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基因工程-6章 重组DNA导入受体细胞

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人教版教学教案高一生物必修2第6章第7章知识点归纳

人教版教学教案高一生物必修2第6章第7章知识点归纳

第六章从杂交育种到基因工程第1节杂交育种与诱变育种一、杂交育种1.概念：是将两个或多个品种的优良性状通过交配集中一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法。

2.原理：基因重组。

通过基因重组产生新的基因型，从而产生新的优良性状。

3.优点：可以将两个或多个优良性状集中在一起。

4.缺点：不会创造新基因，且杂交后代会出现性状分离，育种过程缓慢，过程复杂。

二、诱变育种1.概念：指利用物理或化学因素来处理生物，使生物产生基因突变，利用这些变异育成新品种的方法。

2.诱变原理：基因突变3.诱变因素：（1）物理：X射线，紫外线，γ射线等。

（2）化学：亚硝酸，硫酸二乙酯等。

4.优点：可以在较短时间内获得更多的优良性状。

5.缺点：因为基因突变具有不定向性且有利的突变很少，所以诱变育种具有一定盲目性，所以利用理化因素出来生物提高突变率，且需要处理大量的生物材料，再进行选择培育。

三、四种育种方法的比较【例1】普通小麦中有高秆抗病(TTRR)和矮秆易感病(ttrr)两个品种，控制两对性状的基因分别位于两对同源染色体上。

实验小组利用不同的方法进行了如下三组实验：请分析回答：(1 )A组由F1获得F2的方法是________，F2矮秆抗病植株中不能稳定遗传的占____________。

(2)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类矮秆抗病植株中，最可能产生不育配子的是____________类。

(3)A、B、C三组方法中，最不容易获得矮秆抗病小麦新品种的方法是________组，原因是____________________________________________。

(4)通过矮秆抗病Ⅱ获得矮秆抗病小麦新品种的方法是________。

获得的矮秆抗病植株中能稳定遗传的占_________________________________________________________________。

(5)在一块高秆(纯合体)小麦田中，发现了一株矮秆小麦。

生物技术-基因工程篇

生物技术-基因工程篇

质粒在宿主细胞中的复制有两种类型

严密型质粒：复制需要蛋白质合成和DNA聚合酶 Ⅲ 的存在，它的复制与宿主细胞的增殖密切相关，每个 宿主细胞内只有1~5个严密型质粒。

松弛型质粒：复制需要DNA聚合酶Ⅰ，可以在没有 蛋白质合成的情况下继续复制，每个宿主细胞内可存 有10~200个以上的松弛型质粒，在细胞蛋白质合成及 染色质复制停止的情况下，可继续大量扩增至上千份。
1、化学转化法
受体细胞经一定的化学作用后，细胞膜通透性增加， 处于感受态，称之为感受态细胞（Competent cells）。

Cacl2法：受体菌（如大肠杆菌 E-coli）在低温下（0℃）被
置于低渗的Cacl2溶液中，菌体膨胀成球形。转化体系中的 DNA与Ca2+形成羟基钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，之后
切点间的片段可以被外源性DNA替代。
2）M13噬菌体（M13 phage）
a. M13噬菌体基因的结构及生活史特点 •单链线性DNA分子，长约6500个核苷酸； •感染大肠杆菌后，单链线性DNA分子可转变成 双链复制型(RF)。从大肠杆菌中分离出双链复制 型的M13还可作为克隆双链DNA的载体； •大肠杆菌被感染后，并不死亡，只是生长缓慢， 而新的噬菌体被释放到菌体外。 •基因组中有一段长约507个核苷酸的非必需区 (IS)，可以插入外源性DNA。
工具酶

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease )
◇能识别DNA分子内部的特异的对称序列,水解磷 酸酯键，切断分子,水解磷酸二酯键，产生DNA片段 的5′端为P，3 ′端为—OH。
◇ 识别序列的特点 ①专一；②常由4~6个碱基组成； ③具有回文序列
BamH 1 酶-GGATCC-CCTAGG-

第六章 重组DNA导入受体细胞

第六章 重组DNA导入受体细胞

根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染

目的基因导入受体细胞

目的基因导入受体细胞

（6）利用遗传选择标记筛 选哺乳动物转基因细胞
• 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移 酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基 因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。
• 常用的标记基因还有： • -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 • -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） • -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
斑点杂交法
狭缝式点样器
斑点及狭缝印迹杂交的特点
1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
4、菌落（或噬菌斑）原位杂交
基本原理 直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上 溶菌、变性 DNA暴露并于滤膜原位结合
第六章 目的基因导入受体细胞
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子 –转化子 –重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为 转化子 ），现在这两者有通用的趋向。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。

重组DNA导入受体细胞

重组DNA导入受体细胞

2、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性 系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也 多是无特异性空间结构的多肽链。 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统， 而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧 链的糖基化或磷酸化等修饰作用。 原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。
转化因子的吸收。双链 DNA 分子与结合蛋白 作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而 另一条链则被吸收到受体菌中。 整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复 合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各 种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色 体DNA处。 转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通 过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域， 形成异源杂合双链 DNA结构。
从遗传性考虑： 重组缺陷型recA－，用于基因扩增或高效表达的
受体细胞（recA-）
限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免 对外源DNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷
（recB-，recC-，hsdR-）
与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与 载体选择标记互补的表型）
具有较高的转化效率
二、受体细胞
受体细胞(receptor cell)：又称为宿主细胞 (host cell)，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞 感受态(competence)：是指细菌吸收外源DNA的 生理状态。 感受态细胞(competence cell)：是指具有接受外 源DNA能力的细胞。
受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋 白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细 胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。

基因工程复习资料

基因工程复习资料

基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。

2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。

如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。

并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。

3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。

种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。

4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。

②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。

③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。

5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。

基因工程的基本操作步骤

基因工程的基本操作步骤

(3) 图中③代表 重组DNA分子 ， 它往往含 标记 基因，以便对 目的基因的检测。
三、目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
将目的基因导入植物细胞的方法 1、农杆菌转化法 2、基因枪法 3、花粉管通道法
传而受功 给且体能 后要细： 代能胞使 。稳并目
定有的 存效基 在表因 且达进 遗，入
基因表达载体的构建
1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一 个切口，露出黏性末端。
2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产 生相同的黏性末端。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口 处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重 组DNA分子（重组质粒）
基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取 二、基因表达载体的构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
(一）目的基因
主要是指编码蛋白质的基因
目前被广泛提取使用的目的基因有： 苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因 （抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。
（二）获取目的基因的方法导入受体菌中储存cDNA2、利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术—多聚酶链式反应
原理：DNA半保留复制的基本原理
前提：一段已知目的基因的核苷酸序列
四种脱氧核苷酸
条件： 模板DNA 热稳定DNA聚合酶(Taq酶）
一对引物
PCR扩增仪
利用PCR技术扩增目的基因
5’G—G 3’ C—C 5’ 引物Ⅱ 3’
还要： 个体生物学水平的鉴定
受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因 完成了表达吗？

高中生物 第六章基因重组与基因工程

高中生物 第六章基因重组与基因工程

第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。

教材内容精要一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。

1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。

2．转化与转导作用(1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。

(2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。

可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。

4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。

基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。

二、重组DNA技术’1．重组DNA技术的相关概念(1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。

DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。

(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作

(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
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(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
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（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
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三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
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（一）引入酶切位点连接法
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电转化的原理图（引自孙明，2006）
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（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
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二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。

《基因工程》----考试重点总结

《基因工程》----考试重点总结

第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。

基因工程（gene engineering）：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。

基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组（gene recombination）技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。

基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳定遗传给下一代。

第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。

从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。

基因（gene）是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）。

基因工程的理论基础：⑴. 明确了遗传信息的携带者—基因的载体是DNA，明确了遗传的物质基础。

⑵. DNA分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。

⑶. 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。

(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。

自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实基因工程的技术基础：⑴. DNA体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现与应用，标志着DNA重组时代的开始）。

⑵. 克隆载体的发展与应用。

⑶. 大肠杆菌转化体系的建立。

⑷. 琼脂糖电泳技术的应用。

⑸. DNA测序技术的应用。

⑹. 核酸杂交技术的应用。

重组DNA导入受体细胞

重组DNA导入受体细胞

1、热激法转化感受态细胞
2、氯化钙法转化
在某些情况下，CaCl2只影响 DNA的结合，并不影响细胞的吸收， 当DNA分子加到处理的细胞内，仍然 吸附在细胞的外部，并没有转化到细 胞质中，将DNA带入感受态细胞的条 件可提高温度到42℃。
3、PEG介导的原生质体转化
4、高压电穿孔法
（1）基本原理 在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形
显微注射分为 （1）真正的显微注射(true microinjection)法
DNA是由注射针直接注入细胞
（2）“穿刺”(pricking)导入法 DNA是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形
成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进 入的。
用显微注射法转移基因的效率明显地超出其它方 法。显微注射用的受体细胞，多数是沿培养皿贴壁生 长的单层细胞。
成微孔，细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入，并 最终进到细胞核内部。
(2)影响因素 脉冲的最大电压 脉冲持续的时间 与DNA浓度则无多大关系
电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。 对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔法 得到的永久转化的频率约为10-4～10-5之间。
5、显微注射法转化
在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖 手术、人ห้องสมุดไป่ตู้受精、细胞核移植、基因注入、细 胞内微量注射、胚胎切割等的技术。
噬 菌 体 转 化 大 肠 杆 菌 的 方 法
一）λ DNA的转染
λDNA的转染作用，是一种低效的过程。 使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的λ DNA，其 典型的转染效率（即每微克λDNA转染产生的噬菌斑 数目），也仅为 105～106之间。 体外连接的结果，转染效率便下降到了104～103左右。

基因克隆的一般流程

基因克隆的一般流程

平端连接图示
匹配粘端连接图示
不匹配粘端连接图示
连接反应的建立
连接反应的温度：
粘性末端，按A-T，G-C含量计算，±5℃。 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。 平末端，如EcoRⅤ（GAT↓ATC），可在室温进行，不超过30℃， 酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。
DNA量：
摩尔数之比 载体:目的 DNA ＝ 1 : ( 1~3 ) 载体摩尔数 目标DNA摩尔数 目标基因片段碱基数×载体重量 目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
连接反应在灭菌的 0.5ml离心管中进行。 15 l 体积反
重组子筛选
下游工作
载体的选择

基因工程载体一般要求：
能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细 胞和在细胞中的复制。
易从宿主细胞中分离纯化出来， 便于重组操作。
有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都 能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。
NGF-sense: NGF-antisense:
6
5
pEGFP 荧光质粒表达载体
质粒DNA的酶切反应结果
质粒 M 酶切反应 M 酶切反应
pEGFP
pT-NGF
酶切产物凝胶回收操作步骤
（Gel Extraction Kit）
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。 按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分钟， 使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒，倒掉收集 管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液体，再 将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。 将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。 将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1 分钟，9000g×1分钟。备用。

智慧树答案基因工程原理知到课后答案章节测试2022年

智慧树答案基因工程原理知到课后答案章节测试2022年

第一章1.基因工程发展过程中技术上的三个重大发现（）。

答案:限制性内切酶和DNA连接酶的发现;载体的使用;逆转录酶及抗性标记的发现2.世界上第一个成功的基因工程实验是使用的是什么的DNA（）。

答案:λ噬菌体的DNA;猿猴病毒SV40DNA3.成功导入外源基因就意味着基因工程实验的成功。

（）答案:错4.基因工程的两个基本特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

( )答案:对5.孟德尔是现代遗传学的奠基人，他发现了基因的连锁和互换定律。

（）答案:错第二章1.PCR在循环几次时才会出现两个引物之间的目的片段（）。

答案:3;2.PCR反应中，所设计的引物长度一般为（）。

答案:16-30bp3.RACE技术可用于（）。

答案:扩增基因末端序列4.DNA提取时，使DNA沉淀的物质是（）。

答案:酒精5.为了防止RNA降解，所用的枪头管子等均需用（）处理。

答案:DEPC水第三章1.Klenow酶于DNA聚合酶相比前者丧失了（）。

答案:5’–3’ 外切酶活性2.下列对逆转录酶描述正确的是（）。

答案:RNA指导的DNA聚合酶3.Ⅱ型限制性核酸内切酶有内切酶和甲基化酶两种酶活性且经常识别回文序列。

（）答案:错4.为了防止DNA的自我环化可用碱性磷酸酶除去DNA分子中的5’-磷酸集团。

（）答案:对5.大多数大肠杆菌中存在的三种位点特异性的DNA甲基化酶（）。

答案:DNA胞嘧啶甲基化酶;EcoK I甲基化酶;DNA腺嘌呤甲基化酶dam第四章1.下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大（）。

答案:酵母人工染色体YAC2.噬菌体载体能承载较大的外源DNA的片段，甚至大于自身大小的DNA片段。

（）答案:对3.柯斯质粒进入受体细胞后，可引起溶源化反应。

（）答案:错4.根据质粒在宿主细胞中的拷贝数的多少可以分为严紧控制型质粒和松弛控制性质粒。

（）答案:对5.在利用LacZ失活得到显色反应筛选法中，IPTG的作用是（）。

答案:诱导宿主α肽的合成第五章1.在cDNA技术中，所形成的发夹环可用（）去除。

基因克隆实验流程

基因克隆实验流程

基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。

获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。

该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。

原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。

2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。

此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。

因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。

3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。

在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。

4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。

用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。

用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。

二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。

为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。

《基因工程是一种重组 DNA 技术》 学历案

《基因工程是一种重组 DNA 技术》 学历案

《基因工程是一种重组 DNA 技术》学历案一、学习目标1、理解基因工程的定义和基本原理，明确其作为重组 DNA 技术的核心概念。

2、掌握基因工程的主要操作步骤，包括目的基因的获取、载体的选择与构建、重组 DNA 的导入和筛选等。

3、了解基因工程在农业、医药、工业等领域的应用，认识其对人类社会的重要影响。

4、培养科学思维和创新能力，能够对基因工程相关的科学问题进行分析和探讨。

二、学习重难点1、重点（1）基因工程的基本原理和操作步骤。

（2）基因工程在不同领域的应用实例。

2、难点（1）目的基因的获取方法及优缺点。

（2）重组 DNA 导入受体细胞的方法和筛选策略。

三、学习过程（一）导入在我们的日常生活中，经常会听到“基因工程”这个词。

比如转基因食品、基因治疗等。

那么，究竟什么是基因工程呢？它为什么能引起如此广泛的关注和争议？让我们一起来揭开基因工程的神秘面纱。

（二）知识讲解1、基因工程的定义基因工程，又称为重组 DNA 技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

2、基因工程的基本原理基因工程的基本原理是基于 DNA 分子的双螺旋结构和中心法则。

它通过提取目的基因，将其与合适的载体连接，形成重组 DNA 分子，然后导入受体细胞，使其在受体细胞中表达，从而实现对生物性状的定向改造。

3、基因工程的操作步骤（1）目的基因的获取目的基因的获取是基因工程的第一步。

目的基因可以从自然界已有的物种中分离出来，也可以通过人工合成的方法获得。

常见的获取目的基因的方法有：从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增、通过化学方法人工合成等。

从基因文库中获取目的基因，就像是在一个巨大的图书馆中寻找一本特定的书籍。

基因文库是包含了某种生物全部基因的许多 DNA 片段的集合。

我们可以根据目的基因的有关信息，从基因文库中筛选出我们需要的目的基因。

目的基因导入受体细胞及重组子的筛选

目的基因导入受体细胞及重组子的筛选

活化菌种，扩大培养，使其 处于对数生长后期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞 ■优点 大 部 分 原 核 细 胞 没 有 纤 维 素 组 成 的 坚 硬 细 胞 壁 ， 便 于 外 源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
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二、选择受体细胞的基本原则
①便于重组DNA分子的导入。 ②便于重组体的筛选。
③遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密 度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞 而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强， 可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中 进行培养。
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④受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶 含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累， 可促进外源基因高效分泌表达。 ⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生 物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺 陷型细胞作为受体细胞。
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6、微注射技术

微注射技术：一般是用微吸管吸取供体DNA溶液， 在高倍倒置显微镜下准确地插入受体细胞核中， 并将DNA注射进去。常用于转基因动物研究。
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7、脂质体导入法

脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成 的，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜, 从而形成一种囊状物被称为脂质体。 脂质体导入法:将DNA或RNA包囊于脂质体内，然 后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细 胞,这种转染方法称为脂质体导入法。

此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
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磷酸钙-DNA共沉淀法
3、共转化（植物细胞）
共转化(cotransformation) 基因工程中将两个以上的基因同时导入感受 态真核细胞的方法，又称共转染。 适用于对不带有可选择标记性状的目的基因 进行研究。
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附图1
CaCl2热激法转化感受态细胞
附图2
2、磷酸钙-DNA共沉淀法（动物细胞）
磷酸钙-DNA共沉淀法 是指外源基因与磷酸钙混合形成磷酸钙-DNA共沉 淀物，可使DNA附在细胞表面，通过细胞吞入摄取 或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内， 这种转染方法称为磷酸钙-DNA共沉淀法。


③基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于 对引入的外源基因进行遗传分析。
④原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性 的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周 期短，重复实验快。
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原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：

①原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复 性系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到 的也多是无特异性空间结构的多肽链。 ②原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统， 而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其 侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
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基因工程常用的受体细胞有:
大肠杆菌 枯草杆菌
土壤农杆菌
酵母菌
植物细胞
动物细胞
大肠杆菌
1、原核生物细胞的优点

①大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细 胞壁，便于外源DNA的进入。 ②没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质， 这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。
Turtle HMGB1 0 1 1 1 0 2 2 7
Chick HMGB1 0 0 2 2 1 1 2 8
Mouse HMGB1 1 0 6 1 3 2 3 16
Human HMGB1 0 0 3 1 2 2 6 14
Human HMGB2 2 0 3 2 1 3 2 13
Human HMGB3 0 0 4 2 1 2 5 14
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电穿孔法
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5、基因枪法
基因枪法(又称粒子轰击法) 用高压气体加速把粘有DNA的细微金粉(或钨 粉颗粒)打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞 质等层层构造到达细胞核，完成基因转移的方 法。 基因枪法适用于动植物组织或细胞、胚胎、细 菌及小动物等。 基因枪法特点：快速、简便、安全、高效。
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4、电转化
电转化又称电穿孔法(electroporation):

是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上 形成纳米大小的微孔，DNA直接通过这些微孔或者作 为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜 进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。

最早用于将DNA导入真核细胞,1988年,Dower等人成功 应用于大肠杆菌的转化。基本原理是利用高压电脉冲 作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的 瞬间通道,从而促进外源DNA的有效吸收。
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将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载 体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使 用标记基因与目的基因对应的选择剂进行两 次筛选，最后可得到复合转导的转化子。

共转化常用的报告基因:胸苷激酶基因(tk基因)、 抗新霉素基因(neor)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 基因(XGPRT)等。
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脂质体介导转染的机制

阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通 过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合 体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜 的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作 用,将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体, 其中一小部分DNA能从包涵体内释放,并进入细胞质 中,再进一步进入核内转录、表达。
发展前景
生物学的研究表明，在地球上有许多动物具有很多
种优良的特性，是我们所不具备而又想具备的（猫
头鹰可以在黑夜看清东西；壁虎有再生能力）。如 果我们具备了地球上200种生物所有的优良特性，我
们的威力将会多么的强大！生物工程的发展表明，
这是完全有可能的。
本章重点掌握的内容




概念:受体细胞、电穿孔法、共转化、基因枪法、 感受态细胞、转化、转染、磷酸钙-DNA共沉淀法、 微注射技术。 选择受体细胞的基本原则 氯化钙转化法的基本原理 脂质体介导法及其转染的机制 常用的基因导入受体细胞的方法。 原核生物细胞作为受体细胞的优点与缺点。 酵母菌作为受体细胞的优点。 哺乳动物细胞作为受体细胞的优点与缺点。
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根据转移基因载体与受体的特性可分为：


质粒载体导入受体细胞的方法：CaCl2、电转化法；
噬菌体转染细胞的方法：体外包装感染法； DNA导入酵母菌的方法：电穿孔转化法； DNA导入植物细胞的方法：Ti质粒叶盘法、电穿孔转 化法、基因枪法；


DNA导入昆虫细胞的方法：杆状病毒感染法；
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3、动物细胞
常用的动物受体细胞有Hela细胞、猴肾细胞和中国 仓鼠巢细胞(CHO)等。
MCF-7
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哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：
①能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的 RNA。 ②真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰,产物具有 较好的蛋白质免疫原性,约为酵母细胞16-20倍。 ③易被重组DNA质粒转染,具有遗传稳定性和可重复性。 ④经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯 和加工，成本低。 缺点是:组织培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的 转化子CHO细胞，通常需要数月之久,难度较大。
重组DNA技术操作过程可形象归纳为
分 切 接 转 筛 分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 拼接重组体 转入受体菌 筛选重组体
第六章 重组DNA导入受体细胞
一、受体细胞 二、选择受体细胞的基本原则
三、重组DNA导入受体细胞的方法
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一、受体细胞
受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞 (host cell)，是指能摄取外源 DNA并使其稳定维持的细胞。 感受态(competence) 是指细菌吸收外源DNA的生理状态。 感受态细胞(competence cell) 是指具有接受外源DNA能力的细胞。
转染(transfection):指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬 菌体或以它为载体构建的重组DNA分子的过程。 转导(transduction):指病毒转移真核细胞A的过 程或噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。



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1、氯化钙转化法（大肠杆菌）
●
1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆菌经过氯 化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收λ噬菌 体DNA。1972年美国斯坦福大学 S.Cohen报道,经 氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。
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⑥能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。
⑦受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。
⑧具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基 因的高效表达。
⑨在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
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稀有密码子：
Amino acid Leu Ile Pro
Rare codon CTA ATA CCC CGG
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载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列 分子： a. 未连接的载体分子 b. 未连接的DNA片段 c. 载体的自连 d. 含有错误插入片段的重组DNA分子 e. 重组DNA分子
转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。 未连接的分子即使被细菌摄取，寄主的酶可降解 这些DNA片段。 自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主 细胞进行正常的复制
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技术的忧患
1.基因污染： 人工组合的基因，可能会通过转基因作物或家养动物扩展 到其他栽培作物或自然界野生物种，并成为后者基因的 一部分。这就是基因污染。 2.基因武器 运用遗传工程技术，按人们需要，在一些致病细菌或病毒 中，接入能对抗普通疫苗或药物的基因，产生具有显著 抗药性的致病菌；或者在一些本来不会致病的微生物体 内接入致病基因，而制造出新的生物制剂。