第九章微生物与基因工程计划学时：2重点：基因工程的基本操作过程，基因工程的应用。
一、基因工程的发展历史基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。
三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。
早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。
1970年史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）中分离出特异切割DNA的限制酶。
次年，内森斯（Nathans）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA，最先绘制出DNA的限制图谱（restriction map）。
1973年史密斯和内森斯提出修饰–限制酶的命名法。
限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA，限制酶的发现使分离基因成为可能。
为表彰上述科学家在发现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。
1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。
1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。
1977年吉尔伯特（Gilbert）实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。
分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以产生。
1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。
1977年板仓（Itakura）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品。
1982年，在建立转基因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。
借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。
同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。
仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。
二、基因工程的基本过程生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。
基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。
基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。
克隆的基因需要进行鉴定或测序。
控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得新的性状。
这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。
基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：①分离或合成基因；②通过体外重组将基因插入载体；③将重组DNA导入细胞；④扩增克隆的基因；⑤筛选重组体克隆；⑥对克隆的基因进行鉴定或测序；⑦控制外源基因的表达；⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物。
上述步骤可用图10-1来表示。
基因工程是指在基因水平的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和作为载体的DNA分子连接起来，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
反以基因工程是人们的分子生物学理论指导下的一种自觉的、能象工程一样可事先设计和控制的育种新技术，是人工的、离体的、分子水平上的一种遗传重组的新技术，是一种可完成超远缘杂交的育种新技术，因而必然是一种最新、最有前途的定向育种新技术。
基因工程的主要操作步骤：一、基因分离(一)分别提取供体细胞(各种生物都可选用)的DNA与作为载体的松弛型细菌质粒 (也可用噬菌体或病毒作载体)。
(二)根据"工程蓝图"的要求，在供体DNA中，加入专一性很强的限制性酸内切酶，从而获得带有特定基因并露出称为粘接末端的DNA单链部分。
必要时，这种粘接末端也可用人工方法进行合成。
作为载体的细菌质粒等的DNA也可用同样的限制性核酸内切酶切断，露出其相应粘接末端。
二、体外重组把供体细胞的DNA片段和质粒DNA片段放在试管中，在较低的温度(5-6℃)下混和"退火"。
由于每一种限制性核酸内切酶所切断的双链DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸组成，所以当两者混在一起时，凡粘接末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双键。
这时，在外加连接酶的作用下，供体体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被"缝合"，形成一个完整的有复制能力的环状重组体，即"杂种质粒"。
图10-1 基因工程基本操作过程示意图三、载体传递即通过载体把供体的遗传基因导入到受体细胞内。
载体必须具有自主复制的能力。
一般可以利用质粒的转化作用，将供体基因带入体细胞内；有时也可用特定的噬菌体(如大肠杆菌的λ噬菌体)或病毒(如在正常猴体内每殖的SV40球形病毒)作载体进行传递。
四、复制、表达在理想情况下，上述这种"杂种质粒"进入受体细胞后，能通过处主复制而得到扩增，并使受体细胞表达出为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为"工程菌"。
五、筛选、繁殖当前，由于分离纯净的基因功能单位还，还较困难，所以通过重组后的"杂种质粒"的性状是否都符合原定"蓝图"，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等能力还需经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个性，然后才可加以繁殖和利用。
三、微生物学与基因工程的关系微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。
从以下六个方面可以说明：①基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；②基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；③微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；④为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；⑤微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；⑥有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。
四、基因工程的应用及展望70年代兴起的基因工程，标志着人类改造生物进入一个新的历史时期。
由于基因工程的迅速发展和广泛应用，它不仅对生命科学的理论研究产生深刻的影响，而且也为工农业生产和临床医学等实践领域开创一个广阔的应用前景。
基因工程正在或即将使人们的某些梦想和希望变为现实。
基因工程被广泛应用于生产实践，带动了生物技术产生高速发展。
现就基因工程一些重要的应用简略叙述如下：（一）、基因工程药物基因工程药物包括一些在生物体内含量甚微但却具有重要生理功能的蛋白质，如激素、酶和抑制剂、细胞因子、抗原和抗体、反义核酸和疫苗等。
此外，还可利用重组DNA技术改造蛋白质，设计和生产出自然界不存在的新型蛋白质药物。
表10-3列出一些具有重要临床应用价值的重组蛋白质药物。
其中，重组胰岛素是作为商品于1982年最早投放市场的基因工程药物；重组疫苗是目前最普遍使用的基因工程药物。
这里仅对这两类药物作一介绍。
1. 重组胰岛素 (recombinant insulin)胰岛素是在胰脏的胰岛中产生的一种小分子蛋白质，它能提高组织摄取葡萄糖的能力，具有降低血糖的作用，可用于治疗人的糖尿病，现在已能在细菌中克隆人胰岛素基因并用于大规模生产。
基因工程生产人胰岛素有两种技术路线。
其一，首先分别化学合成编码胰岛素A链和B链的基因序列，两条链的5′端各加甲硫氨酸密码子ATG，以便表达后加工。
然后将合成的A、B链DNA序列分别插入到质粒载体的β-半乳糖苷酶基因中，克隆基因受β-半乳糖苷酶基因启动子控制。
重组质粒转化E.coli，分别表达A链或B链和β-半乳糖苷酶的融合蛋白。
由于甲硫氨酸位于融合蛋白的连接处，在体外用溴化氰裂解甲硫氨酸，即可使A链或B链与β-半乳糖苷酶片段分开。
然后A链和B链通过二硫键连接，形成具有活性的胰岛素。
其二，先生产胰岛素原，并用酶切和化学裂解将其转变成胰岛素。
具体过程是：将胰岛素原的mRNA经逆转录酶合成cDNA，并在cDNA的5′端加上甲硫氨酸密码子ATG。
然后将cDNA 插入表达载体中，转化E.coli并表达N端为甲硫氨酸的胰岛素原。
将表达产物分离纯化，用胰蛋白酶和羧基肽酶B消化，切去C肽；再用溴化氰处理，除去N-端的甲硫氨酸，即得到胰岛素。
2. 重组疫苗（recombinant vaccines）基因工程已成功开发出一系列重组疫苗，这是一类更有效更安全的新型疫苗。
所谓重组疫苗是指利用重组DNA技术，克隆并表达抗原基因的编码序列，并将表达产物用作疫苗。
第一个被批准在人类中使用的重组疫苗是用酵母生产的乙肝表面抗原（HBsAg），它是由乙肝病毒表面蛋白抗原基因在酵母细胞中克隆和表达得到的HBsAg，实际上是中空的病毒颗粒（只含表面抗原蛋白和磷脂），经纯化后可作为乙型肝炎疫苗。
除用酵母外，昆虫细胞、哺乳动物细胞也被作为宿主，甚至植物也能产生重组疫苗。
现在世界上许多实验室正在试验制备HIV的重组疫苗。
（二）、转基因植物(transgenic plant)近年来，随着DNA重组技术的深入发展，科学家们已能将重组DNA导入植物细胞，并成功培育了许多具有新的优良性状的转基因植物。
主要包括抗病虫害、抗逆（抗盐、碱等）、耐除草剂、延长水果蔬菜的贮存期等，此外还可用转基因植物生产药物（如人的干扰素）、抗体、疫苗等。
转基因植物的构建主要通过Ti质粒，因此这里将主要介绍Ti质粒的改建和应用。
由于Ti质粒能整合到植物染色体中的T-DNA片段，使它能够成为植物基因工程的载体。
T-DNA从土壤农杆菌转移到植物细胞核内是由T-DNA两侧25个碱基对的重复序列所介导，同时还需要在Ti质粒毒性区（vir）某些基因产物（vir蛋白）的作用。
![沈萍主编的《微生物学》[整理版]](https://img.taocdn.com/s1/m/16d08d7a1fb91a37f111f18583d049649b660ef8.png)
