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大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建.

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刀豆蛋白A诱导Wistar大鼠肝纤维化模型的建立

刀豆蛋白A诱导Wistar大鼠肝纤维化模型的建立
［ Ａｂ ｓ ｔ ｒＴ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｉ ｃ ｆ ｉ ｂ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ ａ ｎ ｉ ｍ ａ ｌ ｍ ｏ ｄ ｅ ｌ ｉ ｎ Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ ｒ ａ ｔ ．Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ：Ｆ ｉ ｔ ｆ ｙ Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ ｒ ａ ｔ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｒ ａ ｎ ｄ ｏ ｍｌ ｙ ｄ ｉ —
ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ２ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ ｓ ．Ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｅ ｉ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ （ Ｅ） ， ｔ ｅ ｎ ｒ ａ ｔ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｊ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ Ｃ ｏ ｎ Ａ ａ ｔ ａ ｄ ｏ ｓ ｅ ｏ ｆ １ ２ ． ５ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ ｏ ｎ ｃ ｅ ａ ｗ ｅ ｅ ｋ ｆ ｏ ｒ ４ ｗ ｅ ｅ ｋ ｓ ａ ｎ ｄ
目前已建立了多种肝纤维化模型如反复注射四氯化碳及二甲基亚硝胺结扎胆总管腹腔注射异种血清蛋白810但这些方法主要是通过直接或间接对肝细等胞的毒性作用而产生的肝纤维化或硬化模型11而非激起体内的免疫反应如淋巴细胞浸润细胞因子分泌等因此与人类由慢性病毒或自身免疫引起的肝纤维化存在一定的差距不适合用于人类肝纤维化疾病的研究
Ｇ Ｅ ＮＧ Ｘ ｉ ａ ｏ ．Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｉ ｍ ｍｕ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｆ ｏ Ｑ ｉ ｎ ｇ ｄ ａ ｏ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｑ ｉ ｎ ｇ ｄ ａ ｏ ２ ６ ６ ０ ７ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
Ｃｏ ｎ ｃ ａ ｎ ａ ｖ ａ ｌ ｉ ｎ Ａ ｉ ｎ ｄｕ ｃ ｅ ｄ Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ ｒ ａ ｔ ｍｏ ｄｅ ｌ ｆ ｏ ｒ ｈ ｅ ｐａ ｔ ｉ ｃ ｉｂ ｆ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ

机械力在肝脏类器官形成中的调控作用

机械力在肝脏类器官形成中的调控作用

机械力在肝脏类器官形成中的调控作用王宁，吕文良中国中医科学院广安门医院感染疾病科，北京 100053通信作者：吕文良，*******************（ORCID： 0000-0002-4552-919X）摘要：近年来，材料科学和技术的不断进步，使得模拟体内器官结构和功能特征的肝脏类器官技术得以建立并发展，除了对传统生物因素的研究，构建具有不同机械线索的微环境来研究力学刺激对肝脏类器官生长的影响也成为研究重点。

本文论述肝脏类器官的发展，并对不同性质机械力在肝脏类器官形成过程中的作用进行综述，为体外构建更加复杂有序的肝脏类器官奠定基础，也为理解肝脏类器官形成过程中生物因素和机械因素之间的相互作用提供理想的研究模型。

关键词：类器官；肝；生物因子；细胞微环境基金项目：国家自然科学基金（81774282）；国家重点研发计划（2018YFC1705700）；中国中医科学院科技创新工程（C12021A00801， C12021A00802）Regulatory role of mechanical forces in the formation of liver organoidsWANG Ning， LYU Wenliang.（Department of Infectious Diseases， Guang’anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）Corresponding author： LYU Wenliang，*******************（ORCID： 0000-0002-4552-919X）Abstract：In recent years， the continuous advances in material sciences and techniques have helped with the establishment and development of liver organoids that can simulate the structure and function of organs in vivo. In addition to the research on traditional biological factors， the construction of microenvironments with different mechanical cues to investigate the influence of mechanical stimulation on the growth of liver organoids has also become a research focus. This article first discusses the development of liver organoids and then reviews the influence of mechanical forces of different properties on the formation of liver organoids， so as to lay a foundation for the construction of more complex and ordered liver organoids in vitro and provide ideal research models for understanding the interaction between biological and mechanical factors in the formation of liver organoids. Key words：Organoids； Liver； Biological Factors； Cellular MicroenvironmentResearch funding：National Natural Science Foundation of China （81774282）； National Key Research and Development Program of China （2018YFC1705700）； Science and Technology Innovation Project of the China Academy of Chinese Medical Sciences （C12021A00801， C12021A00802）1　肝脏类器官肝脏是人体内最大的实质器官，主要由肝实质细胞（肝细胞）及非实质细胞［肝星状细胞（HSC）、肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）、胆管细胞、免疫细胞等］构成，在解毒、生物合成、代谢和宿主防御方面发挥着多种作用［1-2］。

肝细胞癌中血管生成拟态的三维细胞培养

肝细胞癌中血管生成拟态的三维细胞培养

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大鼠坐骨神经损伤后显微及超微结构的三维重建

大鼠坐骨神经损伤后显微及超微结构的三维重建

大鼠坐骨神经损伤后显微及超微结构的三维重建①400042　重庆　第三军医大学大坪医院野战外科研究所　陈　菁　李兵仓　黄　宏　陈志强　楚燕飞②　朱　刚② 摘　要　利用大鼠坐骨神经损伤后再生神经组织连续切片重建其显微及超微结构的三维图像。

用硅胶管桥接90只大鼠左侧坐骨神经长6m m缺损,术后7、15、30、60、90天取坐骨神经行光、电镜检查,经显微摄像和扫描仪采集输入微机进行图像配准和分割,采用直接体素绘制模型实现三维重建和显示。

结果显示,利用光镜和电镜图像完成了坐骨神经损伤后变性、再生过程中神经纤维及附属结构的形态变化的三维图像重建。

重建结果能直观、形象地揭示大鼠再生坐骨神经纤维与正常神经纤维结构形态的差异,可作为周围神经损伤研究的一种新手段。

关键词　周围神经;再生;三维重建 中国图书资料分类号　R364.33;R651.33-D(THREE DIMENS IONA L)R EC ONSTR UC TION OF M ICR OS TRUC TU RE AN D ULTR ASTR UC TUR E OF THE SC IA TIC NER VE OF R A T A FTER IN JU RYChen Jing,Li B ingcang,Huang Hong e t al.Institute of Sur ger y,Daping H ospital,Third Militar y Medical University, Chongqing400042,ChinaA bstract　T o reconstruct3-D images of microstructure and ultrastructure of regen erated sciatic nerve of rats with serial cross-sections.The6m m defects of the sciatic nerve of90Wistar rats were bridge-connected with silicone tu be and were sampled at3,7,15,30,60,90days resp ectively after in-jury.The images of optical and electronic microscope were taken by micro-photograp h s ystem and scan ner,then they were input into the computer,b y which the i mage registration and segmentation were completed.The direct volu me rend erin g model was used to realize the3-D reconstruction and display. The res ults showed the morphological chan ges in degenerated and regenerated sciatic nerve fibres and their appen dicular structures could be obs erved with the3-D images.It is su ggested that the reconstructing results could reveal the differences bet ween the regenerated and n ormal sciatic nerve fibres of rats intu itively and visually,so it could be used as a new method in the s tudy of peripheral nerve injury. Key words　peripheral nerves;regeneration;3-D reconstruction 周围神经损伤后形态变化和功能变化有密切联系,研究周围神经损伤后病理形态变化对治疗周围神经损伤有重要的理论和实际意义。

成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察

成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察

成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室许秀芳 李温斌* 陈宝田* 吕燕宁 赵莉敏 陈 燕提要:为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法,应用生物酶(5g/L胰蛋白酶及1g/L胶原酶)灌注法分离成年大鼠心肌细胞,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。

结果:心肌细胞的存活率为91.7%;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比约为4~6 1。

结果提示:该方法是比较理想的心肌细胞培养法。

关键词:成年大鼠心肌细胞;胰蛋白酶;胶原酶;分离技术中图分类号:Q253;R322.1+1自从1953年Durrows和M oscona首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后[1],其分离培养技术不断发展,逐渐发展为3种分离方法:离体心脏灌注法、心肌细胞浸泡法和贴块培养法。

对动物而言,离体心脏生物酶灌注法分离心肌细胞的质量及数量最佳。

成年心肌细胞的分离较幼年及新生动物心肌细胞的分离更为困难,但成年心肌细胞做为一种生物学实验工具是其他心肌细胞不可替代的。

国内仅有少数单位分离培养成功成年动物心肌细胞。

1992年1月至1998年12月,我们建立了成年大鼠心肌细胞分离培养方法并进行了形态学观察。

1 材料和方法1.1 材料实验动物为成年Wistar大鼠,体质量150~200g,由本研究所实验动物室提供。

DMEM培养液、胰蛋白酶均购自美国GIBC公司;胶原酶购自美国Sigma公司;牛血清白蛋白购自美国BM公司;胎牛血清由金华生物制品公司提供;淋巴细胞分离液由中科院血液学研究所出品;安贞号心脏停跳液由本院体外循环组提供。

实验药物及试剂的配制:2%胎牛血清20 mL加DMEM培养液100mL,青霉素100mg/ L,链霉素100万U/L,pH7.2~7.4,过滤除菌。

酶消化液:胶原酶0.1g加胰蛋白酶0.5 g、牛血清白蛋白1g,加入DM EM培养液100 mL,于使用前配制。

肝细胞的三维受控组装

肝细胞的三维受控组装

ISSN 1000-0054CN 11-2223/N 清华大学学报(自然科学版)J T singh ua Un iv (Sci &Tech ),2005年第45卷第8期2005,V o l.45,N o.81/381009-1011,1031肝细胞的三维受控组装刘海霞,　颜永年,　王小红,　熊　卓,　程　捷(清华大学机械工程系,北京100084)收稿日期:2004-08-23基金项目:清华大学基础研究基金项目(Jc2003015)作者简介:刘海霞(1977-),女(汉),内蒙,博士研究生。

通讯联系人:颜永年,教授,E-mail:dmeyyn @mail.tsinghu 摘　要:为解决肝病救治中肝供体缺乏的问题,采用基于快速成形技术的细胞组装机,将肝细胞和海藻酸钠与明胶复合材料的共混物作为成形对象,通过细胞材料直接三维受控组装技术,实现了堆积成形具有一定三维结构和预定义孔隙的肝组织前体。

常规体外培养条件下,肝细胞存活并保持生物学活性达12d 之久。

这一技术有望成为肝脏及其他人体组织器官人工构造的新途径。

关键词:快速成形;细胞组装机;肝细胞;三维受控组装;人工肝中图分类号:T H 164文献标识码:A文章编号:1000-0054(2005)08-1009-03Three -dimensional controlledassembling of hepatocytesLIU Haixia ,YAN Yongnian ,WANG Xiaohong ,XIONG Zh uo ,CHE NG Jie(Department of Mechanical Engineering ,T s inghua University ,Beij ing 100084,China )Abstract :T he manufactu ring of bio-artificial livers for liver tran splants is a new techn ology w ith many un ans w ered questions.A rapid prototyping technique w as developed to form a living cells /extracellular matrix (E CM )thr ou gh d irect three-dimension al controlled ass em bling.A th ree-dimen sional liver tiss ue precursor structure w ith pr edefin ed pores com posed of h epatocytes and gelatin /algin ate h ydrogel was formed using th is technique.In vitr o studies sh owed that the embedded h epatocytes in th e structure remain ed viable and performed biological fu nctions for 12days.T his technique h olds potential for manufacturing bioartificial livers and other livin g h uman tis sues and organs.Key words :rapid prototyping;cell as sembler;hepatocyte;3-Dcontrolled assembly;bioartificial liver急性肝功能衰竭和由肝病引发的多器官衰竭是死亡率很高的疾病[1],目前只有同种肝移植能有效救治。

大鼠原代肝细胞培养方法的建立_倪慧

大鼠原代肝细胞培养方法的建立_倪慧

管轻吹换液，去除杂细胞及未贴壁的细胞，从而保证肝细胞
的纯度及高存活率。在 WME 培养液中 添 加 胰岛 素 、地 塞 米
松及胎牛血清，配成完全培养液，有利于细胞的增殖分化，
使细胞贴壁后拉伸变薄，形态完整，呈岛状连接；试验发现
使用自制的鼠尾胶原处理细胞板，肝细胞的贴壁效果更好。
该研究建立的大鼠肝细胞体外培养模型简便易行，分
离的肝细胞数量多，纯度和活率高；接种后 4 h 内即可呈单
层贴壁生长，并且在一定的体外培养条件下仍能保留许多
图 2 培养 4 h 的大鼠肝细胞形态（150×）
体内的细胞活性和功能，可在实验室广泛应用。 4 参考文献
[1] BERRY M N，FRIEND D S.High -yield preparation of isolated rat liver
目前，原代肝细胞培养已应用于许多毒理学方面的研 究，其中较为重要的就是结合细胞功能和细胞毒性的研究
2007，29（2）：61-63. [7] 姚云清，张定凤，黄爱龙.低浓度胶原酶原 位循环 灌流 法用 于原 代大
鼠 肝 细 胞 分 离[J].现 代 医 药 卫 生 ，2001 ，17 （2） ：842.
[4] SOLDATOW V Y，LECLUYSE E L，GRIFFITH L G，et al.In vitro models
图 3 台盼蓝染色的大鼠肝细胞形态（200×）
for liver toxicity testing[J].Toxicology Research，2013，2（1）：23-39.
escent properties of derivatives of squaraine probes at interaction with the

大鼠肝细胞与胰岛内皮细胞融合细胞系的建立及鉴定

大鼠肝细胞与胰岛内皮细胞融合细胞系的建立及鉴定

大鼠肝细胞与胰岛内皮细胞融合细胞系的建立及鉴定焦奥;李晓航;石悦;吕武;孙宁;张城硕;李峰;张佳林【摘要】目的通过电融合法构建由肝细胞系及原代内皮细胞融合而成的杂交细胞.方法利用EMS诱变构建BRL-3A HGPRT-缺陷型细胞;利用胆总管灌注法及胰酶消化法获得胰岛内皮细胞;利用CRY-3B细胞电融合仪及HAT筛选策略获得融合细胞;利用流式细胞仪对融合细胞的体积、细胞内颗粒密度及DNA含量进行检测;通过实时PCR及Western blotting检测融合细胞特异性基因的表达情况.结果成功构建了一株由大鼠肝细胞系BRL-3A与原代大鼠胰岛内皮细胞融合而成的四倍体BRL-ies细胞.这株细胞既具有内皮细胞表型,表达CD31,又具有肝细胞特性,表达较高水平的谷氨酰胺合成酶.结论肝细胞系BRL-3A可与原代内皮细胞融合形成较稳定的四倍体细胞,同时两者特征表型得以保留.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2018(047)004【总页数】5页(P294-298)【关键词】电融合;肝细胞;内皮细胞【作者】焦奥;李晓航;石悦;吕武;孙宁;张城硕;李峰;张佳林【作者单位】中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科,沈阳110001【正文语种】中文【中图分类】Q813.2肝脏组织工程是在体外构建仿生的肝组织，用于肝脏的替代治疗，但肝脏组织体积庞大、代谢异常活跃，没有血管输送氧气和养料就会迅速衰竭［1］，所以肝脏组织工程血管化是亟待解决的问题。

肝细胞再生抑制肝损伤大鼠模型的构建_陈焱

肝细胞再生抑制肝损伤大鼠模型的构建_陈焱

·论 著·肝细胞再生抑制肝损伤大鼠模型的构建＊陈　焱1,陈耀凯2,王宇明2,夏　杰2(1.解放军324医院,重庆400020;2.第三军医大学西南医院感染科,重庆400038) 摘　要:目的　构建肝损伤合并自身肝细胞再生抑制动物模型。

方法　用2-乙酰氨基芴(A A F)灌喂大鼠后行肝部分切除,分时段检测肝功及肝脏再生情况。

结果　本方法建立的动物模型肝再生抑制明显(P<0.01),肝功能恢复缓慢(P<0.05)。

结论　肝损伤大鼠的肝细胞再生抑制明显,是较好的肝损伤合并自身肝细胞再生抑制动物模型。

关键词:肝损伤;再生抑制;动物模型中图分类号:R365.575;R-332文献标识码:A文章编号:1671-8348(2008)15-1697-02Animal mo del of hepatocytes anti-regeneration and liver injury＊C HE N Y an1,C HE N Y ao-k ai2,WA N G Y u-min2,et a l.(1.324Hosp ital of PL A,Chongqing400020,China;2.De partment of In f ectious Diseases,Southwest Hospital,Third Mi litary Medical University,Chongqing400038,China)A bstract:Objective　T o e stablish the animal mo del of hepa tocytes anti-reg ene ratio n and liv er injure.Methods　Rats wer e done the par tial hepatectomy af te r feeding by A A F.Rats w ere detected the hepatic functio n and rege nera tion of hepatocy tes by schedule. Results　Af te r feeding by A AF,the reg ene ratio n o f hepatocy te s in the live r injury rats was obviously in hibited(P<0.01).T he re-cov ery of hepatic functio n wa s slow(P<0.05).Conclusion　T here is o bvious inhibition o f hepatocy te reg ener atio n in the live r injure rats.I t is a go od animal model o f he pato cy tes anti-rege nera tion and live r injure.Key words:liv er injur e;anti-r eg ene ratio n;animal mo del 肝硬化等慢性肝脏疾病是目前临床治疗的难点,进行相关疾病的研究需建立合适的动物模型,从而为临床治疗奠定实验基础。

大鼠传代培养肝细胞的形态学观察_张蒙

大鼠传代培养肝细胞的形态学观察_张蒙

・研究原著・文章编号:1000-2790(2002)16-1443-03大鼠传代培养肝细胞的形态学观察张　蒙1,陈　璧2　(1西安市中心医院烧伤整形科,陕西西安710003,2第四军医大学西京医院烧伤科,陕西西安710033)关键词:肝/细胞学;连续传代培养;显微镜检查,电子;大鼠中图号:Q24 文献标识码:A摘　要:目的　将大鼠肝细胞进行传代培养,并观察其形态学特点.方法　采用胶原酶二步法灌注1m o龄SD雄性大鼠肝脏,制备肝细胞悬液并进行原代及传代培养,对其形态学进行了观察.结果　肝细胞已传7代,每次传代培养6d左右,光镜下可见大量新生肝细胞生长,呈多边形,相嵌紧密排列.电镜下可见核变形,有的为双核细胞.此外,胞质内的糖原颗粒也逐渐减少.结论　成功进行了肝细胞的传代培养,为肝细胞的研究提供了一种方便的研究方法.Morphological observation of rat subcultured hepa-tocytesZH A N G Meng1,CH EN Bi21Department of Burn&Plastic Surg ery,Xi'an M u-nicipal Central Hospital,Xi'an710003,China, 2Department of Burn Surg er y,Xijing Hospital, Fo urth M ilitary M edical U niversity,Xi'an710033, ChinaKeyword:iiv er/cy tolo gy;ser ial passag e;micr oscopy,elec-tr on;rat sAbstract:AIM　T o subculture rat hepat ocyt es and to o b-ser v e their mor pho log ical character istics.METHODS　Hepa-tocy tes wer e iso lat ed fr om1-mo nth-old rat s by tw o-st ep co l-lag en per fusio n.A fter cultur ed for20d,the pr imar y culture-so f hepa tocyt es w er e separ ated with try psin and then subcul-tured for7gener atio ns who se mor pho lo gical char acteristics w ere studied.RESULTS　Six day s after t he subcult ur e,hep-atocy tes w er e o bser v ed under lig ht micr oscope,and a g reat number of neo for mative poly go n hepato cytes w ere found.收稿日期:2002-02-11;　修回日期:2002-03-31基金项目:国家自然科学基金资助项目(39290700)通讯作者:陈　璧.T el.(029)3375298Email.burn s@ 作者简介:张　蒙(1966-),男(汉族),安徽省界首市人.硕士,讲师,主治医师.T el.(029)7251242T hey w er e closely arr anged.T he nucleus o f subcultured hep-a tocyt es became defo rmed under T EM.Some o f t hem w ere binuclear.Besides,g ly cog en in t he cyto plasm decr eased.C ONCLUSION　Subculture rat hepato cytes pro vide a co nve-nient m ethod for the study of hepa tocyt es.0　引言在研究体外肝脏多种多样的功能中,需要建立一个简单的系统来精确地模仿体内肝脏的活动.1969年Ber ry和Friend用胶原酶灌注分离细胞,使细胞产量大幅度提高,这些细胞具有许多肝脏功能.我们在肝细胞原代培养的基础上,又成功地进行了肝细胞的传代培养,以利于肝细胞的研究.1　材料和方法1.1　材料　上海产1mo龄SD雄性大鼠,体质量90～100g.DM EM培养基(Gibco公司),0.3g・L-1Ⅰ型胶原酶溶液5.0mL(Sigm a公司,DM EM为溶剂),磷酸缓冲液(PBS)250mL,RDB-T B蠕动泵(江苏省张家港市仪表仪器总厂),离心机,型号为Biofug e15R(德国Heraeus公司).1.2　方法　SD雄性大鼠腹部消毒后按2mL・kg-1,ip,10g・L-1戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定.脱去胸腹部毛,消毒,无菌操作下,开胸将导管插入下腔静脉胸段,丝线固定.开腹显露门静脉,远离肝脏处结扎肝动脉、脾静脉、下腔静脉与肾静脉汇合处,剪破门静脉近肝脏处,以9m L・min-1速度灌注PBS 15min,以8mL・m in-1速度灌注Ⅰ型胶原酶溶液10 min,收集细胞于DM EM中,依次经100,150,180, 280,400目不锈钢滤网过滤后的细胞悬液于4℃,50 g离心2m in,弃上清,反复离心3次,沉积的细胞用含100mL・L-1小牛血清DMEM调整细胞密度为2×108・L-1,台盼蓝拒染法测细胞活力0.90,以此细胞密度在6孔培养板中加入细胞4×105/孔.36h 后首次换液,以后每48h换液1次.肝细胞培养20d 时,于位相差倒置显微镜下可见细胞融合成片.传代前用无血清培养基培养1d,弃去培养液,加入1.25mL ・L -1胰蛋白酶(1mL/孔)于37℃作用6min,镜下见胞质回缩,细胞间隙增大.此时吸去胰蛋白酶加入含100mL ・L -1小牛血清DM EM ,吸管轻轻反复吹打培养皿底部,调整细胞密度为2×108・L -1.台盼蓝拒染法测细胞活力为0.98,重新接种于新的培养皿进行传代.在位相差显微镜下观察培养6d 的各代肝细胞形态并拍照.经首次传代培养6d 的肝细胞,吸出培养液,加入1.25m L ・L -1胰蛋白酶于37℃下作用8m in ,吸去胰蛋白酶,加入含100mL ・L -1小牛血清DM EM ,吸管轻轻吹打培养皿底部,细胞悬液收集于锥形离心管中,以2000r ・min -1速度离心10min,沉积物加入戊二醛固定,常规包埋,切片,染色,于透射电镜下观察并摄像.细胞计数与活力检测:细胞培养过程中用台盼兰拒染法检测培养细胞活力,用血球技术板计算细胞数.2　结果肝细胞传代培养6d,可见新生肝细胞大量生长,呈多边形,相嵌紧密排列.细胞培养过程中未见成纤维细胞生长,亦无细菌及真菌污染.培养中抽查细胞活力为0.98,现已传7代(Fig 1).传一代肝细胞在电镜下可见核变形,有的为双核,细胞膜上有大量微绒毛(Fig 2).胞质内有丰富的细胞器,如大量的内质网和线粒体,其中有典型的车轮状线粒体,大量玫瑰花瓣型糖原颗粒,还有溶酶体等细胞器(Fig 3).A:1s t generation;B:2nd generation;C :3rd generation;D:4th gener ation,E:5th generation;F:6th generation ;G:7th generation.图1　培养6d 的传代肝细胞Fig 1　Hepat ocytes after subcultur e fo r 6d ×2003　讨论在研究体外肝脏多种多样的功能中,需要建立一个简单的系统来精确地模仿体内肝脏的活动.细胞培养技术便是最常用的方法[1-4].我们先前已经建立了长期培养的细胞系[5],而肝细胞的传代培养,更有利于肝细胞的研究.肝细胞培养数周后,肝细胞就被一种含有透明细胞质的小细胞替代.这种细胞具有上皮样改变,且可传代.虽然这种细胞与原来的肝细胞形态略有不同,却具有典型肝细胞的多项功能特征.他们具有较高水平的 -谷氨酰转肽酶,可合成Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型胶原,具有胰岛素和EGF 受体,其水平与分离的肝细胞水平相似,可以合成和分泌多种血清蛋白,如白蛋白、转铁蛋白、甲胎蛋白.当它们被化学致癌物转变或移植回同源宿主中,可以产生胆管腺癌或肝细胞癌,这提示肝细胞、胆管上皮细胞和培养的肝上皮细胞是紧密相关的,同时也支持了有关胚胎学中肝细胞是从终胆管演化而来及病理情况下胆管上皮细胞和肝细胞可以相互转变的研究.在大鼠肝细胞培养过程中胰岛素具有重要作用,可增加细胞接种有效率,促进核蛋白磷酸化.新接种的细胞加入10m g ・L -1胰岛素作用3h ,就足以使核蛋白磷酸化增加并持续3d.胰岛素还可以结合到生长因子受体上,具有潜在的特异性生长因子样作用.它还可以增加球蛋白的合成、糖原合成、脂肪生成及DNA 合成,诱导许多酶如乙酰-辅酶A 羧化酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,葡萄糖激酶,ATP 枸橼酸盐裂解酶,酪氨酸转化酶及鸟氨酸脱羧酶.其中鸟氨酸脱羧酶只有在胰岛素与EGF 协同作用下才能诱导合成.皮质类固醇可显著增加大鼠肝细胞生存率,维持其多边形上皮形态,尽管这种激素作用的生化基础还不清楚,很可能与皮质类固醇对蛋白水解酶的抑制作用有关.皮质类固醇可促进胆小管形成,增加可促进细胞贴附的粘接蛋白的合成.最新资料显示ED -A (+)细胞粘接蛋白与肝细胞激活,肝脏纤维化密切相关[6-8].YT IYVIA L 序列存在于粘接蛋白的肝2区,它具有抑制各种细胞与粘接蛋白粘附的作用,此抗粘点深埋与血浆粘附蛋白的肝2区结构内,肝素与基质金属蛋白酶2(M MP-2)的降解产物与粘接蛋白相互作用可使其暴露[9].M M Ps 是肝脏受到炎性损伤时的产物[10].粘接蛋白多肽含有这种抗粘附YTIYVIAL 序列.人工合成的多肽FN Ⅲ14可抑制细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化以调节细胞生长、分化等过程[11].ED-A (+)细胞粘接蛋白作为细胞固定的骨架可诱导肌纤维细胞的转化,尽管其机制尚不完全清楚.由于肝细胞可表达 5 1,而其与细胞粘接蛋白的粘附可被合成的粘接蛋白多肽GRGDSP 阻断,因此肝细胞似乎是通过 5 1与ED-A (+)细胞粘接蛋白粘附的[12].图2　传代肝细胞中的双细胞核,糖原颗粒及溶酶体Fig 2　Binucleus,g ly cog en and lyso so me in t he hepatocy tes after subcultur e for 1st g eneration ×4000图3　传代肝细胞中车轮状线粒体、内质网及溶酶体Fig 3　Wheel -shaped mit ochondia ,endoplasmic reticulum and lyso so me in the hepatocy tes after subculture fo r 1st g en-erat ion T EM ×12000 肝细胞传代过程中胰酶消化非常重要.浓度过大,时间过长,容易损伤肝细胞;浓度太小,时间过短,肝细胞分散不够理想,且细胞量少.若用吸管吹打培养皿底部促使细胞分离,也会损伤细胞.本实验用胰蛋白酶在37℃下作用6min ,既可使肝细胞充分分离,又不损伤肝细胞,传代后肝细胞也容易贴壁生长.传代肝细胞电镜下与原代肝细胞类似,但有不规则细胞核及糖原颗粒减少的现象,可能与肝细胞传代过程中发生了部分变异有关,详细机制尚需进一步研究.参考文献:[1]Li YQ ,Zhao DH ,Pan BR ,Li BG ,Sun W J ,T ian Q ,Jia M .Ef-fect of gentiopicroside on liver injur y of rats [J ].Di -si Junyi Daxu e X uebao (J Fourth M il M ed Univ ),2001;22(18):1645-1649.[2]Liu L,Li BL,Zhou SY,M ei QB,Zhao DH.Effects of tang ufi-can max im p olysacch arid es in acute liver in jury of mice [J ].Di -si J unyi Dax ue X ue bao (J Fourth M il M e d Univ ),1999;20(6):549-551.[3]Yuan WQ,W an g H,L u ZR.Differential regulation of sodiumpump-s ubnit isoform gene b y ou abain and digoxin in rat liver [J ].Di -si J uny i Dax ue X uebao (J F ourth M il M ed Univ ),2001;22(16):1451-1455.[4]Guo XG,M iao JY,W ang ZY.Protective effect of L -NAM E onch ronic liver induced by CCl4in rats [J ].Di -si J uny i DaxueX uebao (J F ourth M il M ed Univ),2001;22(22):2061-2063.[5]Zhang M ,S hu YJ ,Ch en B,T ang CW.M or phological observa-tion of long -term primarily cultured rat hepatocytes [J ].Di -si J unyi Daxue X uebao (J F our th M il M e d Univ ),1995;16(6):418-422.[6]Jarnagin W R,Rockey DC ,Koteliansky VE ,W ang SS ,BissellDM.Expr ess ion of var iant fibronectins in w ound healing:Cellu-lar s ource and 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在肝脏芯片上进行肝细胞三维培养取得重大进展

在肝脏芯片上进行肝细胞三维培养取得重大进展

在肝脏芯片上进行肝细胞三维培养取得重大进展肝脏芯片（liver-on-a-chip）细胞培养装置是药物发现、毒理研究和组织工程研究中的有吸引力的仿生模型。

为了在实验室芯片上维持特定的肝细胞功能，必须具备充足的细胞类型和培养条件，包括三维细胞定位和持续的营养物和氧气供应。

与传统的二维细胞培养技术相比，器官芯片（organ-on-a-chip）装置提供了多功能性和有效的仿生技术，适用于药物发现和医学上的高级应用。

在一项新的发表在Biofabrication期刊上的研究中，Jonas Christoffersson及其同事们证实了模仿胞外基质的水凝胶如何支持灌注肝脏芯片装置中的肝细胞功能和活力。

这些研究人员设计了一种基于透明质酸和聚（乙二醇）（HA-PEG）聚合物的水凝胶系统。

他们利用点击化学开发出这种水凝胶。

为了做到这一点，他们让环辛炔部分和炔烃叠氮化物标记的反应物之间发生双正交反应（在生命系统内发生的化学反应，没有天然生物化学反应的干扰），即应变促进的炔烃叠氮化物环加成（strain-promoted alkyne azide cycloaddition, SPAAC）。

图片来自Biofabrication, doi:10.1088/1758-5090/aaf657通过与现有的琼脂糖和藻酸盐水凝胶相比较，这些研究人员在细胞相容性（cytocompatibility）方面设计并表征了这种新型凝胶材料。

对于生物功能化研究，他们使用了源自人诱导性多能干细胞的肝细胞（hiPSC-HEP）。

为了改善这种生物材料的表面细胞相容性，利用叠氮化物修饰的细胞粘附基序改变HA-PEG水凝胶，从而促进有效的细胞-材料附着。

在这种表面功能化的生物材料中，这些产生肝细胞的人诱导性多能干细胞（hiPSC）在三维空间中迁移和生长，并且具有增加的活力。

与在其他水凝胶上培养的细胞相比，他们观察到在这种新材料上的白蛋白（一种特征性的肝脏蛋白）产量更高。

大鼠再生坐骨神经病理结构计算机三维重建研究

大鼠再生坐骨神经病理结构计算机三维重建研究
Chongqi ng 400038
P u r p os e : To i n ves ti ga t e mo rp hol ogic c ha nge of de ge ne ra ti ng a nd r e ge ne ra ti ng s cia tic ne r ve f oll owi ng injur y , a nd s t udy on medical image vis ualization f or p e rip he ral ne r ve rege ne ration. M a t e r i a ls a n d M e t h o ds :A t ot al of 30 a dul t wis t a r ra t s w e r e di vi de d ra ndomly i nt o 6 g r oup s , The de xt ral s cia tic ne r ves w e r e r es ect e d by 5m m a nd t he n r ep ai r e d wit h silicone t ube , t he de xt ral a nd cont r ol s ciatic ne r ves w e r e s a mpl e d a t 3 , 7 , 15 , 30 , 60 , 90 days r esp ecti vel y af t e r i nj u r y , The i ma ges of s t ai ne dp r ep a ra ti on usi ng modi2 f i e d t ric h r ome s t ai ni ng t ec h ni que t h r oug h op tical mic r os cop e w e r e t a ke n by mic r o - p hot og rap h s ys t e m a nd i np ut t e d t he comp ut e r by w hic h t he i mages ma t c hi ng a nd 2 - D i nt e g ra t e p r oces si ng w as comp l e t e d . The 3 - D r econs t r uction a nd displa y was accomplis he d i n S GI w or ks t a tion . R e s ul t s : St ai ne dp r ep a ra tion wi t h modif i e d t ric h r ome s t ai ni ng t ec h ni que w as cl ea rly de ma rca t e d a nd vi vi d col o r e d , 3 - D r econs t r uc2 ti ve i ma ges ca n displa y mic r o - mo rp hol og y of r e ge ne ra ti ng s cia tic ne r ve . Co n c l u s i o n : Modif i e d t ric h r ome s t ai ni ng t ec h ni que of t he ne r ve combi ne wi t h a dva nce d 3 - D r econs t r ucti on t ec h nique w as one of t he eff ecti ve me t hods t o Pe rip he ral ne r ve mic r o - mo rp hol og y s t udy . Ke y w o r ds Pe rip he ral ne r ve Rege ne ra ti on Th r e e - D r econs t r ucti on Me dical i mage Modif i e d

大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建.

大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建.

大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建【摘要】目的研究同一细胞内不同形态线粒体的数量、大小和超微结构。

方法用三维重建和体视学测量的方法，研究成年大鼠肝细胞线粒体的形态类型。

结果肝细胞线粒体按形态可分为5个基本类型：Ⅰ型(球形、椭球形和盘状)线粒体约占线粒体总数的21.4%；Ⅱ型(杆状)约占32.4%；Ⅲ型(不规则形)约占23.8%，Ⅳ型(分支形)约占19.6%，Ⅴ型(出芽形)仅占2.8%。

Ⅰ～Ⅴ型线粒体的平均体积分别为0.11、0.21、0.32、0.51和0.64μm3。

体现学分析显示，各型线粒体的体积密度有差异(P＜0.05或P＜0.01)，Ⅱ型线粒体体积密度最大，然后是Ⅲ、Ⅳ和Ⅰ型，Ⅴ型线粒体体积密度最小。

Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ型线粒体嵴膜密度均高于Ⅲ或Ⅳ型(P＜0.05)。

结论肝细胞内不同形态的线粒体都占有一定的比例，他们不仅体积差异很大，其超微结构亦有不同。

【关键词】肝细胞线粒体三维重建体积密度膜密度THREE-DIMENSIONAL RECONSTRUCTION OFMITOCHONDRIA IN RAT HEPATOCYTEMu ChangzhengΔ, Xi Huanjiu*, Bao Cuifen, Liu Xia,Erik IISΦChristensen* *, Cui Shiying(Department of Histology and Embryology,* Department of Anatomy,Jinzhou Medical College,Jinzhou;* *Department of CellBiology, Institute of Anatomy,Aarhus University, Denmark)【Abstract】Objective To examine the number,size and ultrastructure of the different forms of mitochondria in acell.Methods Morphological types of the mitochondria in rat hepatocyte were studied by three－dimensional reconstruction and stereological analyses.Results The mitochondria may be classifiedinto five basic types according to their morphological characteristic.The numbers(%)of type Ⅰ(sphere, ellipses anddisc),type Ⅱ(rods),typeⅢ(irregulars),typeⅣ(branches)andtypeⅤ(budding)were 21.4%,32.4%,23.8%,19.6% and 2.8%,respectively.And their average volume were 0.11μm3,0.21μm3,0.32μm3,0.51μm3 and0.64μm3, respectively. Stereological analyses showed that there were significant difference in volume,density and crista membrane density among five types of mitochondria(P＜0.05 or P＜0.01).The volume density of mitochondria type Ⅱ was the highest,that of type Ⅴ thelowest and that of type Ⅲ,type Ⅳ and type Ⅰ themedium.Mitochondrial cristamembrane density of type Ⅰ,type Ⅱ and type Ⅴ was higher than both that of type Ⅲ and type Ⅳ.Conclusion Each type of mitochondria kept a suitable proportion in normal rat liver cell.There were significant difference not only in volume among different forms of mitochondria,but also in ultrastructure.【Key words】Hepatocyte; Mitochondria; Three-dimensional reconstruction; Volume density; Membrane density线粒体在生长过程中以及在不同的生理或病理状态下，其形态会发生很大改变［1～3］。

大鼠肝大部切除后肝再生过程中肝小叶结构的重建

大鼠肝大部切除后肝再生过程中肝小叶结构的重建

Ｓ Ｆ级 动 物 房 中 ， 度 ２ ￣ ２ ℃ ， 对 湿 度 ４ ～ Ｐ 温 ０Ｃ～ ５ 相 Ｏ
研 究拟 采用 正 常 大 鼠部 分 肝 切 除 后 肝 再 生 模 型 ， 观察 正 常大 鼠部 分肝切 除后 肝再 生 过 程 中肝 小 叶 大小 的动 态 变化 ， 以探 明大 鼠肝 再 生 过 程 中肝 小 叶 结 构 的 重 建
用 较 广泛 的 、 典 的 肝 再 生 的 动 物 模 型 ， 分 肝 切 除 经 部 后 残 存 的细 胞 可 迅速 从 静 息期 进 入 细 胞 周 期 ， 实 质 肝
１ 材 料和方 法
１ １ 实验 动 物 及 分 组 ．
细 胞 和非 实 质 细胞 依 次 呈 现 代 偿 性 增 生 ， ７ １ 在 ～ ０ｄ
Ａ ｓ ａ ｔ Ｏ ｊ ｃｉｅ Ｔｏｏ ｓ ｒｅ ｔ ｅｓ ｅｏ ｈ ｅ ａ ｉ ｌｂ ｌ ｄ ｒ ｇ ｌ ｅ ｅ ｅ ｅａ ｉ ｆ ｒ ｐ ｒｉ ｅ ａｅ ｔｍｙ（ Ｈ）ｉ ｂｔ ｃ ｒ ｂ ｅｔ ： ｂ ｅ ｖ ｈ ｉ ｆｔ ｅｈ ｐ ｔ ｕｅ ｕ ｉ ｖ ｒｒｇ ｎ ｒ ｔ ｎ ａｔ ａ ｔ ｌ ｐ ｔ ｏ ｖ ｚ ｃｏ ｎ ｉ ｏ ｅ ａｈ ｃ Ｐ ｎ
过程。
＊河 北 省卫 生厅 科 研 基 金 （０ １ １２ ２ １０ １ ） 第 １作 者 Ｅ ｍａ ：ｚｇ ｘ ＠ １ ６ ｃｍ — ｉ ｙ ｙ ａ ２ ．ｏ ｌ
７ 。用杆 状饲 料 喂 养 ， 离 子 水 装 入 水 瓶 供 动 物 自 Ｏ 去
由饮用 。适 应 ７ｄ后 随机 分 为 ３组 ： 常 对 照 组 、 分 正 部
加 。正常对照组和假手术组大 鼠未见上述动态变化 。结论 ： 常大 鼠部 分肝切 除后 ， 正 肝再 生通 过早期肝 小叶面 积增大 ， 后

肝细胞体外三维培养技术进展

肝细胞体外三维培养技术进展

肝细胞体外三维培养技术进展改进肝细胞培养技术，实现大规模体外培养活力旺盛、功能稳定的肝细胞在生物型人工肝支持系统、肝细胞移植等方面具有广泛的用途。

近年来，国内外在肝细胞三维组织化培养的研究方面取得了较大的进展，使体外肝细胞培养密度大大增加，肝细胞功能维持时间大大延长。

本文就相关文献，对肝细胞体外组织化培养技术的研究进展进行综述。

1胞外生物支架材料的应用研究者对各种胞外支架材料进行了研究，包括聚乙烯树脂、海藻酸盐、聚氨酯泡沫等，都是具有亲水多孔性结构的天然或人工合成的有机大分子。

在一定的培养条件下，肝细胞在基质孔隙中重组形成许多有功能的聚集体，这些聚集体中可能具有接近的细胞-细胞接触，且形成类似于体内组织的结构，因而表现出比早先单层贴壁培养的肝细胞更好的生理功能。

1.1海藻酸盐(alginate)海藻酸盐是目前常用的促进肝细胞聚集的物质，藻酸盐海绵体具有高度多孔的结构，孔径在100～150 μm，由于藻酸盐是亲水性物质，所以肝细胞能容易地进入基质内部。

Glicklis［1］等以藻酸盐海绵体为支持基质培养肝细胞。

DNA测定表明最初两周肝细胞的数量并不增加，MTT测定显示绝大多数细胞保持活力。

接种24 h内在藻酸盐海绵状结构内观察到活细胞聚集体，这种聚集体在培养的第四天平均直径100 μm，与基质孔径同一数量级。

聚集体的三维结构促进了细胞功能的表达：1周内达最大白蛋白分泌量。

微囊化肝细胞培养利用半透膜将肝细胞包在囊内(囊壁分子量截率＜100KD)，海藻酸钠聚赖氨酸海藻酸钠(AlginatepolylysineAlginate，APA) 微囊和游离肝细胞及宿主间有良好的生物相容性。

Capuani等［2］以磁共振成像(MRI)扩散检测法观察了肝组织内肝细胞、分离肝细胞及海藻酸盐微囊化肝细胞，发现与肝内细胞相比，分离肝细胞在细胞容积及直径方面均明显增大，而海藻酸盐微囊化肝细胞则较稳定，植入固定床反应器后活力优于非微囊化肝细胞。

单次剂量照射制备大鼠放射性肝纤维化模型的建立与评价

单次剂量照射制备大鼠放射性肝纤维化模型的建立与评价
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基于Amira4.1.1的大鼠小脑外形及深部核团的三维建模

基于Amira4.1.1的大鼠小脑外形及深部核团的三维建模

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同种移植大鼠肝细胞癌模型制作及其MRI表现初步研究

同种移植大鼠肝细胞癌模型制作及其MRI表现初步研究

同种移植大鼠肝细胞癌模型制作及其MRI表现初步研究李文政;彭光春;王润文;汤恢焕;周军;曹觉;周旋;黄满平【期刊名称】《临床放射学杂志》【年(卷),期】2006(25)8【摘要】目的采用同种移植技术建立Wistar大鼠肝细胞癌模型,并初步探讨其MRI表现。

材料与方法将CBRH-7919大鼠肝癌细胞注入免疫抑制的2只6周龄Wistar大鼠皮下,14d后将生成的瘤块移植到免疫抑制的33只实验组大鼠肝内。

肝内瘤块移植后第5、10、15、20、25d分别取相应时间点实验组全部存活大鼠及随机抽取的1只对照组大鼠行磁共振成像并进行影像分析,然后处死动物,取实验组肝内肿块及对照组肝组织做常规病理检查。

结果24只大鼠造模成功,病理证实为肝细胞癌,成功率为72.73%。

接种10d后19只大鼠的肝内瘤灶均被MR平扫检出,呈稍长或等、稍长混杂T1信号,均匀或不均匀稍长、长T2信号。

结论通过免疫抑制同种移植技术可建立Wistar大鼠CBRH-7919原位肝细胞癌模型。

该种建模方法操作简便,易于重复,移植成功率高,实验周期短,肿瘤MRI表现与人类肝细胞癌信号特点相似,是一种较理想的适合于肝癌影像学评价研究的动物模型。

【总页数】4页(P778-781)【关键词】癌,肝细胞;动物模型;磁共振成像【作者】李文政;彭光春;王润文;汤恢焕;周军;曹觉;周旋;黄满平【作者单位】中南大学湘雅医院放射科;中南大学湘雅医院普外科;中南大学湘雅医院V【正文语种】中文【中图分类】R-332;R739.45【相关文献】1.DEN诱发大鼠肝细胞癌模型相关结节的MRI观察 [J], 赵卫东;管生;周康荣;敖红;陈中伟2.二乙基亚硝胺诱发SD大鼠原发性肝细胞癌形成过程中CD68的表达与MRI表现的相关性实验研究 [J], 杨立娟;齐乃新;赵彩蕾3.巨噬细胞活性MRI对多发性硬化大鼠模型中枢神经系统病灶诊断价值的初步研究 [J], 张海琴;李坤成;于春水;马佳;秦文4.ACI大鼠肝细胞癌模型在介入治疗实验中的初步应用 [J], 钱骏;冯敢生;等5.同种移植大鼠肝细胞癌模型的建立及其磁共振表现 [J], 钱骏;冯敢生;等因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建【摘要】目的研究同一细胞内不同形态线粒体的数量、大小和超微结构。

方法用三维重建和体视学测量的方法，研究成年大鼠肝细胞线粒体的形态类型。

结果肝细胞线粒体按形态可分为5个基本类型：Ⅰ型(球形、椭球形和盘状)线粒体约占线粒体总数的21.4%；Ⅱ型(杆状)约占32.4%；Ⅲ型(不规则形)约占23.8%，Ⅳ型(分支形)约占19.6%，Ⅴ型(出芽形)仅占2.8%。

Ⅰ～Ⅴ型线粒体的平均体积分别为0.11、0.21、0.32、0.51和0.64μm3。

体现学分析显示，各型线粒体的体积密度有差异(P＜0.05或P＜0.01)，Ⅱ型线粒体体积密度最大，然后是Ⅲ、Ⅳ和Ⅰ型，Ⅴ型线粒体体积密度最小。

Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ型线粒体嵴膜密度均高于Ⅲ或Ⅳ型(P＜0.05)。

结论肝细胞内不同形态的线粒体都占有一定的比例，他们不仅体积差异很大，其超微结构亦有不同。

【关键词】肝细胞线粒体三维重建体积密度膜密度THREE-DIMENSIONAL RECONSTRUCTION OFMITOCHONDRIA IN RAT HEPATOCYTEMu ChangzhengΔ, Xi Huanjiu*, Bao Cuifen, Liu Xia,Erik IISΦChristensen* *, Cui Shiying(Department of Histology and Embryology,* Department of Anatomy,Jinzhou Medical College,Jinzhou;* *Department of CellBiology, Institute of Anatomy,Aarhus University, Denmark)【Abstract】Objective To examine the number,size and ultrastructure of the different forms of mitochondria in acell.Methods Morphological types of the mitochondria in rat hepatocyte were studied by three－dimensional reconstruction and stereological analyses.Results The mitochondria may be classifiedinto five basic types according to their morphological characteristic.The numbers(%)of type Ⅰ(sphere, ellipses anddisc),type Ⅱ(rods),typeⅢ(irregulars),typeⅣ(branches)andtypeⅤ(budding)were 21.4%,32.4%,23.8%,19.6% and 2.8%,respectively.And their average volume were 0.11μm3,0.21μm3,0.32μm3,0.51μm3 and0.64μm3, respectively. Stereological analyses showed that there were significant difference in volume,density and crista membrane density among five types of mitochondria(P＜0.05 or P＜0.01).The volume density of mitochondria type Ⅱ was the highest,that of type Ⅴ thelowest and that of type Ⅲ,type Ⅳ and type Ⅰ themedium.Mitochondrial cristamembrane density of type Ⅰ,type Ⅱ and type Ⅴ was higher than both that of type Ⅲ and type Ⅳ.Conclusion Each type of mitochondria kept a suitable proportion in normal rat liver cell.There were significant difference not only in volume among different forms of mitochondria,but also in ultrastructure.【Key words】Hepatocyte; Mitochondria; Three-dimensional reconstruction; Volume density; Membrane density线粒体在生长过程中以及在不同的生理或病理状态下，其形态会发生很大改变［1～3］。

自60年代以来，各种细胞线粒体微细结构的研究报道甚多，但对同一细胞内线粒体形态结构和功能差异的研究较少。

我们利用三维重建技术研究大鼠肝细胞线粒体的立体形态，并对其体积密度和嵴膜密度进行体视学测量，为研究线粒体的结构与功能变化提供了形态学依据。

材料和方法雄性Wistar大鼠5只，体重200～320g，Inactin(Bjk-Golden,Knostanz,FRG)腹腔注射麻醉(150mg/kg)。

以140mmHg的压力经腹主动脉灌注1%戊二醛(溶于0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液中，pH7.2)，20min后，摘除肝，切取肝组织块，2.5%戊二醛继续固定1h。

再以1%锇酸(溶于0.1mol/L巴比妥-醛酸缓冲液中，pH7.2)后固定1h，逐级酒精脱水，环氧树脂Epon 812包埋。

每只大鼠取3个肝组织块，每块组织在LKB UltrotomeⅢ型超薄切片机上切1组连续切片，分别收集在贴有Formar膜的单孔铜网上。

枸橼酸铅染色2min，醋酸铀染色10min。

JEOL JEM-1200EX电子显微镜观察。

电镜下，在每组连续切片中，随机选取3个肝细胞进行连续观察。

在放大10 000倍的条件下，对选定的肝细胞以蒙太奇法进行全细胞摄片，洗印时放大3倍，通过照片组合制成完整的肝细胞照片。

组合后的肝细胞照片数与其相应的连续切片相等，即每个肝细胞制成1组与其连续切片相应的照片。

校正仪器放大倍数后，测得照片实际放大倍数为28 920～29 600倍。

通过测量球形小泡(内吞泡、溶酶体等)的直径和球形小泡的连续切片数，计算切片厚度(切片厚度=球形小泡直径/球形小泡连续切片数)［4］。

各组连续切片的厚度为38.5～51.0nm。

在每个肝细胞的1组连续切片照片中，取其中位数照片上的所有线粒体为观察对象(例如：1个细胞连续切片55张，第28张即为中位数切片。

其上如有线粒体105个，该105个线粒体则全部为观察对象)。

通过连续切片观察分析每个线粒体的立体形态，按随机原则从中选取10个线粒体用于三维重建。

重建时，根据每个肝细胞切片厚度的不同，分别选用不同厚度的胶板(胶板厚度=平均切片厚度×照片实际放大倍数)，以连续切片照片中的线粒体为模板，按其原位重建三维模型。

本研究共观察线粒体总数29 010个(来源于5只大鼠)，重建线粒体模型450个。

应用点计数法，通过方格测试系统测量线粒体体积密度，嵴膜密度，以及其他细胞器的体积密度［5］。

利用模型排水法测量线粒体模型的体积，再除以其放大倍数的3次幂，得出实际线粒体体积［6］。

结果1. 线粒体的形态类型连续切片的观察分析和三维重建术显示，肝细胞线粒体形态多样，按其形态特征可划分为5个基本类型，Ⅰ型为球形、椭球形和盘状；Ⅱ型为杆状；Ⅲ型为不规则形；Ⅳ型为分支形；Ⅴ型为出芽形(1～5)。

在每个肝细胞中，各型线粒体都占有一定的比例，其中以Ⅱ型线粒体最多，其次为Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅰ型，Ⅴ型线粒体数量最少(表1)。

2. 线粒体的体积、体积密度及嵴膜密度通过线粒体模型测量的线粒体体积总均数为0.29μm3。

各型线粒体体积差异显著(P＜0.01)。

线粒体体积与形态有很大关系，一般讲，形态越复杂者体积越大(表1)。

体视学分析显示，成年大鼠肝细胞线粒体体积密度明显高于其他膜相结构的体积密度(P＜0.01)。

线粒体体积占肝细胞胞质体积的18.6%(表2，6)。

分析还显示，各型线粒体的体积密度有所不同，除Ⅰ型与Ⅳ型无差异外，其余两两比较均有差异或显著差异(P＜0.05或P＜0.01)。

其中Ⅱ型线粒体体积密度最大，然后是Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅰ型，Ⅴ型的体积密度最小(表1)。

表1 各型线粒体形态计量参数Table 1 Morphometric parametor of different types of mitochondria各型线粒体平均体积每两者相比均有显著差异P＜0.01 Δ 参照系为胞质，除Ⅰ与Ⅳ两者比较外，其他两者相比，P＜0.05或P＜0.01▲ 参照系为线粒体，* *表示与*比较有差异P＜0.05Significant difference of average volume(P＜0.01)was detected among all the types.Δ Reference system is cytoplasm.Significant difference (P＜0.05 or P＜0.01) was detected among all the types.except Ⅰ and Ⅳ.▲ Reference system is mitochondria.**represent significant difference at P＜0.05,as compared to *.表2 大鼠肝细胞胞质体积密度Table 2 Volume density of the cytoplasm in rat liver cell参数系为胞质，n=5 Reference is cytoplasm,n=5线粒体嵴膜密度分析表明，各型线粒体间有所不同，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型之间无显著性差异，Ⅲ、Ⅳ型之间亦无显著性差异，而Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型与Ⅲ、Ⅳ型比较，每两两之间均有差异(P＜0.05)，Ⅴ型线粒体嵴膜密度最大，Ⅳ型线粒体嵴膜密度最小，其余各型居此两者之间(表1)。

1 Ⅰ型(球形、椭球形和盘状)线粒体三维重建模型2 Ⅱ型(杆状)线粒体三维重建模型3 Ⅲ型(不规则形)线粒体三维重建模型4 Ⅳ型(分支形)线粒体三维重建模型5 Ⅴ型(出芽形)线粒体三维重建模型Fig.1 Three-dimensional models of mitochondria typeⅠ(sphere,ellipese and dis c).Fig.2 Three-dimensional models of mitochondria type Ⅱ(rods).Fig.3 Three-dimensional models of mitochondria type Ⅲ (irregulars). Fig.4 Three-dimensional models of mitochondria type Ⅳ(branches). Fig.5 Three-dimensional models of mitochondria type Ⅴ(budd ing).6 正常大鼠肝细胞N.细胞核m.线粒体标尺示1μmFig.6 Normal rat hepatocyte.N:nucleus,m:mitochondria Bar=1μm讨论早在60年代即证实肝细胞线粒体具有多样性和可变性。