中，样品的透明度差异会导致光束的相位差，从而形成对比度低的图像。

而暗视野显微镜通过引入一个相位补偿器，使得样品和背景之间的相位差变化为强度差，从而增强了对比度，使得样品的细节更加清晰可见。

二、暗视野显微镜的工作原理暗视野显微镜由三个主要部分组成：光源、补偿器和检测器。

光源发出一束平行光，并通过凸透镜使光束汇聚到样品上。

样品会对光束进行散射和吸收，产生相位差。

接下来，光束通过一个补偿器，该补偿器会引入一个反位的相位差，以抵消样品中的相位差。

经过补偿器后，光束进入检测器，检测器会将相位差转化为强度差。

最后，通过图像处理和显示装置，观察者可以看到一幅明亮且对比度较高的图像。

三、暗视野显微镜的应用1. 细胞观察：暗视野显微镜在生物医学领域中被广泛应用于细胞观察。

由于暗视野显微镜可以增强对比度，使得细胞的形态和结构更加清晰可见。

这对于细胞学研究和疾病诊断具有重要意义。

2. 纳米颗粒研究：暗视野显微镜还可以用于纳米颗粒的观察和研究。

由于纳米颗粒非常小，普通显微镜很难观察到其细节。

而暗视野显微镜可以通过增强对比度，使得纳米颗粒的形态和分布更加清晰可见。

3. 材料科学研究：暗视野显微镜在材料科学研究中也具有广泛的应用。

通过观察材料的表面形貌和内部结构，可以研究材料的性质和性能。

暗视野显微镜可以帮助科学家更好地理解材料的微观结构，从而指导材料的设计和制备。

结论：暗视野显微镜利用相位差干涉原理，通过引入相位补偿器来增强对比度，实现对样品的观察。

详解显微镜的八种观察方式:microimage中国显微图像网(2011-08-02 17:25:45)方式一明视野观察(Bright field,BF)明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，广泛应用于病理、检验，用于观察被染色的切片，所有显微镜均能完成此功能。

方式二暗视野观察(Dark field)暗视野实际是暗场照明。

它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。

因此，视场为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的像。

暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。

若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。

暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。

它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体，而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图像。

暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，最高达0.02-0.004μm。

8方式三相差镜检法(Phase contrast,PH)在光学显微镜的发展过程中，相差镜检法的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。

我们知道，人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度)。

对于无色透明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。

相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效的利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。

这大大便利了活体细胞的观察，因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜。

相差图片相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。

光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ(波长)，如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。

BF降低聚光镜DF镜像DF效果：只观察到标本的表形，运动状态→原虫、细菌鞭毛、伪足、管型、结晶等。

理论分辨率：优于0.004micron光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法3光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法9相长干涉：0相位，振幅M+M ＝2M相消干涉：相位相反，光程差1/2λ；合成波极振幅小。

光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法10光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法11光的干涉环状光阑–造成光程不同，偏斜/衍射。

产生直射光及衍射光。

相(位)板：共轭面(半透明环)→通过直射光，补偿面(中间) →通过衍射光。

光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法13明反差－负相差+相板，共轭面涂相位膜推迟直射光1/4波长，使其与衍射光接近同一相位，同时加大对直射光的吸收，物像明亮，背景暗光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法16光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法17暗反差－正相差（－相板）共轭面仅涂吸收膜－振幅小，补偿面涂相位膜推迟衍射光1/4，使两者差1/2相位，合成波振幅形成相消干涉，背景亮，物体暗光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法23光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法24偏振现象□自然光经反射、折射、双折射后及吸收后，可成为只在一个方向振动的光波，为偏光现象或称“偏振光”。

光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法正常光，1.658＞树胶折射率异常光，1.53~1.54光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法27光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法如不是双折射体物质表现为各向同性，无论怎样旋转标本也不会出现物像，因起偏镜发出的直线偏振光的振动方向不发生改变，仍与检偏镜振动方向相垂直。

成像检偏镜双折射体起偏镜自然光光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法29光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法31作轴向偏斜调节，产生平行劈裂＜被检目标CON前焦面Obj后焦面棱镜I棱镜II相差观察法33横向偏移90°光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法34光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法36光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法37光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法38DIC像差与相差的光路光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法40４种光镜法镜像：BF,DF,PH,DIC光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法41光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法相差、DIC相差、HOFFMAN相差镜像之比较光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法43斜射光照明光学显微镜及镜像记录第2节暗场相差观察法。

暗视野显微镜检查法的原理
暗视野显微镜是一种显微镜检查方法，可以观察无色或透明细胞和组织。

其原理基于相位差显微镜的原理。

在普通的透视显微镜中，光线通过物镜镜头和载物中的细胞或组织，然后进入目镜观察。

由于无色细胞或组织对光的吸收和散射较弱，使得它们在背景光线中很难被观察到。

暗视野显微镜采用了相位差显微镜的技术，通过在光路中插入一个透明光柱形容器，在光的传播路径中引入了一个光程差。

当光通过细胞或组织时，细胞或组织的不同部分会对光的相位和振幅产生不同程度的影响，从而产生相位差。

在目镜观察时，通过调整相位差环的位置和大小，使得细胞或组织的不同部分之间的相位差被抵消，仅留下由于样品的不均匀性产生的相位差。

这使得无色细胞或组织与背景光线产生对比，从而使它们更容易被观察到。

暗视野显微镜可以提供高对比度的图像，使得观察者可以更清晰地看到无色或透明细胞和组织的细节。

这种显微镜适用于多种生物学和医学应用，如观察活体细胞、细胞培养、组织切片等。

暗视野光学显微镜第一篇：暗视野光学显微镜暗视野光学显微镜一、操作步骤（1）．将显微镜上的视野调节旋钮旋至暗视野处（2）．将光源亮度调至最大，使在低倍镜下所见的光环亮度最大。

（3）先在低倍镜下找聚光镜的光亮点或环形圈，并扭动暗视野聚光镜的调节杆，使亮点或环形圈移至视野正中。

（4）．在聚光镜镜面上滴加香柏油一滴,然后稍下降。

将标本置载物台上,旋上聚光器使油与载玻片接触(不能有气泡产生)。

（5）．先用低倍物镜及7×目镜进行配光对准物体。

调节聚光器的高度,首先在载玻片上出现一个中间有一黑点的光圈,最后为一光亮的光点,光点愈小愈好,由此点将聚光器上下移动时均使光点增大。

（6）．换上所需目镜和高倍镜,缓慢上升物镜进行调焦,至视野中心出现发光的样品。

（7）．在盖玻片上滴一滴香柏油,将油镜镜头浸在油中后调节物镜焦距处，再缓缓上下移动聚光镜高低，使物体发出最大亮度为止。

二、注意事项（1）．进行暗视野观察时,聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满,否则照明光线于聚光镜上面进行全面反射,达不到被检物体,从而不能得到暗视野照明。

（2）．在进行暗视野观察标本前,一定要进行聚光镜的中心调节和调焦,使焦点与被检物体一致。

（3）．由于暗视野聚光镜的数值孔径都较大(NA=1．2—1．4),焦点较浅,因此,过厚被检物体无法调在聚光镜焦点处,一般载玻片厚度为1．0mm左右,盖玻片厚度宜在0．16mm以下,同时载玻片、盖玻片应很清洁,无油脂及划痕,否则都会严重地扰乱最终的像。

三、基本原理生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的,不易看清。

暗视野显微镜的原理与来自缝隙的一束强光通过暗室时,可清楚地看到其中细微灰尘的现象是一样的,即给样品照明的光不直接穿过物镜,而是由样品上反射或折射的光进入物镜,那么,在漆黑的视野中,由于反差增大了,使样品能够看得更清楚。

因用暗视野法可以在黑暗的视野中看到光亮的菌体,故在观察生活细菌及细菌运动时常采用此法。