酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白罗深恒;许丽红;楚雯;马岳;刁爱坡【摘要】采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.%To screen the candidate protein interacting with prostate transmembrane protein, androgen induced 1 (PMEPA1). The bait plasmid pGBKT7 - PMEPA1 was constructed and transformed into yeast strain Y2H Gold, and then validated by auto - activation and toxicity assays.A universal human library was used for screening with the bait plasmid pGBKT7 - PMEPA1, and positive clones were selected after screening and co - transformation identification. The interaction between two proteins was further analyzed by GST pull - down. The bait plasmid pG-BKT7 - PMEPA1 was successfully constructed. No auto - activation and toxicity were detected. A target protein of Dynactin6 was fished out and GST pull - down assay confirmed the interaction between PMEPA1 and Dynactin6. Dynactin6 was identified as a PMEPA1 interacting protein using yeast two - hybrid system, suggesting that Dynac-tin6 might be involved in regulating intracellular protein transport of PMEPA1. These results will lay a foundation to further study the biological function of PMEPA1.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(044)004【总页数】5页(P96-99,108)【关键词】PMEPA1;酵母双杂交;Dynactin【作者】罗深恒;许丽红;楚雯;马岳;刁爱坡【作者单位】天津科技大学生物工程学院,天津300457;天津科技大学生物工程学院,天津300457;天津科技大学生物工程学院,天津300457;天津科技大学生物工程学院,天津300457;天津科技大学生物工程学院,天津300457【正文语种】中文【中图分类】Q789前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protein，androgen induced 1)N-端含有1个跨膜区，由252个氨基酸组成，在正常的前列腺组织大量表达，在前列腺癌细胞中表达量低，且表达水平受雄激素的调控［1-2］，如经雄激素抑制剂处理雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP，PMEPA1表达明显下降［3］．说明PMEPAl是一个雄激素诱导负调节前列腺癌细胞生长的基因，通过DNA甲基化介导的表达沉默在前列腺癌的发生过程中发挥重要的作用［4］．Nedd4(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)属于泛素连接酶家族的一员［5］，Nedd4泛素化与PMEPA1互作，其功能还不清楚［2，6］．本研究利用酵母双杂交技术从人cDNA文库中筛选PMEPA1的互作蛋白，进一步研究PMEPA1蛋白质间互作在前列腺癌细胞癌变中的作用，为探索治疗前列腺癌的新方法提供科学理论依据．1 材料与方法1．1 材料大肠杆菌Top10和BL21-RIPL感受态细胞，纯化重组蛋白 His-PMEPA1、GST-Nedd4、GSTGolgin84，PMEPA1兔多克隆抗体，由本实验室制备和保存;酵母双杂交系统试剂盒(含表达载体pGBKT7质粒，pGADT7质粒)和酵母菌株Y187(含人cDNA文库)，Y2H Gold均购自Clontech公司;内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ及T4 DNA连接酶，PCR高保真酶pfu、Taq酶购自Fermentas公司;DNA纯化和小提质粒提取试剂盒购自天根公司;酵母质粒提取试剂盒购自Clontech公司;谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱购自 GE healthcare公司;YPD、-Trp Do Supplement、-Leu-Trp Do Supplement、-Leu-Trp-His-Ade Do Supplement、X- α -Gal、Aureobasidin A 为Clontech公司产品．1．2 方法1．2．1 诱饵蛋白载体的构建以人PMEPA1基因为模版，上游引物:5’-CACTACAAGCTG TGTCTG-3’，下游引物5’--3’．PCR 扩增PMEPA1序列，下划线酶切位点分别为NdeⅠ和Eco RⅠ．PCR反应程序:95℃预变性2 min;95℃变性30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸90 s，30 个循环;72℃延伸5 min;4℃保存．产物用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的DNA片段后利用NdeⅠ和Eco RⅠ进行双酶切，随后与经酶切好的pGBKT7载体连接，转化大肠杆菌Top10感受态，经卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，提取转化子质粒进行PCR和酶切鉴定后，由北京华大基因公司测序鉴定．1．2．2 免疫印迹检测诱饵蛋白的表达参照Clontech说明的乙酸锂法将诱饵载体pGBKT7-PME-PA1和空载体pGBKT7分别转化酵母菌Y2H Gold，涂布SD/-Trp固体培养基，30℃培养2～3 d后，挑取转化子在50mL SD/-Trp培养液中培养20～24 h．裂解菌体并提取酵母菌蛋白，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后直接经半干法将蛋白转到硝酸纤维素膜上，用一抗PMEPA1兔多克隆抗体和二抗Alexa680标记羊抗兔IgG(Invitrogen)免疫印迹检测PMEPA1在酵母菌中的表达．1．2．3 诱饵蛋白的毒性和自激活检测将构建好的pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7空载体分别转化到酵母 Y2H Gold中，同时在 SD/-Trp和 SD/-Trp/X-α-Gal/-Aba固体培养基上培养3～5 d后观察，比较菌落生长情况，确定蛋白是否有自激活作用和菌体毒性．1．2．4 诱饵质粒与文库的杂交筛选转化诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1到酵母Y2H Gold中，在SD/-Trp液体培养基中培养至OD600=0．8，离心，收集菌体，用5 mL新鲜SD/-Trp液体培养基重悬，加入1 mL含有文库质粒的酵母菌Y187，加入45 mL 2×YPDA培养基在30℃，30～50 r/min，培养20～24 h．离心，菌体用5 mL 0．5×YPDA重悬后，按200μL/板均匀涂布于直径150 mm的SD/-Trp/-Leu/X-α-gal/-Aba(DDO/X/A)的平板上(约30块)，30℃倒置培养3～5 d．转移≥2 mm的阳性克隆到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/-Aba(QDO/X/A)平板上，30℃倒置培养3～5 d，然后根据酵母在不同缺陷型培养基上的表型分析结果并鉴定阳性克隆．提取能同时激活4个报告基因的阳性克隆的质粒，转化大肠杆菌Top10感受态，经氨苄霉素抗性筛选，提取猎物质粒．1．2．5 阳性克隆的复转验证和序列分析将候选的质粒与pGBKT7-PMEPA1重新共转至酵母Y2H Gold中，经DDO/X/A和QDO/X/A等2轮筛选后确定复转阳性的质粒，并送公司测序，序列结果用Research和NCBI上BLAST等工具进行分析．1．2．6 GST Pull-down实验以 pGADT7-dynactin6为模板，上游引物:5’GAGAAGACTCAAAA GAGTG-3’，下游引物:5’-TTAGTTCTTTACTGGAGTTG-3’，PCR扩增Dynactin6基因，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，与载体pGEX-4T-2连接构建pGEX-4T-2-Dynactin6重组质粒．转化大肠杆菌BL21-RIPL感受态细胞，使用终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导过夜，细菌收集后使用裂解液重悬，超声破碎细胞，12 000 r/min离心15 min，收集上清，上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱4℃孵育2 h，经PBS洗涤3次，用20 mmol/L的还原性谷胱甘肽洗脱，再经PD10柱除盐．以Nedd4+PMEPA1为阳性对照，Golgin84+PMEPA1为阴性对照．取5μg纯化蛋白GST-Dynactin6、GST-Nedd4、GST-Golgin84 分别与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱4℃孵育2 h，裂解液洗涤3次，离心弃上清，各加入0．5μg的His-PMEPA1于4℃孵育2 h，裂解液洗涤3次，离心弃上清，加入40 μL SDS上样缓冲液，western印迹检测．2 结果与分析2．1 诱饵质粒pGBKT7-PM EPA1的构建和鉴定根据Genebank中编号为199169．1的PMEPA1基因序列，利用PCR扩增不含跨膜区的PMEPA1序列，获得约690 bp的目的片段，PCR产物经纯化后用NdeⅠ和Eco RⅠ进行双酶切后连接到pGBKT7载体上，转化大肠杆菌Top10感受态，PCR和酶切验证(图1)，目的片段和质粒大小正确．测序结果表明重组质粒读码框架正确，可用于酵母双杂交筛选．图1 重组质粒的PCR(A)和酶切验证(B)Figure 1 Identification by PCR(A)and enzyme digestion(B)of recombinant plasmid1:DNA marker;2:pGBKT7-PMEPA12．2 诱饵蛋白的表达将pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7载体分别转化酵母菌Y2H Gold，扩增培养后提取酵母菌蛋白，免疫印迹检测结果显示，转入诱饵载体pGBKT7-PMEPA1的酵母菌中有外源蛋白PMEPA1表达，而转入空载体pGBKT7的酵母菌中未检测到PMEPA1表达(图2)，表明人PMEPA1蛋白成功在酵母菌Y2H Gold中表达，可以利用酵母双杂交系统从人cDNA文库中筛选潜在的互作蛋白．2．3 诱饵蛋白的毒性和自激活检测将pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7转化酵母菌Y2H Gold后，涂布在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-gal/-Aba缺陷培养基上培养3～5 d．转化诱饵载体pGBKT7-PMEPA1和空载体pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp上均能正常生长(图3)，表明蛋白没有菌体毒性;转化诱饵载体pGBKT7-PMEPA1和空载体pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal/-Aba上均不能生长，结果与预期一致，表明诱饵蛋白不具有自激活的活性．图2 诱饵蛋白的表达检测Figure 2 Expression assays of baitprotein1:pGBKT7-PMEPA1;2:pGBKT7图3 诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1的毒性和自激活检测Figure 3 Toxicity and auto-activation assays of bait plasmidA，B:SD/-Trp;C，D:SD/-Trp/X-α -gal/-Aba2．4 人cDNA文库的筛选和阳性克隆的鉴定将含有人cDNA文库质粒的酵母菌Y187和含有诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1的酵母菌Y2H Gold，在SD/Trp-/-Leu/X-α -gal/-Aba(DDO/X/A)缺陷培养基(150 mm)上共培养3～5 d，得到138个阳性转化子，挑取阳性转化子进行His、Ade 的表型分析，将阳性转化子转接到 SD/Trp-/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/-Aba(QDO/X/A)缺陷培养基(100 mm)上培养3～5 d，结果获得78个阳性克隆．提取质粒转化大肠杆菌Top10感受态细胞，经过氨苄霉素抗性筛选获得猎物质粒，随后与pGBKT7-PMEPA1共转酵母Y2H Gold，经DDO/X/A和QDO/X/A等2轮复转验证后，得到17个阳性的质粒(图4)．测序后获得3个阳性克隆，表明均为编码动力蛋白激活蛋白Dynactin6基因．2．5 GST pull-down验证PMEPA1与Dynactin6相互作用纯化蛋白 GST-Dynactin6、GST-Nedd4、GSTGolgin84分别与与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱结合后，与His-PMEPA1蛋白共孵育后，结合物经SDSPAGE电泳分离后，用PMEPA1抗体进行 Western blotting检测．Nedd4+PMEPA1泳道为阳性对照，Golgin84+PMEPA1泳道为阴性对照(图5)，Dynactin6+PMEPA1泳道检测到PMEPA1，表明Dynactin6与PMEPA1蛋白存在相互作用，进一步验证了酵母双杂交的筛选结果．图4 缺陷培养基筛选阳性质粒Figure 4 Screening of positive plasmids on dropoutmedia(A)DDO/X/A(150 mm)(B)QDO/X/A(100 mm)图5 GST pull-down验证PMEPA1与Dynactin6相互作用Figure 5 Identification of interaction by GST pull-down1:5%Input;2:Dynactin6+PMEPA1;3:Golgin84+PMEPA1;4:Nedd4+PME PA13 讨论研究蛋白相互作用的方法很多，其中酵母双杂交技术一直被认为是最为灵敏和可信的方法之一．本研究利用GAL4酵母双杂交系统，酵母菌Y2H Gold具有4个报告基因(ADE2，HIS3，MEL1，AUR1-C)，它们在蛋白质发生相互作用形成完整GAL4结构时被激活表达，作者以PMEPA1-GAL4 DNA结合域融合蛋白为诱饵，筛选用GAL4转录激活域构建的人cDNA文库．通过对人cDNA文库进行选择性平板筛选，及测序和序列分析，确定了3个阳性克隆，均为编码动力蛋白激活蛋白Dynactin6基因，GST pull-down实验也进一步验证PMEPA1与Dynactin6蛋白间的相互作用(图5)．Nedd4基因片段较大(为2．7 kb)，并且其3’非编码区有3 kb，导致筛选用的cDNA文库中没有含Nedd4基因片段．PMEPA1是一个前列腺跨膜蛋白，在前列腺中大量表达，而PMEPA1蛋白在前列腺细胞癌变过程中表达水平明显下降或者缺失［6］．Nedd4能够通过泛素依赖蛋白酶体介导的蛋白降解，对细胞分化、增殖、凋亡等过程起着重要的作用．动力蛋白激活蛋白Dynactin复合体是真核细胞中由多亚基组成的蛋白复合物，与动力蛋白dynein结合，使其沿微管做长距离囊泡运输，并且在细胞有丝分裂及分化成熟中发挥重要作用［7］．组成Dynactin复合体的亚基按其结构特点分为3类:(1)长臂样结构亚基蛋白:DCTN1，DCTN 2和DCTN3;(2)Arp1棒状结构亚基蛋白:Arp1，actin，CapZ;(3)尖末端亚基蛋白:Arp11，DCTN4，DCTN5，DCTN6［8］．DCTN 1直接与动力蛋白和微管结合，对Dynactin复合体的结构和功能维护发挥至关重要的作用;DCTN2影响微管到中心体的锚固［9］;DCTN4直接结合Arp1亚基［10］．Arp1亚基已经被证明是 Dynactin复合体和囊泡结构(如高尔基体)连接的结构域［11］．动力蛋白在细胞内膜细胞器运输中有重要功能［12］．PMEPA1 是高尔基体相关的跨膜蛋白［6］，在胞内体上也有定位［13］，本研究结果暗示动力蛋白激活蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在高尔基体和胞内体间的运输．参考文献:［1］RICHTER E，SRIVASTAVA S，DOBIA．Androgen receptor and prostate cancer［J］．Prostate Cancer P D，2007，10(2):114-118．［2］LIH，XU L L，MASUDA K，et al．A feedback loop between the androgen receptor and a NEDD4-binding protein，PMEPA1，in prostate cancer cells［J］．J Biol Chem，2008，283(43):28988-28995．［3］BUEHLER P，FISCHER T，WOLFP，etal．Comparison of gene expression in LNCaP prostate cancer cells after treatmentwith bicalutamide or 5-alpha-reductase inhibitors［J］．Urol INT，2010，84(2):203-211．［4］RICHTER E，MASUDA K，COOk C，et al．A role for DNA methylation in regulating the growth suppressor PMEPA1 gene in prostate cancer ［J］． Epigenetics，2007，2(2):100-109．［5］WANG X，TROTMAN L C，KOPPIE T，et al．NEDD4-1 is a proto-oncogenic ubiquitin ligase for PTEN［J］．Cell，2007，128(1):129-139．［6］XU L L，SHIY，PETROVICSG，et al．PMEPAI，an androgen-regulated NEDD4-binding protein，exhibits cell growth inhibitory function and decreased expression during prostate cancer progression［J］．Cancer Res，2003，63(15):4299-4304．［7］SPUDICH JA，GERHART J，MCKNIGHT S L，et al．Dynactin ［J］．Annual Review of Cell and Developmental Biology，2004(20):759-779．［8］ECKLEY DM，GILL SR，MELKONIAN K A，etal．A-nalysis of dynactin subcomplexes reveals a novel actinrelated protein associated with theArp1 minifilament pointed end［J］．JCell Biol，1999，147(2):307-320．［9］UETAKE Y，TERADA Y，MATULIENE J，et al．Interaction of Cep135 with a p50 dynactin subunit in mammalian centrosomes［J］．Cell Motil Cytoskel，2004，58(1):53-66．［10］KARKIS，TOKITOM K，HOLAZBAUR E L．A dynactin subunit with a highly conserved cysteine-rich motif interacts directily with Arp1［J］．JBiol Chem，2000，275(7):43-48．［11］HOLLERAN E A，TOKITO M K，KARKI S，etal．Centractin(ARP1)associates with spectrin revealing a potential mechanism to link dynactin to intracellular organelles［J］．JCell Biol，2001，135:1815-1829．［12］翟中和，王喜忠，丁明孝．细胞生物学［M］．北京:高等教育出版社，2011．［13］YUKIHIDEW，SUSUMU I，TOSHIYASU G．TMEPAI，a trans membrane TGF-b-inducible protein，sequesters smad proteins from active participation in TGF-b signaling［J］．Mol Cell，2010，37(1):123-134．。

HeLa细胞cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308的构建田颖新;王春苗;刘雪晴;贾晓晖;贾天军【摘要】旨在利用酵母双杂交系统构建HeLa细胞的cDNA文库,并构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308.从HeLa细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的HeLa细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库.应用PCR技术扩增目的片段CPn0308,并成功克隆该基因到诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒转化酵母菌株AH109后,检测诱饵载体有无自激活和细胞毒性作用.结果显示,文库展现良好的多态性,重组诱饵载体pGBKT7-CPn0308不具有毒性且未自主激活报告基因,说明该文库和诱饵质粒可用于酵母双杂交系统.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)003【总页数】5页(P148-152)【关键词】HeLa细胞;cDNA文库;pGBKT7-CPn0308;酵母双杂交;自激活【作者】田颖新;王春苗;刘雪晴;贾晓晖;贾天军【作者单位】河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000;河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000;河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000;河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000;河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000【正文语种】中文肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae，CPn）是一类革兰氏染色阴性、具有严格的活细胞内生长特性的微生物。

肺炎衣原体已被确定是呼吸道疾病的常见病原体，并与动脉粥样硬化[1]、老年痴呆症[2]、淋巴肉芽肿[3]、关节炎[4]和急性冠脉综合征[5]等有关。

包涵体是衣原体赖以生存和繁殖的微环境，衣原体致病的关键特性之一是其具有阻止包涵体与宿主细胞的溶酶体融合的能力[6,7]，从而避免宿主细胞对衣原体相关抗原的内源性途径的提呈而得以生存，对包涵体膜蛋白进行深入研究有助于解释衣原体的生理发育和致病机制，因而引起学者的极大关注。

酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活效应的检测闵婕;李青;马楠;康艳霞;李娜【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2013(021)003【摘要】Objective;To construct a bait vector containing human cide -3 gene in yeast two -hybrid system in order to screen the human liver cDNA library. Methods; The fragment including all exons of cide -3 gene was amplified by RT-PCR and was inserted into the multiple cloning sites of the shuttle vector pGBKT7. After confirmation with restricted endonuclease digestion and sequence analysis,by using PEG/LiAC method,the plasmid pGBKT7 - cide -3 was transformed into yeast AH109. The plasmid and protein isolated from the positive yeast AH109 clone was tested its expression,toxicity and transcriptional activation. Results:The human cide -3 cDNA was amplified. The restrictive endonuclease digestion and DNA sequencing proved that the plasmid pGBKT7 - cide - 3 was obtained. The yeast AH109 clone transformed with pGBKT7 - cide - 3 was screened out by the SD/ - Trp nutritional media. Sequence analysis revealed that the fragment was correctly inserted into pGBKT7 with a right reading frame and its expression in yeast was verified. Conclusion; The bait plasmid pGBKT7 -cide -3 constructed expresses correctly,and can not activate the transcription of。

酵母双杂交表达载体pGADT7—tTGA2的构建及酵母菌的转化作者：何乐肖牧徐健阮颖来源：《安徽农业科学》2014年第30期摘要[目的]研究TGA2在植物系统获得抗性中所起的作用，阐明其作用机制。

[方法]通过PCR扩增获得拟南芥中TGA2基因全长CDS序列，克隆至pGADT7酵母表达载体，并转化至AH109酵母菌株中。

[结果]重组质粒通过大肠杆菌转化获得了阳性克隆，经过菌落PCR及单、双酶切验证重组质粒构建成功。

将重组质粒又转化到AH109酵母菌中，并在相应筛选培养基上成功获得了转酵母菌成功的阳性克隆。

[结论]为进一步研究TGA2参与水杨酸诱导抗性基因表达的作用机制奠定了良好的基础。

关键词 AtTGA2；CDS克隆；酵母转化中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10467-02作者简介何乐（1990- ），女，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向：分子抗性。

*通讯作者。

TGA转录因子是一类含碱性DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域，可以结合到PR1基因启动子应答性的顺式作用元件。

它因含有TGACCG/as1（Activation seguence1）元件而得名[1-2]。

该类启动子通过与NPR1 基因协同作用参与植物对病害的防御作用。

具体作用方式为NPR1 寡聚体中的半胱氨酸残基分子间二硫键被水解还原，形成NPR1单体，NPR1单体具完整的核定位序列，使其能够转移到细胞核内并与结合在PR1基因启动子区的TGA类转录因子相互作用，调控PR基因的表达和系统性抗性（SAR）的产生[3-6]。

不同TGA成员有2种方式与NPR1互作，第一种是TGA与NPR1直接结合，正向调控PR1基因的表达和抗性的产生，两者结合的强度、保持时间与PR基因表达和抗性产生的强度成正比。

如在一些植物体内，在防卫反应启动子被激活的过程中，TGA因子能与激活子序列（as1）或类as1启动子元件相结合，如拟南芥中的PR1。

hPIN1基因酵母双杂交表达载体的构建及其毒性与自激活效应检测孟祥贵1黄轶2杨梅华3 刘立杰1(1第三军医大学新桥医院健康体检中心，重庆400037；2 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室, 重庆市生化与分子药理重点实验室，重庆400016；3 第三军医大学新桥医院神经外科，重庆400037) [摘要]目的克隆人肽基脯氨酰顺反异构酶PIN1基因，构建酵母双杂交系统表达载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。

方法运用RT-PCR 从人胃癌组织中扩增PIN1基因片段,平端克隆入环状自连pMD18-T载体，测序鉴定后以此为模板再次扩增相应片段克隆入酵母双杂交载体pGBKT7与pGADT7中。

醋酸锂法转化酵母菌AH109,检测诱饵蛋白对酵母AH109有无细胞毒性及对报告基因有无激活作用。

结果成功克隆出序列正确的PIN1基因,并正确构建PIN1基因的酵母双杂交表达载体。

PIN1蛋白对酵母菌AH109无细胞毒性,对报告基因亦无自激活作用。

结论可以利用酵母双杂交系统来研究“诱饵”PIN1相互作用的蛋白。

[关键词]: 基因；克隆；肽基脯氨酰顺反异构酶，PIN1；酵母双杂交中图法分类号：Q782 文献标识码：AExpression and construction of yeast expression plasmid containing human PIN1 gene in yeasttwo-hybrid systemMENG Xiang-gui1, HUANG Y i2 , YANG Mei-hua3 , LIU Li-jie11Health Screening Center，Xinqiao Hospital, Third Military Medical University，Chongqing 400037，China;2Department of Biochemistry and Molecular，Chongqing Biochemical and Pharmacological Key Laboratory, Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China，3 Department of Neurosurgery，Xinqiao Hospital, Third Military Medical University，Chongqing 400037，China.[Abstract]AIM: To construct yeast expression vector containing human PIN1 gene in orderto screen its interaction proteins in yeast two-hybrid . Methods Human PIN1 gene was amplified byRT-PCR from human gastric cancer tissue and inserted into pMD18-T by blunt-blunt ——————————作者简介：孟祥贵, 男，教授，主任医师，硕士生导师，Tel：（023）68755674，Email：yihuang828@ 通讯作者：黄轶, 男，讲师，Tel：（023）68485398，Email：yihuang828@ ligation. After verified by sequencing, the bait pGBKT7-PIN1 and pGADT7-PIN1 were constructed with pMD18-T- PIN1 as template.PIN1 bait plasmid was subsequently transformedinto yeast cell AH109, and its toxicity to AH109 and transcriptional activatition to reporter gene were tested with yeast two-hybrid system.. Results: Human PIN1 gene was abtained successfully.Sequence analysis revealed that PIN1 gene were in-frame inserted into pGBKT7 and pGADT7 vectors.Its expression product showed to be nontoxic to AH109 and did not activate the reporter genes. Conclusion The plasmidpGBKT7-PIN1 can be applied as a bait to trap the interaction protein from cDNA library by using yeasttwo-hybrid.[Keywords]：gene；cloning；PIN1；peptidyl-prolyl cis-trans isomerase; yeast two-hybrid PIN1基因（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting 1 ，PIN1),及Pinl蛋白质属多肽脯氨酰基顺反同分异构酶(Peptdyl-prolyl cis/trans isomerase，PPIase，)家族Pinl型亚家族,目前推测磷酸化特异性的肽基脯氨酰异构可能作为一种计时机制[1]，它允许细胞以种高效而精确的方式打开或关闭某些磷蛋白的功能。

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

PnsICE1基因酵母双杂交诱饵载体构建及转录自激活检测作者：王艳敏来源：《现代农业科技》2015年第13期摘要为了更好地研究与PnsICE1基因互作的蛋白，利用PCR方法扩增含有pGBKT7载体同源序列的PnsICE1基因片段，构建酵母双杂交载体。

测序结果表明，构建的目标基因序列正确。

将诱饵载体质粒转化酵母菌株Y2H感受态细胞，PnsICE1转化菌在SD/-Trp营养缺陷型培养基中正常生长，在SD/-Trp/X-a-Gal筛选培养基上长出蓝色的酵母单菌落，说明PnsICE1转录因子具有转录自激活活性。

关键词 PnsICE1；诱饵载体；转录自激活；测序中图分类号 Q943.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）13-0186-02Construction of Yeast Two-Hybrid Bait Vector of PnsICE1 and Testing of Autonomous Transcriptional ActivationWANG Yan-min 1，2（1 Forestry Science Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin Heilongjiang 150081； 2 Key Laboratory of Fast-Growing TreeCultivating of Heilongjiang Province）Abstract In order to screen the PnsICE1 interacted proteins，the CDS sequence of PnsICE1 contains pGBKT7 vector homologous sequences was amplified using PCR and inserted into pGBKT7 vector to construct the bait vector for yeast two-hybrid（Y2H）system. Sequencing result showed that the PnsICE1 sequence was inserted into pGBKT7 vector in correct reading frame. Furthermore，the bait vector was transformed into Y2H yeast strain to test the autoactivation. The transformed yeast grew very well on SD/-Trp plate，in the SD/-Trp/X-a-Gal screening yeast，grown on the medium blue single colony，PnsICE1 transcription factor has the transcriptional activation activity.Key words PnsICE1；bait vector；autoactivation；sequencingICE1（inducer of CBF expression1）是编码一个类似转录激活基因（MYC）的bHLH转录因子，在常温下钝化，在低温条件下，能够与CBF3启动子中的MYC作用元件特异性结合，从而诱导CBF3的表达，CBF3进一步结合到其下游目的基因启动子的DRE序列，诱导下游一系列冷诱导基因的表达，继而提高转基因植株的抗寒性[1-3]。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及有效性验证Construction and Confirmation availability of a Bait Vector Containing Streptococcus Equi Ssp.Zooepidemicus M-like Protein Gene in Yeast Two- hybr id System张言召李明盐城生物工程高等职业技术学校江苏盐城 224051摘要：根据已发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus) ATCC35246株的类M蛋白基因序列，设计和合成一对引物，并以ATCC35246株的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增出去掉信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至酵母双杂交系统的表达质粒pGBKT7中，构建诱饵质粒。

重组质粒通过酶切鉴定和测序后转化入酵母菌株Y2HGold进行表达，融合蛋白经自激活、毒性及Western blot检测，结果显示，构建的诱饵蛋白满足酵母双杂交系统的要求。

关键词：马链球菌兽疫亚种；类M蛋白；酵母双杂交；诱饵载体；构建马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus)为兰氏分群中的C群链球菌，与马链球菌马亚种(Streptococcus equi ssp. equi)和马链球菌类马亚种(Streptococcus equi ssp. equisimilis)同属于马链球菌。

该菌没有宿主专嗜性，容易发生变异，来源不同的菌株抗原性有可能不同。

一般情况下，该菌存在于宿主动物的扁桃体以及上呼吸道粘膜表面，为一种粘膜表面的机会共栖菌[1,2]。

该菌可通过消化道、外伤、手术、注射疫苗或治疗等途径感染多种动物，并引发多种动物的败血症、脑膜炎、心内膜炎、乳房炎、关节炎等疫病[3-5]。

人与发病动物密切接触或食用被该菌污染的食物后，亦可引发该菌感染[6-8]。

酵母双杂交技术筛选与STING蛋白相互作用的蛋白刘晶莹;李胜龙;宋佳;富丹【摘要】目的应用酵母双杂交技术筛选出与干扰素刺激因子(stimulator of IFN genes,STING)相作用的分子,为深入研究STING蛋白的分子水平的功能奠定基础.方法利用基因克隆的方法构建酵母双杂交质粒pGBKT7-STING.应用酵母杂交技术从人胚肾cDNA库中筛选出与STING蛋白相互作用的蛋白,并在酵母中从新验证其相互作用.结果应用酵母双杂交系统筛选出与STING蛋白相作用的19个候选分子,成功构建pGBKT7-STING质粒,且可以在酵母中表达.结论应用酵母双杂交技术可筛选出与STING蛋白相互作用蛋白.【期刊名称】《牡丹江医学院学报》【年(卷),期】2019(040)003【总页数】4页(P26-28,39)【关键词】STING;酵母双杂交;蛋白互作【作者】刘晶莹;李胜龙;宋佳;富丹【作者单位】牡丹江医学院第二附属医院药剂科;牡丹江医学院第二附属医院药剂科;牡丹江医学院第二附属医院药剂科;牡丹江医学院影像学院,黑龙江牡丹江157011【正文语种】中文【中图分类】R346STING蛋白又称为跨膜蛋白TMEM173、MITA或者MPYS，主要表达于树突状细胞，巨噬细胞，内皮细胞[1-3]。

STING蛋白是2008年发现的参与抗病原微生物固有免疫反应中的重要蛋白之一[4]，是胞质 DNA感受通路下游的一个关键接头蛋白，它在异常DNA和先天免疫反应的感知中发挥重要作用[5]。

固有免疫反应是抵抗病原微生物袭击的第一道防线，它在适应性免疫激活过程中也起着重要作用[6]。

病原微生物在侵入的过程中会产生大量病原体相关的分子模式，通过识别一类模式受体去识别病原生物表达的相关模式分子的结构，进一步诱导I型干扰素和炎性细胞因子的表达，抵抗感染过程并发挥抗病毒作用[7]。

人体中STING蛋白由398个氨基酸残基组成，未活化的STING蛋白以同源二聚体的形式存在，N端位于内质网，C端位于胞浆区。

新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定胡湘云;高小龙;付向晶;王燕平;刘丹丹;常旭东;刘蓬;杜恩岐;王兴龙【摘要】[目的]应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础.[方法]合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用.[结果]成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力.[结论]成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(044)007【总页数】5页(P45-49)【关键词】新城疫病毒;HN蛋白;酵母双杂交系统;诱饵载体【作者】胡湘云;高小龙;付向晶;王燕平;刘丹丹;常旭东;刘蓬;杜恩岐;王兴龙【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S852.65新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性、致死性传染病，在世界范围内广泛流行，是危害养禽业的主要传染病之一[1]。

酵母双杂交实验操作及心得体会摘要:酵母双杂交系统对于研究蛋白与蛋白之间的相互作用虽然具有筛选量大、效率高及应用广泛等优点，但有它自身的缺陷。

酵母培养的周期与大肠杆菌相比较长，酵母转化的过程较繁复，耗时较长，而且存在假阳性较多的问题，阳性克隆工作量太大，验证工作繁重。

在此项目中酵母双杂交实验最关键的步骤是酵母培养时间的掌控。

1.构建CaM诱饵质粒①PCR 扩增CaM基因的开放阅读框，正向和反向引物分别加接酶切位点。

②扩增得到的CaM插入t载体( T–CaM) 。

③T–CaM和pGBKT7 质粒分别双酶切。

④胶回收目的DNA。

⑤将CaM连入pGBKT7，构建成表达载体pGBKT-CaM，转化大肠杆菌DH5α。

⑥因pGBKT7含Kan+抗性基因，在Kan+抗性平板上筛选阳性克隆。

⑦测序验证CaM与gal4 DNA 结合功能区融合，插入序列读框正确、无碱基突变。

2.pGBKT7 – CaM转化酵母菌Y2HGold将pGBKT7- CaM采用PEG/LiAc法转化酵母菌Y2HGold，涂布于SD – Trp固体培养基上，30° C 3-5天，菌落长出。

进行CaM自激活鉴定及毒性测定。

3.龙须菜高温胁迫表达cDNA文库①设定温度梯度(26-35°C)和时间梯度(12-72 h)，对龙须菜进行高温胁迫。

②提取龙须菜总RNA(RNA提取按照Qiagen试剂盒说明书进行，RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)。

③应用SMART技术构建龙须菜高温胁迫表达cDNA文库，3’和5’引物分别加接酶切位点。

4.文库筛选载体构建将龙须菜高温胁迫表达文库cDNA双酶切，连入同样双酶切的AD 克隆质粒pGADT7中，用PEG/LiAc 转化法将cDNA 文库质粒转化到酵母菌Y187中，SD – Leu平板上30 ℃培养3～5 天，菌落长出。

5.酵母交配转化及阳性克隆的筛选将酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM进行酵母交配转化(Yeast Mating)，SD–Trp/-Leu/Aba/X-α-gal平板上30 ℃培养3～5 天，筛选蓝色菌落，再将阳性克隆在SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上进行验证。

收稿日期：２００７－１１－２４录用日期：２００７－１２－３０基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．５０７７８１７０）；国家高技术研究发展计划（８６３）项目（Ｎｏ．２００７ＡＡ０６Ｚ４１４）作者简介：李剑（１９８０—），女，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎ＿ｌｉ＠ｍａｉｌｓ．ｇｕｃａｓ．ａｃ．ｃｎ；＊通讯作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ）：Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｍｅｉ＠ｒｃｅｅｓ．ａｃ．ｃｎ酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母李剑，马梅＊，饶凯锋，王子健中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京１０００８５摘要：应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母，用以检测类／抗雌激素化合物和环境样品的类／抗雌激素活性．采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）法扩增人雌激素受体（ｈＥＲ）基因，构建诱饵质粒ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ；分别提取并纯化两种含有ＥＲ共激活因子基因的靶质粒ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１和ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１；诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Ｙ１８７，于营养缺陷型培养基（ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ）上筛选阳性菌落，分别构建两种ＥＲ双杂交酵母ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１．考察双杂交酵母与不同激素：１７β－雌二醇（Ｅ２）、二氢睾酮（ＤＨＴ）、孕酮（ＰＧ）以及三碘甲状腺原氨酸（Ｔ３）的结合情况，并考察了雌激素受体拮抗剂４－羟基他莫昔芬（４－ＯＨＴ）与酵母的相互作用．结果表明：ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１酵母均能够专一性的和Ｅ２结合，并存在显著的剂量－效应关系，Ｅ２对ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１酵母β－半乳糖苷酶活性诱导的ＥＣ５０值分别为７．３×１０－１１ｍｏｌ・Ｌ－１和１．５×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１，其中ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ＥＲ＋ＳＲＣ１酵母细胞．４－ＯＨＴ能够抑制Ｅ２诱导ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母细胞产生的酶活性，并存在显著的剂量－效应关系，ＩＣ５０值为１．０×１０－７ｍｏｌ・Ｌ－１．表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类／抗雌激素活性．关键词：酵母双杂交；人雌激素受体；重组基因酵母；类／抗雌激素活性文章编号：１６７３－５８９７（２００８）１－０２１－０６中图分类号：Ｘ５２４文献标识码：ＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｔｈｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＥｓｔｒｏｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ（ｈＥＲ）ＧｅｎｅＹｅａｓｔＵｓｉｎｇＴｗｏ－ＨｙｂｒｉｄＹｅａｓｔＴｅｃｈｎｉｑｕｅＬＩＪｉａｎ，ＭＡＭｅｉ＊，ＲＡＯＫａｉ－ｆｅｎｇ，ＷＡＮＧＺｉ－ｊｉａｎＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＡｑｕａｔｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＥｃｏ－ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８５Ｒｅｃｅｉｖｅｄ２４Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００７ａｃｃｅｐｔｅｄ３０Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｈＥＲ）ｇｅｎｅｙｅａｓｔｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｙｅａｓｔｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＩｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｉｔｈｈＥＲａｎｔ／ａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ，ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ，ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，ｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅＥＲｇｅｎｅ．Ｏｔｈｅｒｔｗｏｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１ｃｏｄｉｎｇｆｏｒＥＲｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＧＲＩＰ１，ａｎｄｐＧＡＤ４２４ＳＲＣ１ｃｏｄｉｎｇｆｏｒＳＲＣ１，ａｎｏｔｈｅｒＥＲｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ．ＴｈｅｙｅａｓｔｃｅｌｌｓＹ１８７ｗｅｒｅｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤａｎｄｐＧＡＤ４２４ＧＲＩＰ１ｏｒｐＧＡＤ４２４ＳＲＣ１，ａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｇｒｏｗｔｈｏｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ｍｅｄｉｕｍ（ｌａｃｋｉｎｇｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｌｅｕｃｉｎｅ）ａｄｄｅｄａｇａｒ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｙｅａｓｔａｎｄＥＲ＋ＳＲＣ１ｙｅａｓｔｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｅｔｅｓｔｅｄｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｏｆｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｙｅａｓｔｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１７β－ｅｓｔｒｏｇｅｎ（Ｅ２），ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＴ），ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ（ＰＧ），ａｎｄ３，３′，５－ｔｒｉｉｏｄｏ－Ｌ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（Ｔ３）．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｙｅａｓｔｗｉｔｈｋｎｏｗｎＥＲａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，４－ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ（４－ＯＨＴ），ｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｙｅａｓｔａｎｄＥＲ＋ＳＲＣ１ｙｅａｓｔｈａｄｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇｗｉｔｈＥ２ａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｅｎｅｙｅａｓｔｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥ２ｗａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｉｎａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｄｍａｎｎｅｒ．ＴｈｅＥＣ５０ｖａｌｕｅｓｏｆＥ２ｆｏｒＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｙｅａｓｔａｎｄＥＲ＋ＳＲＣ１ｙｅａｓｔｗｅｒｅ７．３×１０－１１ｍｏｌ・Ｌ－１ａｎｄ１．５×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥＲ＋ＳＲＣ１．Ｗｅａｌｓｏｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈａｔ４－ＯＨＴｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥ２ｉｎａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ，ｔｅｓｔｅｄｂｙＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｙｅａｓｔａｓｓａｙ．ＡｎｄｔｈｅＩＣ５０ｖａｌｕｅｗａｓ１．０×１０－７ｍｏｌ・Ｌ－１．ＡｌｌｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｐｐｏｒｔｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈＥＲｇｅｎｅｙｅａｓｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｓｃｒｅｅｎｃｈｅｍｉｃａｌｓａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈａｎｔ／ａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｙｅａｓｔ；ｈｕｍａｎｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｅｎｅｙｅａｓｔ；ＥＲａｎｔ／ａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ第３卷第１期２００８年２月生态毒理学报ＡｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙＶｏｌ．３，Ｎｏ．１Ｆｅｂ．２００８生态毒理学报第３卷１引言（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）经典的激素－受体理论认为：天然雌激素主要通过与雌激素受体中的配体结合域（ＬＢＤ）结合形成激素－受体复合物，再通过受体中的ＤＮＡ结合域（ＤＢＤ）识别并结合雌激素效应元件（ＥＲＥ），从而转录激活靶基因，发挥雌激素效应（楼丽广等，１９９７）．根据此分子作用机制已建立了环境雌激素酵母测评体系（何世华等，２００２）和重组受体基因报道基因酵母等方法（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅｅｔａｌ．，１９９６），用于检测环境内分泌干扰物通过雌激素受体介导而产生的类雌激素作用．２０世纪９０年代通过对天然雌激素受体作用机理的研究又发现了一系列雌激素受体的共激活因子（Ｃｏａｃｔｏｒ）（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．，１９９６；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆｅｔａｌ．，１９９５），它们不直接与ＤＮＡ结合，而是通过直接或间接与受体相互作用，促进基因转录．在此基础上形成的新的受体作用理论认为，天然雌激素与受体的ＬＢＤ结合后形成复合物并发生构象的改变，进一步结合协同激活因子，促进转录．为考察人雌激素受体ＬＢＤ表达蛋白和受体协同激活因子蛋白的相互作用，本研究基于该机制发展酵母双杂交技术，构建双杂交重组雌激素受体基因酵母．酵母双杂交技术的基本原理是利用ＧＡＬ４蛋白的ＤＮＡ结合域序列（ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ）和ＥＲ－ＬＢＤ基因结合，构建出ＢＤ－ＥＲ－ＬＢＤ融合表达载体；同时将ＧＡＬ４蛋白转录激活结构域（ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＡＤ）和受体协同激活因子蛋白结合，构建ＡＤ－受体协同激活因子融合表达载体．将这两个表达载体共转化至酵母细胞内表达．当没有雌激素或环境雌激素存在时，ＥＲ－ＬＢＤ和受体协同激活因子蛋白无相互作用，导致ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ与ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＡＤ蛋白在空间上不能接近，报告基因不表达；当雌激素或环境雌激素存在时，该类化合物首先与雌激素受体ＬＢＤ蛋白结合形成复合物，该复合物进而结合受体协同激活因子蛋白，使得ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ与ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＡＤ在空间上接近，启动报告基因表达，通过测定报道基因ＬａｃＺ表达产物β－半乳糖苷酶活性，表征化合物的类雌激素活性．因此，基于新的受体作用理论建立的双杂交酵母系统更加接近哺乳动物内分泌系统的真实作用情况．核受体协同激活因子ＧＲＩＰ１和ＳＲＣ１是目前研究得比较多的协同激活因子，研究发现人的雌激素受体与ＧＲＩＰ１和ＳＲＣ１可相互作用，因此，本工作同时构建了ＥＲ－ＧＲＩＰ１和ＥＲ－ＳＲＣ１两株双杂交酵母，筛选与雌激素存在较强作用的菌株，建立环境雌激素双杂交酵母筛选体系．环境内分泌干扰物在接近或低于无可见不良效应浓度水平（ＮＯＡＥＬ）时仍可诱发生物效应，是当前风险评价中的一个重大问题（卫立等，２００７），因此，建立环境内分泌干扰物快速筛选方法体系的工作，已经刻不容缓．２材料与方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ）２．１主要实验材料与试剂含有人ＥＲαＬＢＤ（ａａ２８２－５９５）的ｐＡＳＶ３质粒，由英国Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ大学Ｈｅｅｒｙ教授惠赠；ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１（ａａ５－１４６２）质粒和ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１（ａａ３１３－９７７）质粒由美国加州大学Ｓｔａｌｌｃｕｐ教授惠赠．感受态大肠杆菌ＤＨ５α、质粒小提试剂盒、凝胶回收质粒试剂盒、ｐＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ载体、Ｘ－ｇａｌ溶液、１ｋｂＤＮＡｍａｒｋｅｒ、ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅣ、氨苄青霉素、卡那霉素均购自Ｔｉａｎｇｅｎ生物试剂公司．ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ、Ｔａｑ酶、ＢａｍＨΙ酶和ＥｃｏＲΙ酶购自Ｔａｋａｒａ公司．Ｙ１８７酵母菌株（ＭＡＴα，ｕｒａ３－５２，ｈｉｓ３－２００，ａｄｅ２－１０１，ｔｒｐ１－９０１，ｌｅｕ２－３１１２，ｇａｌ４△，ｍｅｔ－，ｇａｌ８０△，ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１ＵＡＳ－ＧＡＬ１ＴＡＴＡ－ｌａｃＺ）、ｐＧＢＫＴ７－ＢＤ克隆载体及测序引物，ｐＣＬ１质粒、ｐＧＢＫＴ７－５３质粒、ｐＧＡＤＴ７－Ｔ质粒、ｐＧＡＤＴ７－Ｌａｍ质粒、酵母ＹＰＤＡ培养基、ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ培养基、ＴＥ溶液、１×ＴＥ／１×ＬｉＡｃ溶液、ＰＥＧ／ＬｉＡｃ溶液均购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司．ＤＭＳＯ、半硫酸腺苷购于Ｓｉｇｍａ公司．ＤＮＡ序列测定由北京诺赛基因组研究中心完成．２．２ＰＣＲ扩增ＥＲＬＢＤ与序列分析在上下游引物的５’－端分别引入ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ单一酶切位点，设计新基因序列特异性的引物，上游引物Ｐ１：５’－ＴＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡ－３’；下游引物Ｐ２：５’－ＴＡＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧ－３’以含有ＥＲＬＢＤ（ａａ２８２－５９５）的ｐＡＳＶ３质粒作为模板进行ＰＣＲ扩增．ＰＣＲ反应条件为：９４℃变性５ｍｉｎ，然后开始ＰＣＲ循环，９４℃３０ｓ，６１℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，共３０个循环，然后７２℃变性１０ｍｉｎ，反应体积为５０μＬ，扩增产物通过０．８％琼脂糖凝胶电泳分析．"""""""""" """２２李剑等：酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母第１期２．３诱饵质粒的构建将ＥＲＬＢＤ的ＰＣＲ产物用Ｔ４连接酶连接于Ｔ－载体，反应体系为：ＰＣＲ产物０．６ｐｍｏｌ，Ｔ－载体ＤＮＡ０．０６ｐｍｏｌ，１０×连接缓冲液５μＬ，Ｔ４ＤＮＡ连接酶２μＬ（７００Ｕ），反应体积为５０μＬ，１６℃反应过夜．将１０μＬ连接产物转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提取Ｔ－ＥＲＬＢＤ质粒并纯化．采用ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ双酶切Ｔ－ＥＲＬＢＤ质粒验证目的ＥＲＬＢＤ基因片段，并对目的基因片段进行切胶回收，连接到经相同双酶切处理切胶回收的ｐＧＢＫＴ７载体上构成诱饵质粒ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ．反应体系与Ｔ－载体的连接类似．将１０μＬ连接产物转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取并纯化质粒ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ．诱饵质粒产物采用ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ双酶切，０．８％琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时进行序列测定，测序引物为：５’－ＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＣＴＡＡＧＡＧＴＣ－３’．２．４靶质粒的提取纯化与鉴定１０μＬ靶质粒ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１或ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，同时添加蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，提取质粒并纯化．０．８％琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时进行序列测定，测序引物为ｐＧＡＤ４２４通用引物．２．５酵母双杂交实验挑取新鲜培养的酵母Ｙ１８７菌株单菌落，在５００ｍＬＹＰＤＡ培养基中３０℃振荡培养到对数生长期后（６００ｎｍ处的吸光度值为０．４￣０．６），１０００×ｇ离心５ｍｉｎ沉淀细胞，悬浮于无菌的ＴＥ溶液中，重复离心操作，将酵母细胞沉淀溶于２．５ｍＬ新鲜配制的无菌的１×ＴＥ／１×ＬｉＡｃ溶液中．将ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒和ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１质粒同时转染至酵母细胞Ｙ１８７，构建ＥＲ－ＧＲＩＰ１双杂交酵母，反应体系为：０．１ｍｇ载体ＤＮＡ，０．１μｇｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒，０．１μｇｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１质粒，０．１ｍＬ的酵母细胞悬液，０．６ｍＬ无菌的ＰＥＧ／ＬｉＡｃ溶液．２００ｒｐｍ、３０℃下孵育３０ｍｉｎ，加入７０μＬＤＭＳＯ，４２℃水浴热击１５ｍｉｎ，冰浴静置１￣２ｍｉｎ，１４，０００ｒｐｍ室温下细胞离心５ｓ，０．５ｍＬ无菌ＴＥ缓冲液重悬细胞．涂布在ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ营养缺陷型的选择性固体培养基上３０℃培养２￣４ｄ．相同的方法将ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒和ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１质粒同时转染至酵母细胞Ｙ１８７构建ＥＲ－ＳＲＣ１双杂交酵母．２．６菌落转移滤膜分析能够在选择性培养基上生长的克隆，采用菌落转移滤膜分析的方法进一步剔除假阳性结果．具体操作如下：灭菌的干燥滤膜１＃（Ｗｈａｔｍａｎ，英国）覆盖生长有双杂交酵母菌落（直径大于２ｍｍ）的平板上，将菌落转移到滤膜，液氮反复冻融；另取滤膜２＃浸没到含Ｘ－ｇａｌ和雌二醇的缓冲溶液中润湿，将含有菌落的滤膜１＃覆盖到润湿的滤膜２＃上，３０℃孵育直到克隆出现明显的蓝色，并对显色的克隆计数，计算转化率．选择具有蓝色的阳性克隆到ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ选择性培养基上继续培养至菌落直径大于２ｍｍ，挑取菌落接种于ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ液体培养基中，３０℃、２００ｒｐｍ振荡培养过夜．第２天部分细胞添加１５％的无菌甘油后－８０℃冷冻保存，另一部分与配体结合后检测β－半乳糖苷酶的活性．转化率（ｃｆｕ・μｇ－１）＝克隆数（ｃｆｕ）×总重悬体积（μＬ）涂布体积（μＬ）×稀释因子×质粒ＤＮＡ使用量（μｇ）（１）２．７构建双杂交酵母质量控制为了对双质粒同时转染酵母细胞的流程进行控制，并对合成的质粒进行鉴定，考察质粒转染酵母细胞的效率，添加平行的质控实验．阳性对照实验设置两组：第一组，采用ｐＣＬ１标准质粒（编码野生型的ＧＡＬ４蛋白，能够诱导β－半乳糖苷酶活性）转染酵母细胞，并计算转化效率．第二组采用同时转染ｐＧＢＫＴ７－５３标准质粒（编码ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ蛋白）和ｐＧＡＤＴ７－Ｔ标准质粒（编码ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＡＤ蛋白），计算转化效率；阴性对照采用ｐＧＡＤＴ７－Ｌａｍ标准质粒（编码ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ和人体ｌａｍｉｎＣ杂合蛋白）和ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１质粒或ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１质粒同时转染酵母细胞，计算转化率．２．８β－半乳糖苷酶活性的检测β－半乳糖苷酶活性的检测方法参照本实验室已经报道的方法（李剑等，２００６）．β－半乳糖苷酶相对酶活性Ｕ的计算公式如下：Ｕ＝（ＡＳ－ＡＢ）／ｔ・Ｖ・Ｄ・ＯＤＳ（２）式中，Ｕ为β－半乳糖苷酶活性；ｔ为反应时间（ｍｉｎ）；２３生态毒理学报第３卷Ｖ为测试体积（ｍＬ）；Ｄ为稀释因子；ＯＤＳ为测试样品５９５ｎｍ处的吸光度值；ＡＳ为测试样品在４２０ｎｍ处的吸光度值ＯＤ４２０；ＡＢ为空白对照在４２０ｎｍ处的吸光度．３结果与分析（Ｒｅｓｕｌｔｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ）３．１ＥＲＬＢＤ基因片段的ＰＣＲ产物电泳分析取ＰＣＲ产物１０μＬ于０．８％琼脂糖凝胶电泳，结果显示，在分子量１０００ｂｐ左右出现一条带，与ＥＲＬＢＤ（ａａ２８３－５９５）基因（片段长９６３ｂｐ）大小一致，如图１．３．２ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ诱饵质粒的构建与鉴定ＰＣＲ产物通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接到Ｔ载体上，构建Ｔ－ＥＲＬＢＤ质粒，经ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ双酶切鉴定（图２ａ），为约３０００ｂｐ的载体片段以及约１０００ｂｐ的插入片段，表明质粒构建正确．将ｐＧＢＫＴ７和Ｔ－ＥＲＬＢＤ质粒用ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ双酶切，酶切产物电泳后切胶回收，ｐＧＢＫＴ７和插入片段的回收产物采用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，构建ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ诱饵质粒．ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒经酶切鉴定正确（图２ｂ），可见约７０００ｂｐ的载体片段以及约１０００ｂｐ的插入片段，同时对质粒的测序结果进一步证实上述质粒正确克隆了ＥＲＬＢＤ基因片段，插入方向及阅读框正确．３．３靶质粒的提取纯化与鉴定１０μＬ靶质粒ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１或ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１的ＤＮＡ纯化产物，于０．８％琼脂糖凝胶电泳．结果显示，在分子量约１０ｋｂ处各有一条带，与ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１和ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１报道的ＤＮＡ大小一致（Ｄｉｎｇｅｔａｌ．，１９９８），如图３．同时对质粒的测序结果进一步证实上述质粒基因片段，插入方向及阅读框正确．３．４酵母双杂交实验ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒分别和ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１质粒以及ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１质粒同时转化感受态酵母细胞Ｙ１８７，重悬细胞，将转化后的酵母细胞分别涂布到５块含有ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ固体培养基的平板上，计算质粒的平均转化率，如表１所示．结果表明：双杂交雌激素受体酵母以及阳性对照样品的转化率较高，均大于３．５×１０４ｃｆｕ・μｇ－１；阴性对照样品转化率为０，即选择性培养基上无克隆生长；阳性对照和阴性对照样品间存在显著性差异（ｐ＜０．０１），表明整个转化过程得到较好的控制．２４李剑等：酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母第１期表１不同质粒同时转化酵母细胞Ｙ１８７的转化率Ｔａｂｌｅ１Ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｆｏｒｔｈｅｙｅａｓｔｃｅｌｌｓ３．５双杂交雌激素受体基因酵母剂量－效应关系的建立将ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１双杂交酵母细胞暴露到不同浓度的１７β－雌二醇（Ｅ２，Ｓｉｇｍａ，美国）溶液中，检测诱导产生的酶活性，建立了Ｅ２对酶活性诱导的剂量－效应关系曲线，如图４所示．结果表明，Ｅ２对ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１双杂交酵母酶活性诱导均存在明显的剂量－效应关系，最大效应浓度分别为：２×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１和５×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１；ＥＣ５０值分别为７．３×１０－１１ｍｏｌ・Ｌ－１和１．５×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１；与国际上报道的Ｅ２在重组酵母系统中检测的ＥＣ５０结果类似（Ｒｅｈｍａｎｎｅｔａｌ．，１９９９；Ｇａｉｄｏｅｔａｌ．，１９９７），表明本实验建立的的双杂交酵母方法与报道的其它方法相比对Ｅ２具有较高的敏感度，初步表明双杂交雌激素受体基因酵母测评体系是成功的．比较两株酵母发现，ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母株具有较大的酶活性诱导值以及较小的ＥＣ５０值，表明Ｅ２依赖的ＥＲ与受体共激活因子ＧＲＩＰ１的结合能力较强，因此ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母株对Ｅ２具有更高的灵敏度．３．６双杂交雌激素受体酵母专一性的检测将双杂交雌激素受体基因酵母，暴露到其他３种人体激素：二氢睾酮（ＤＨＴ，Ｓｉｇｍａ，美国）、孕酮（ＰＧ，ＭＰｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，德国）和三碘甲状腺原氨酸（Ｔ３，Ｓｉｇｍａ，美国）中，通过检测其β－半乳糖苷酶活性，考察不同激素与受体的结合情况．结果表示为ＤＨＴ、ＰＧ和Ｔ３诱导酶活性与Ｅ２（２×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１）诱导酶活性的相对百分比，如图５所示．在１０－１１￣１０－６ｍｏｌ・Ｌ－１浓度范围内，ＤＨＴ、ＰＧ和Ｔ３对两株雌激素受体酵母的β－半乳糖苷酶活性几乎没有诱导；而Ｅ２对酶活性存在明显诱导，与ＤＨＴ、ＰＧ和Ｔ３相比存在显著性差异（ｐ＜０．０１）．因此，Ｅ２对ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１双杂交酵母存在专一性诱导．３．７４－羟基他莫昔芬抑制１７β－雌二醇诱导双杂交雌激素受体基因酵母酶活性的剂量－效应关系他莫昔芬或４－羟基他莫昔芬（４－ＯＨＴ，Ｓｉｇｍａ，美国）是常用的雌激素受体拮抗剂，在研究化合物或环境样品的抗雌激素效应时，常被选为标准拮抗剂．因此，本实验选取４－ＯＨＴ，考察其对Ｅ２诱导雌激素受体酵母阳性对照阴性对照双杂交酵母ＥＲ＋ＧＲＩＰ１ＥＲ＋ＳＲＣ１ｐＣＬ１ｐＧＢＫＴ７－５３＋ｐＧＡＤＴ７－ＴｐＧＡＤＴ７－Ｌａｍ＋ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１ｐＧＡＤＴ７－Ｌａｍ＋ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１转化率（１０４ｃｆｕ・μｇ－１）３．５±０．３５±０．５５±０．７４．５±０．３０．０±０．００．０±０．０２５生态毒理学报第３卷双杂交雌激素受体基因酵母酶活性的抑制效应．选取具有较高的酶活性诱导效应的ＥＲ＋ＧＲＩＰ１双杂交酵母细胞，将不同浓度的４－ＯＨＴ分别与Ｅ２（２×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１）共同孵育，检测诱导酶活性．结果表示为与Ｅ２（２×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１）单独诱导酶活性的相对百分比，如图６所示．结果表明，４－ＯＨＴ对Ｅ２诱导的酶活性存在明显的抑制效应；根据抑制的剂量－效应关系，４－ＯＨＴ的半数抑制效应浓度（ＩＣ５０）值为１．０×１０－７ｍｏｌ・Ｌ－１．Ｚｈｏｕ等（１９９８）报道４－ＯＨＴ对Ｅ２抑制的ＩＣ５０为１．４４×１０－７ｍｏｌ・Ｌ－１，与本试验的结果类似．以上研究结果表明，所构建的ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１双杂交酵母细胞均能选择性地检测雌激素物质，酶活性诱导均存在明显的剂量－效应关系，ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母株对Ｅ２具有更高的灵敏度，初步结果显示上述方法能够同时应用于类／抗雌激素效应物质的筛选．通讯作者简介：马梅（１９６７—），女，博士，中科院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室副研究员，硕士生导师，主要研究方向为水生态毒理学，已发表文章７０余篇．ＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓＤｉｎｇＸＦ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＣＭ，ＭａＨ，ＨｏｎｇＨ，ＵｈｔＲＭ，ＫｕｓｈｎｅｒＰＪ，ＳｔａｌｌｃｕｐＭＲ．１９９８．Ｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１（ＧＲＩＰ１）ａｎｄｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ１（ＳＲＣ－１）：Ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｏｔｉｆｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２（２）：３０２－３１３ＧａｉｄｏＫＷ，ＬｅｏｎａｒｄＬＳ，ＬｏｖｅｌｌＳ，ＧｏｕｌｄＪＣ，Ｂａｂａ!Ｄ，ＰｏｒｔｉｅｒＣＪ，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌＤＰ．１９９７．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｓｗｉｔｈｅｎｄｏｃｒｉｎｅｍｏｄｕｌａｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａｙｅａｓｔ－ｂａｓｅｄｓｔｅｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｓｓａｙ［Ｊ］．ＴｏｘｉｃｏｌＡｐｐｌＰｈａｒｍａｃｏｌ，１４３：２０５－２１２ＨｅＳＨ，ＬｉａｎｇＺＨ，ＺｈａｎＷ，ＪｉａＬＺ，ＣｈａｏＦＨ．２００２．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｙｅａｓｔａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍｆｏｒｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｅｓｔｒｏｇｅｎｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＨｅａｌｔｈ，１９（１）：５７－５９（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）ＨｏｎｇＨ，ＫｏｈｌｉＫ，ＴｒｉｖｅｄｉＡ，ＪｏｈｎｓｏｎＤＬ，ＳｔａｌｌｃｕｐＭＲ．１９９６．ＧＲＩＰ１，ａｎｏｖｅｌｍｏｕｓｅｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｓｅｒｖｅｓａｓａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｙｅａｓｔｆｏｒｔｈｅｈｏｒｍｏｎｅｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓｏｆｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９３：４９４８－４９５２ＬｉＪ，ＣｕｉＱ，ＭａＭ，ＲａｏＫＦ，ＷａｎｇＺＪ．２００６．ＡｍｅｔａｂｏｌｉｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｎｄｉｒｅｃｔｅｓｔｒｏｇｅｎｐｏｌｌｕｔａｎｔｓｂａｓｅｄｏｎＨ４ＩＩＥｃｅｌｌｌｉｎｅ［Ｊ］．ＡｃｔａＳｃｉｅｎｔｉａｅＣｉｒｃｕｍｓｔａｎｔｉａｅ，２６（８）：１３２０－１３２５（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）ＭａｎｇｅｌｓｄｏｒｆＤＪ，ＴｈｕｍｍｅｌＣ，ＢｅａｔｏＭ，ＨｅｒｒｌｉｃｈＰ，ＳｃｈüｔｚＧ，ＵｍｅｓｏｎｏＫ，ＢｌｕｍｂｅｒｇＢ，ＫａｓｔｎｅｒＰ，ＭａｒｋＭ，ＣｈａｍｂｏｎＰ，ＥｖａｎｓＲＭ．１９９５．Ｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｔｈｅｓｅｃｏｎｄｄｅｃａｄｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，８３：８３５－８３９ＲｅｈｍａｎｎＫ，ＳｃｈｒａｍｍＫＷ，ＫｅｔｔｒｕｐＡＡ．１９９９．Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆａｙｅａｓｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓｃｒｅｅｎｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｌｉｋｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，３８：３３０３－３３１２ＲｏｕｔｌｅｄｇｅＥＪ，ＳｕｍｐｔｅｒＪＰ．１９９６．Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓａｎｄｓｏｍｅｏｆｔｈｅｉｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓａｓｓｅｓｓｅｄｕｓｉｎｇａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｙｅａｓｔｓｃｒｅｅｎ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＴｏｘｉｃｏｌＣｈｅｍ，１５：２４１－２４８ＷｅｉＬ，ＺｈａｎｇＨＣ，ＺｈａｎｇＡＱ，ＹｉｎＤＱ．２００７．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｈｅｌｏｗ－ｄｏｓｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇｃｈｅｍｉｃａｌｓ［Ｊ］．ＡｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２（１）：２５－３１（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）ＺｈｏｕＧＣ，ＣｕｍｍｉｎｇｓＲ，ＬｉＹ，ＭｉｔｒａＳ，ＷｉｌｋｉｎｓｏｎＨＡ，ＥｌｂｒｅｃｈｔＡ，ＨｅｒｍｅｓＪＤ，ＳｃｈａｅｆｆｅｒＪＭ，ＳｍｉｔｈＲＧ，ＭｏｌｌｅｒＤＥ．１９９８．Ｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｈａｖｅｄｉｓｔｉｎｃｔａｆｆｉｎｉｔｉｅｓｆｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２（１０）：１５９４－１６０４中文参考文献何世华，梁增辉，战威，贾凌志，晁福寰．２００２．环境雌激素重组酵母测评系统的建立［Ｊ］．环境与健康杂志，１９（１）：５７－５９李剑，崔青，马梅，饶凯锋，王子健．基于Ｈ４ＩＩＥ细胞株测试间接雌激素效应物质的代谢活化方法［Ｊ］．环境科学学报，２００６，２０（８）：１３２０－１３２５楼丽广，胥彬．１９９７．甾体激素作用的分子机制［Ａ］．／／金正均，王永铭，苏定冯．药理学进展［Ｃ］．北京：人民卫生出版社．１１４－１２７卫立，张洪昌，张爱茜，尹大强．２００７．环境内分泌干扰物低剂量－效应研究进展［Ｊ］．生态毒理学报，２（１）：２５－３１◆２６。