V基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望--HBV基因定量分析技术的应用价值
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乙肝病毒血清学标志物定量检测的临床应用价值【Abstract】Objective 探讨乙肝病毒血清学标志物定量检测的临床应用价值。
方法2010年1月至2010年6月申请做乙肝两对半的血清样本204例,进行定量TRFIA法和定性的ELISA法检测乙肝病毒血清学标志物。
结果两种检测方法乙肝病毒血清学标志物各项阳性率比较,P<0.05,差异有统计学意义。
结论乙肝定量检测的临床应用价值明显,可以检出低水平复制的标本,避免漏检,可以解决隐源性肝炎HBV标志物的诊断难题;量化的乙肝病毒血清学标志物指标对临床诊治起到良好的指导作用。
【关键词】乙肝病毒;血清学标志物定量检测;应用价值我国是乙型病毒性肝炎(下称乙肝)感染率较高的国家10%以上为乙肝携带者,感染率非常高,而低浓度在人群中的分布率为0.53%。
目前采用标记免疫学方法检测乙肝病毒(HBV)五项血清学指标是诊断HBV感染的主要手段。
传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)法只能定性测定,时间分辨荧光免疫分析(time resolved fluoroimmuno assay,TRFIA)技术是一种新型免疫标记技术[1],是一种能定量检测HBV标志物新的检测方法,为了能够全面了解乙肝定量检测的临床应用价值,作者进行了研究,现汇报如下。
1 资料与方法1.1 一般资料采取2010年1月至2010年6月申请做乙肝两对半的血清样本204例。
其中男124例,女80例;年龄14~68岁。
1.2 标本采集对204例采集晨起空腹肘静脉血3 ml,于当日分离血清,-70度保存,并于24 h内检测。
1.3 仪器TRFIA法采用罗氏电化学发光仪,上海新波生物技术有限公司生产的Anytest 2000时间分辨荧光测定仪,试剂由上海新波生物技术有限公司提供。
ELISA法采用An-thos2010/HT酶标分析仪以及美国Abbouu公司生产的Axsym全自动免疫分析仪。
TRFIA法试剂由上海新波生物技术有限公司提供。
病毒基因工程的应用前景探究病毒基因工程是一门重要的生物技术领域,通过改造病毒的遗传物质,研究人员可以创造出具有特定功能的病毒,从而实现各种应用。
本文将对病毒基因工程的应用前景进行探究,并介绍其中的几个重要领域。
1. 疫苗研发病毒基因工程在疫苗研发方面具有巨大潜力。
通过改变病毒的基因组,研究人员可以设计出安全有效的病毒样粒子(VLPs),这些病毒样粒子与真实病毒具有相似的结构,但不具有传染性。
研究人员可以将目标病原体的抗原基因导入到病毒样粒子中,从而实现疫苗的生产。
此外,病毒基因工程还可以帮助研究人员开发更加安全稳定的疫苗,例如利用病毒载体传递基因序列,从而诱导人体免疫系统产生对特定病原体的免疫反应。
2. 基因治疗病毒基因工程在基因治疗方面也具有重要作用。
基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的方法,其中病毒被用作基因载体。
研究人员可以将需要治疗的基因序列导入到病毒中,然后将病毒送入患者体内。
一旦病毒进入细胞,其中的基因序列便会被细胞利用,从而实现治疗效果。
病毒基因工程为基因治疗提供了有效的工具,能够帮助研究人员设计更加安全高效的基因载体,同时也提供了治疗多种疾病的可能性。
3. 癌症研究病毒基因工程在癌症研究方面也有广阔的应用前景。
病毒基因工程可以帮助研究人员开发出具有肿瘤选择性杀伤作用的病毒。
这些病毒可以通过改变其遗传物质,使其只在癌细胞中复制和扩散,从而达到杀死癌细胞的效果。
此外,病毒基因工程还可以开发出能够激活免疫系统对癌细胞进行攻击的病毒免疫疗法。
4. 农业领域在农业领域,病毒基因工程可以用于改良作物品种和保护作物免受病毒侵害。
研究人员可以利用病毒载体将目标基因导入到作物中,从而改良作物的农艺性状。
此外,研究人员还可以通过设计抗病毒基因导入作物中,帮助作物抵抗病毒感染,提高农田产量和品质。
5. 环境保护病毒基因工程在环境保护方面也有潜在的应用。
研究人员可以通过改变病毒的基因组,将其用于环境污染物的生物降解。
慢性乙型肝炎患者血清HBV—DNA定量检测及其临床意义的探讨目的探讨慢性乙型肝炎血清HBV-DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式、肝功能状态的关系并分析其临床意义。
方法对173例慢性乙型肝炎患者采用荧光定量PCR法检测血清中HBV-DNA含量,ELISA法检测血清HBVM,拜尔560全自动生物化学分析仪检测肝功能,并进行比较分析。
结果血清HBV-DNA水平与HBVM表现模式有一定关系,HBeAg阳性者HBV DNA均阳性,且为高水平复制,HBeAg阴性/抗-Hbe阳性者仍有HBV复制,且单抗-HBs 阳性、单抗-HBc、抗-HBs和抗-HBc阳性均可检出低水平的HBVDNA,HBV DNA 含量的高低与ALT无相关关系。
结论血清HBV DNA含量与HBeAg有一定的相关性,但HBeAg阴性者病毒未完全停止复制,HBV-DNA可真实反映HBV复制;血清HBV-DNA与ALT无相关关系。
标签:肝炎病毒;乙型;DNA;PCR;荧光定量近年建立的荧光PCR方法,为定量观察病毒提供了一个灵敏的检测方法,本院用这一方法检测了慢性乙型肝炎患者的血清HBV-DNA含量,现将临床资料齐全的血清HBV-DNA水平与HBVM标志物(HBVM)表现模式、肝功能状态的关系作一比较,报道如下。
1 资料与方法1.1一般资料所有病例均为本院2013年3月~6月住院及门诊的各型肝炎患者,共173例,男128例,女45例,年龄12~62岁,平均(31.9±10.7)岁。
诊断与分型均符合传染病与寄生虫学术会议修订的标准[1],其中慢性肝炎143例,活动性肝炎肝硬化20例,慢性重型肝炎10例,排除重叠或混合感染的病例。
1.2方法1.2.1 HBV-DNA定量检测试剂盒购于深圳匹基生物工程有限公司,所有操作均由专人严格按说明书操作,试剂盒的灵敏度为103copies/ml,仪器采用罗氏公司定量PCR仪,依据Taqman原理对模板DNA进行实时在线定量检测。
中外医疗 CH IN A F OR EI G N ME DI C AL T R EA TM EN T 临 床 医 学乙型病毒性肝炎在我国有较高的发病率,已经成为危害群众健康的公众性问题[1],实验室的诊断对于乙型肝炎的预防以及患者的病情观测、抗病毒治疗效果的观察等有着至关重要的作用,目前临床上检测乙肝病毒及其复制情况的方法主要有酶联免疫法检测乙肝两对半(HV B M)血清标志物和P CR法测定H BV-D NA[2]。
因此在临床中通过监测乙肝患者血清HB V-DN A的动态变化,来了解乙刑肝炎H B V-D N A病毒复制活跃与临床的关系以及拉米夫定治疗效果。
1 材料与方法1.1 标本来源100例,乙型肝炎均为我院2006年9月至2008年4月门诊或者住院患者,男68例,女32例,年龄(50.48±11.52)岁,诊断符合西安病毒性肝炎学术会议诊定诊断标准[3]。
其中25例为对照组,75例肝功能化验治疗前A L T>40μ,H B V-D N A≥1.0×104c o p i e s/m LH B V-M示H b s A g、H B c A b均为阳性的患者。
(1)HBV-DNA检测采用荧光定量方法,检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司。
(2)肝功能检测,血清ALT测定采用全自动生化分析仪,ALT> 40UL视为异常。
(3)乙肝二对半检测采用酶联免疫方法,乙肝检测试剂盒为夏门新创生物制品所提供。
(4)LAM(葛兰素史克中国投资有限公司)100mg片/d,疗程52周,于治疗前治疗期间,每隔3个月检测H B V-M、H BV-D VA定量,并动态观察ALT水平,疗程结束后随诊24周。
1.3 仪器美国PE7700自动荧火PCR仪、日本奥林巴斯AU600全自动生化分析仪。
1.4 疗效评价完全应答治疗结束时H b eA g转阴,或H Be A g/HB e Ab出现转换,A LT正常,HB V-D NA阴性,部分答应:HB e Ag阴转或H Be Ab未阳转,HB V-DN A短暂消失,AL T值下降为治疗前一半,无应答:未达上述标准者。
乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床应用目的:探讨乙型肝炎患者HBV-DNA含量与其乙型肝炎血清学标志物的关系。
方法:采用微板核酸杂交技术对200例乙型肝炎血清学标志物阳性的患者和20例正常健康人群,进行HBV-DNA PCR定量检测。
结果:根据血清学标志物分为五组,HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性患者HBV-DNA含量高于其他患者,比较差异有统计学意义(P<0.05),HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性患者与HBsAg、抗-HBc均阳性患者DNA拷贝数比较差异无统计学意义。
结论:乙肝血清学标志物作为乙肝病毒有无感染的指标不能完全反映患者体内HBV的复制情况,HBV-DNA定量检测对监测乙肝病毒感染的病情发展及抗HBV复制药物的治疗具有重要意义。
标签:乙型肝炎病毒;微板核酸杂交;血清学标志物【Abstract】Objective:To investigate the relation between the amount of HBV-DNA in serum of patients with HBV infection and the marker of hepatitis B virus.Method:Serum HBV-DNA was quantitatively detected by tiny plank nucleic acid hybridize technique of PCR to 200 policlinic patients infected with HBV and 20 healthy men.Result:The men were divided into 5 groups with the marker of HBV,there were significance differences from student test between HBsAg,HBeAg,HBcAb masculine and others.Conclusion:It is as index that the marker of HBV monitor hepatitis B virus infection,which couldn’t reflect completely replication of HBV.Quantitative detection of HBV-DNA had important significance to moniter the state of HBV infection and drug treatment.【Key words】Hepatitis B virus;Tiny plank nucleic acid hybridize;Marker of serum hepatitis B virus我国是世界上乙型肝炎病毒感染的高发地区,全国约有50%~70%的人感染过乙型肝炎病毒,约10%的人为携带者。
实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的检测及临床意义摘要】目的:探讨乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒(HBV)的实时荧光PCR定量方法及临床意义。
方法:对60例临床血清标本用荧光PCR定量检测的操作方法及临床意义。
结果:乙型肝炎大三阳患者血清HBV DNA检出率为100% ,HBV DNA的对数值为7.2±1.8;小三阳患者血清HBV DNA检出率为64.5% , HBV DNA的对数值为4.9±1.3。
结论:HBV DNA是HBV感染后病毒血症最直接的标志,是判断病毒复制最灵敏的指标,同时也是判断慢性乙型肝炎是否具有活动性的重要指标。
【关键词】实时荧光PCR定量检测;乙型肝炎;病毒脱氧核糖核酸;临床意义【中图分类号】R51 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231(2017)28-0171-02实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)通常分为二步:首先从标本中提取HBV DNA,然后采用实时荧光PCR扩增 HBV DNA。
目前荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测技术逐渐应用于临床实验诊断[1]。
本实验采用实时荧光定量PCR方法(PCR FQ-PCR)测试了60份临床血清标本结果进行分析。
1.材料与方法1.1 标本来源收集本院住院及门诊收治的乙肝患者血清60份,健康体检者血清60分,其中男40例,女20例,年龄7~80岁。
1.2 标本采集、保存与运送无菌采集静脉血3ml,收集于无菌离心管中(不抗凝或采用EDTA、枸橼酸钠抗凝),室温放置不超过2h,1 600g离心20min,分离血清或血浆,转入无菌离心管中备用。
分离的血浆或血清在4℃保存不应超过24h;-20℃保存不超过3个月;-70℃以下长期保存。
应避免反复冻融。
采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
1.3 方法主反应混合物的配制,从试剂盒中取出HBV PCR反应液、 Taq/UNG酶、HBV荧光探针和MgCl2,室温融化并振荡混匀后,2000r/min离心10s。
57CH INA FO REIGN MEDIC AL TRE ATMENT 中外医疗临 床 医 学乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病,它是我国慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌发生的主要原因。
因此,准确、迅速的诊断对乙肝的治疗和预后极为重要。
本研究采用先进的FQ-PCR 技术检测H BV D NA 含量,T RF I A 法检测乙肝病毒标志物含量,旨在探讨HB VD NA 与各病毒标志物、肝功能之间的关系,为乙肝的临床诊断、抗病毒药物的选择及疗效观察提供参考。
1 资料与方法1.1 一般资料697份血清标本均为2009年4月至2010年6月我院门诊及肝病科的乙型肝炎患者,其中包括急性肝炎74例,慢性乙肝轻度77例,慢性乙肝中度98例,慢性乙肝重度117例,肝硬化149例,亚急性重症肝炎23例,慢性重症肝炎159例,排除有重叠感染及合并可影响肝功能的其他肝病和疾病病例。
全部病例中男558例,女139例,年龄10~81岁,平均(36.25±13.37)岁。
所有患者的诊断均符合2000年中华医学会西安分会修订的《病毒性肝炎防治方案》标准[1]。
1.2 试验方法乙肝病毒标志物定量检测采用TRFIA法,仪器由美国PE公司提供Wallac1235全自动时间分辨免疫荧光分析仪,试剂由广州达瑞抗体工程技术有限公司提供。
H B VD N A 定量检测采用F Q -P C R 法,仪器是由瑞士Roche公司生产的Lightcycle荧光定量检测仪,试剂由上海科华生物技术有限公司提供。
肝功能生化指标检测所用仪器和试剂是由瑞士Roc he公司提供的电化学发光免疫分析仪P800及其配套试剂。
所有试验均严格按照试剂盒说明书操作。
1.3 统计学分析采用SPSS 11.0建立数据库,HBVDNA进行常用对数变换,乙肝病毒标志物和肝功能指标进行自然对数变换,使用Spearman等级相关分析,所有统计操作均在SPSS 11.0统计软件包上进行。
HBV—DNA定量检测的临床意义目前检查乙肝病人最常用的方法是化验“两对半”,即乙肝病毒抗原和抗体的测定。
但它检查的只是乙肝病毒的抗原和人体对这些抗原的免疫反应,并不能代表病毒本身,无法知道体内病毒的多少。
HBVDNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标” HBVDNA称为乙肝病毒脱氧核糖核酸。
病毒从结构上分为两类一类是RNA病毒(核糖核酸病毒),另一类是DNA病毒(脱氧核糖核酸病毒),乙肝病毒属于后者。
病毒与细菌不同,细菌体内含有两种核酸(RNA和DNA),而病毒体内只含有一种核酸,或RNA或DNA。
核酸是病毒的核心部分、病毒的基因都在这里,没有核酸,病毒就不能复制。
因此,检测HBVDNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”。
有人会问,检测乙肝“二对半”已能反映乙肝病毒有无复制、有无传染性,为何还要检测HBVDNA呢?这是不是重复检查,增加了病人的负担? 可以肯定,检测HBVDNA是必需的,不是重复检查,原因如下:重庆市中医院肝病科陈新瑜1.如果乙肝病人是“小三阳”,一般说这是乙肝病毒进入非复制状态,传染性消失或很低,病情也应当趋于稳定。
但实际情况并非如此,有时病人的转氨酶仍然反复波动,甚至出现黄疽,这是怎么回事?经检测HBVDNA发现其为阳性,可以肯定,病毒仍复制活跃、病情不稳定与乙肝病毒活跃有关。
“小三阳”乙肝因其HBe Ag阴性,被称为“HBeAg阴性肝炎”,这是由于病毒“变异”造成的,故也称“异型乙肝炎”。
对此型乙肝不能掉以轻心,病情可能更重。
2.在检测病人“二对半”时,仅发现其中1项阳性,如HBsAg 阳性或单一的抗—HBc阳性,这并不能说明病人体内的病毒有无复制,必需检测HBVDNA,一旦阳性,就可肯定仍有病毒复制、也有传染性。
3.有一些肝炎病人的“二对半”5项全部阴性,甚至甲、丙、丁、戊型肝炎病毒标志物也是阴性,但病人的转氨酶却很高,有黄疽,肝功能损伤明显、这是怎么回事呢?通过测HBVDNA后,可能发现为阳性,就此可断定这种肝炎叫“慢性隐匿性乙肝”,在不明原因的肝炎中,此类型肝炎约占30一60%。
近年来HBV基因定量分析的价值受到越来越多研究者的重视[1]。
过去由于过分强调了HBV感染后过强的细胞免疫应答介导肝细胞损伤,忽视了对病毒复制水平与致病性之间因果关系的研究。
目前普遍认为,尽管HBV不直接破坏寄生细胞,但病毒的活跃复制是启动或激发肝脏组织炎症反应的因素。
这表明确定感染者体内HBV复制状态,即从HBV基因定量的角度作病情分析是十分有意义的。
事实上,真正引起人们关注HBV基因定量分析价值的重要原因是最近发现了干扰素治疗与HBV基因水平两者之间有非常密切的关系。
HBV基因定量分析还在转基因动物、基因治疗、蛋白疫苗和核酸疫苗、抗HBV药物体外试验和动物试验及耐药研究、流行病学研究、HBV血液制品污染监测等方面具有重要的应用价值。
一、HBV基因定量分析在干扰素治疗中的应用尚无药物可以清除所有HBV感染者体内HBV颗粒。
干扰素是目前唯一有一定疗效的一类生物制剂[2],它在病毒等诱导下由几种相关细胞产生,并发挥抗病毒作用。
但是无论使用何种干扰素,也无论治疗剂量或疗程如何,干扰素治疗后HBV转阴率迄今仍保持在40%左右,无法进一步提高,究竟有哪些制约因素起作用尚无定论。
近年来发现干扰素的治疗效果,即干扰素治疗后的反应性(response)很大程度上取决于HBV在体内的复制水平[2,3]。
以下几点事实值得注意:⑴治疗前HBV低水平复制者的反应性明显优于高水平复制者。
HBV转阴的几乎都是那些治疗前血清HBVDNA含量较低者,而治疗前HBVDNA含量特别高者大多没有疗效;⑵治疗中病毒复制水平迅速降低者,有望治愈。
相反,治疗期间HBV 基因水平下降较慢,或下降幅度较小,或变化不明显者,大多是无效者;⑶治疗结束后,采用PCR定量法检测,HBVDNA完全转阴者可能不再复发,而终止治疗后HBVDNA仍保持较低水平者,反跳的可能性较大。
可见,使用干扰素治疗HBV感染时,在各种近期和远期疗效指标中,除了病人的临床表现是否好转,生化指标(ALT)是否改善,肝组织炎症反应是否减轻等以外,血清HBVDNA定量分析是一个十分重要的观察项目。
从现有研究资料看,除病理检查外,HBVDNA定量检测,也许是干扰素治疗效果判断依据中最直接、最可靠和最有价值的指标。
多数研究者认为,通过HBVDNA定量分析来指导干扰素治疗,有重大意义。
首先,在治疗对象的选择方面,即确定干扰素治疗适应症时,应对各侯选病例在某个时间段内定期反复检?釮BVDNA水平,那些长期保持HBV高复制水平者不宜接受干扰并素治疗,或应当联合治疗;其次,干扰素治疗期间,可根据HBV基因水平的动态变化适时调整治疗剂量,决定是否缩短或延长疗程,及是否终止治疗。
这不仅对制订合理的治疗方案,也对减轻病人负担,避免不恰当用药有指导意义[4]。
笔者认为,目前国际上普遍采用的所谓“六个月疗程”及某些中高剂量治疗方案均缺乏充分和足够的立论依据,有必要结合基因定量分析结果,重新评价和制订干扰素治疗计划;最后,干扰素治疗结束后,对有反应者定期作定量分析,有助于发现复发者,并根据血清HBVDNA含量波动情况决定是否实施再治疗。
有人报告,首次干扰素治疗有效者,再治疗的效果亦佳。
如果第一次治疗无反应或反应较差者,第二次干扰素治疗仍不能取得理想疗效[5]。
[!--empirenews.page--]二、HBV基因定量分析的其他临床价值HBV感染后,在临床表现方面的差异非常明显,可以表现为无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、暴发型肝炎、肝硬化及肝癌等多种疾病状态。
病毒在肝细胞内的复制水平与各种临床疾病状态之间可能存在着某些必然联系。
由于HBV基因定量技术的发展和成熟,目前已有可能从某些现象上阐明HBV复制与致病性之间的“量效”关系。
㈠“无症状携带者”可能为活动性乙肝患者[6]。
有部分HBV感染者,由于免疫耐受或其它原因,体内HBV呈复制不活跃的“潜伏”状态,但并不意味着不存在进行性肝损害。
Mels等研究发现无症状携带者在其自然发展史上,HBV复制处于波动状态,时有加剧,病毒复制积累到一定程度后ALT水平增加。
一般规律是:血清HBVDNA水平上升®ALT活性增加®IgM抗HBc滴度提高。
因此无症状携带者应采取积极治疗措施,否则这类人群不仅作为重要的病毒库传播HBV,而且由于隐匿性肝细胞损伤的不断积累,不经过慢性肝炎阶段,直接向肝硬化和肝癌发展。
㈡HBVDNA水平与HBV感染者病情和预后的关系密切。
上述无症状携带者是一个特殊群体。
而对那些急性和慢性乙型肝炎患者而言,HBVDNA水平对预后判断有帮助。
研究发现HBVDNA一直保持较高水平的急性肝炎患者易慢性化,而HBV复制水平较高的慢性肝炎患者不仅对干扰素治疗的反应性差,而且肝组织炎症反应更明显,病情更重,更易发生肝硬化和肝癌。
目前在能否用血清HBVDNA水平来判断肝组织炎症损伤程度这类问题上尚有争议。
动物实验表明,鸭肝被DHBV广泛感染的同时,并不伴随明显病毒血症,肝细胞清除病毒的同时也无病毒血症加重的证据[7]。
然而最近有人对HCV感染者进行基因定量分析研究,发现HCVRNA水平与ALT水平以及肝脏knodell分级之间有密切关系[8]。
㈢肝移植者HBVDNA定量的意义Mazzaferro等报告肝移植前患者血清HBVDNA水平的高低决定移植后肝脏是否再感染HBV[9]。
作者观察到,14例移植前血清HBVDNA 含量低于103拷贝/ml,移植后不间断地采用HBsAb免疫预防,随访36个月,无一例再发肝炎,但另外两例移植前病毒拷贝数大于105/ml则发生了严重HBV再感染。
建议移植前使用抗HBV药物,最大限度降低血清HBVDNA浓度,有助于防止HBV侵犯移植后肝脏,提高肝脏移植的效果。
㈣前核基因突变HBV定量意义HBV前核基因突变可导致HBeAg表达缺失。
感染不表达HBeAg的HBV突变株,或野生型HBV在体内突变并成为优势株均产生较严重的后果,如易发生暴发性肝炎,预后差,干扰素治疗无效等[9,10]。
目前已能采用核酸序列测定技术、PCR 技术、限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术等来定性检测HBV前核基因突变。
最近Baxall 建立了一种PCR及产物的显色反应点突变分析技术(Colourimetricpointmutationassay),用来定量分析突变前核基因,有助于进一步探讨HBV突变与致病性之间的关系[11]。
基因定量分析是一项临床应用型技术,但对基础研究也有一定的应用价值[12],尤其是在当前基因治疗、转基因动物、核酸疫苗等热点研究领域,基因定量分析可能是一种很好的辅助手段,对发现一些有意义的现象也许有一定帮助。
比如HBV在转基因小鼠组织脏器分布规律可用定量标准来衡量,以及用定量手段观察各种药物、细胞因子和其它物质对转基因小鼠HBV基因复制的调节作用。
又如对核酸疫苗注入肌组织后的各种动力学变化的研究远未深入,如能采用定量手段,分析抗原表达基因在体内的存在状态无疑是有益的。
至于各种抗HBV药物,无论是在体外细胞模型(包括转基因细胞模型)还是在动物模型的研究,或在人体研究,采用基因定量分析,应当是考核药物疗效的最佳手段[13]。
[!--empirenews.page--]HBV因定量分析存在的问题及未来展望HBV基因定量技术的发展历史不长,但由于有定性技术为基础,以及与其它学科方法的融汇,发展速度很快,目前趋于成熟。
但应用定量技术去研究HBV感染的临床问题还不充分,同时定量技术本身也有许多问题值得探讨。
一、国际标准化。
这是一个最为突出而又必须尽快解决的问题。
欧洲有一个“病毒性肝炎研究组”(EuropeanStudyGroupinViralHepatitis),经常向欧洲的某些研究机构提供HBV血浆标准品作定量分析参考[14]。
有必要在国际上设立统一的HBV基因标准品,包括各种HBV亚型的标准参照。
笔者认为,克隆的HBVDNA质粒不适宜作标准品。
克隆HBVDNA与载体构成了闭环超螺旋结构,而且,一级结构单一,这与体内存在的HBV基因结构差异很大。
后者呈部分双链,在血清中尚有裂解片段及复制中间体等形式。
因此,无论是在分子杂交,还是在PCR过程中,质粒HBVDNA结构与人体内感染的HBVDNA结构在杂交效率或扩增效率上必然有细微差别,结果将影响定量分析的准确性。
如从高水平HBV阳性病人血清大量抽提,或从转基动物血液中纯化得到HBVDNA,可能是一个制备标准品的途径。
总之,国际化的标准参照,是保证HBVDNA 定量技术精确性和可靠性的前提。
二、分子杂交定量技术和PCR定量技术应当共存下去吗?以下两点值得考虑:首先,有必要弄清体内HBV复制水平极低者(如低于1fg/ml)占HBV感染人数的比例有多大?这类低水平复制者预后如何?如果这类人群属于急性感染恢复期,或有自然清除病毒倾向者,那么似无必要作常规PCR定量分析,定期进行PCR定性检测即可。
其次,有必要建立一种敏感度介于分子杂交和PCR定量技术之间的检测系统。
最近有人利用电化学技术观察到DNA双链互补杂交,甚至单个碱基对结合时发生了微电反应,这给我们以很大启示,今后如有可能在这方面打开突破口,那么基因定量分析两大技术共存的局面会发生转变。
但是,在目前这两大技术仍有很强的互补性。
三、HBV突变株定量分析意义的研究。
HBV基因突变[15],尤其是前核基因突变,直接影响HBV感染病情转归及抗毒治疗效果,同时也反映了来自体内或外界选择压力的作用。
因此,突变株在体内产生的确切原因,突变株与野生株混合存在的发展趋向,突变株是否为耐药株,突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关系,突变株与免疫耐受的关系等均是有必要进一步澄清的问题。
四、基因定量技术在HBV感染流行病学方面的应用[16]。
HBV经血液传播致病已十分明确,但是体液传播的问题还必须有充足的证据来补充。
体液及其它分泌液或排泄物传播HBV是日常生活密切接后感染HBV的直接原因,但其中必然存在“含量与传染性”的关系,那么这个致病的量值完全可以通过HBV感染流行病学研究得到确证。
另外,被污染血制品中HBV基因含量与使用血制品后感染HBV的危险性之间的关系也值得研究。
五、加强HBV低水平复制者预后研究。
目前看来,所谓健康携带者或无症状带病毒者、干扰素治疗部分反应者(partialresponders),以及其他种种HBV在体内呈低复制状态者,在病情、机体免疫[!--empirenews.page--] 状态、预后等方面可能都有一些特殊性,这类病人是否有自然清除病毒的倾向,是否应当实施抗病毒治疗,是否成为重要的传染源等问题都应该作出符合实际的回答。
六、HBV复制水平与抗病毒药物疗效之间的关系研究有待深入。