酵母双杂交ad自激活验证步骤

酵母双杂实验操作⼿册和注意事项酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作⼿册和注意事项⼀. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建⽴了第⼀个基于酵母的细胞内检测蛋⽩间相互作⽤的遗传系统。

很多真核⽣物的位点特异转录激活因⼦通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。

这两个结构域各具功能，互不影响。

但⼀个完整的激活特定基因表达的激活因⼦必须同时含有这两个结构域,否则⽆法完成激活功能。

不同来源激活因⼦的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋⽩分别与这两个结构域建成融合蛋⽩，并共表达于同⼀个酵母细胞内。

如果两个待测蛋⽩间能发⽣相互作⽤，就会通过待测蛋⽩的桥梁作⽤使AD与BD形成⼀个完整的转录激活因⼦并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋⽩分⼦间是否发⽣了相互作⽤。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋⽩表达载体，被表达的蛋⽩称诱饵蛋⽩(bait)。

(2)与AD融合的蛋⽩表达载体，被其表达的蛋⽩称靶蛋⽩(prey)。

(3)带有⼀个或多个报告基因的宿主菌株。

常⽤的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

⽽菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

根据⽬前通⽤的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。

后者因其BD来源于原核⽣物，在真核⽣物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

⼆.所⽤的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)⼆缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显⾊所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.⽔浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

酵母双杂（共转）酵母双杂交的原理及实验步骤吴健2015.12.25一酵母双杂交的原理在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1的转录。

GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。

将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。

说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。

酵母双杂交系统就是在这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。

由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。

除了将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。

Fig1. 酵母双杂原理图Fig2. 常用两种酵母菌的基因型Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图二酵母双杂交的基本步骤1 酵母感受态的制备配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。

1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种；2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h；3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震荡培养20 h，直到OD 600 =0.3；4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5；5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块；6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块；7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec；8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。

酵母双杂交的原理及实验步骤吴健2015.12.25一酵母双杂交的原理在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1的转录。

GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。

将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。

说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。

酵母双杂交系统就是在这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。

由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。

除了将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。

Fig1. 酵母双杂原理图Fig2. 常用两种酵母菌的基因型Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图二酵母双杂交的基本步骤1 酵母感受态的制备配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。

1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种；2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h；3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震荡培养20 h，直到OD 600 =0.3；4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5；5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块；6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块；7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec；8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。

酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。

酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。

这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。

2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。

3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。

4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。

例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。

总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。

酵母双杂交系统的步骤酵母双杂交法的原理：典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域和转录激活结构域。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

酵母双杂交法的步骤：1. 阳性克隆的筛选2. 用质粒自然分选法筛除只含有AD-文库杂合子的克隆3. 酵母杂合试验确定真阳性克隆4. 阳性克隆的进一步筛选和确证5. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究6. 阳性克隆的筛选7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆9. 阳性克隆的进一步筛选和确证扩展资料：酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。

2、信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。

3、杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。

4、通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。

同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中，有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。

针对实际工作中的这种需要，Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。

这项技术的关键是报道基因URA3的引入。

URA3基因在这里起到了反选择的作用，它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。

2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。

其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。

通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。

获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。

进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。

酵母双杂交系统检测相互作用原理基本流程及注意事项基本原理酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i 。

典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。

而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

酵母双杂交系统的建立与发展是基于对真核生物转录调控起始过程的认识。

真核生物中存在一种上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)，其作用是和激活蛋白结合并大大增加启动子的转录速度，从而在转录水平对靶基因表达进行调控。

真核细胞转录起始需要反式转录激活因子的参与。

很多真核生物的位点特异性转录激活因子是组件式的，通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异性结合结构域(DNA-binding domain, BD)与转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。

这两个结构域即使分开时仍各具功能，互不影响。

但一个完整的某个特定基因的转录激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。

只有将这两部分通过适当的途径在空间上接近才能恢复其激活转录的能力。

酵母双杂交原理及步骤以酵母双杂交原理及步骤为标题，本文将探讨酵母双杂交的原理和步骤。

酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用、信号转导和基因调控等生物学过程。

酵母双杂交是一种基于酵母菌的遗传系统的实验方法，通过检测两个蛋白质是否相互作用，从而揭示它们之间的相互作用关系。

这种方法的核心原理是将两个感兴趣的蛋白质分别与DNA结合域和激活域相连，当这两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域会靠近，从而激活报告基因的表达。

酵母双杂交实验的步骤如下：1. 构建融合基因：首先需要选取两个感兴趣的蛋白质，并将它们的编码序列分别克隆到酵母双杂交载体的DNA结合域和激活域上。

DNA结合域和激活域是两个功能区域，当两个蛋白质相互作用时，这两个功能区域会靠近并激活报告基因的表达。

2. 转化酵母菌：将构建好的酵母双杂交载体导入酵母菌中。

酵母菌是双杂交实验中常用的宿主，因为它具有简单的遗传系统和易于生长的特点。

3. 筛选阳性克隆：将转化后的酵母菌分别接种在缺失报告基因所需的营养物的培养基上。

只有当两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域才能靠近并激活报告基因的表达，从而使酵母菌能够在缺失营养物的培养基上生长。

4. 验证相互作用：通过进一步的实验证实阳性克隆的相互作用。

常用的方法包括酵母菌营养物补充实验、酵母菌生长曲线分析和蛋白质互聚实验等。

酵母双杂交技术的优点在于它能够直接在真核细胞中研究蛋白质相互作用，同时具有灵敏度高、结果可靠、重复性好等特点。

然而，也需要注意到酵母双杂交实验存在一定的局限性，如假阳性和假阴性结果的可能性，以及蛋白质结构和功能的局限性等。

酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，通过构建融合基因、转化酵母菌、筛选阳性克隆和验证相互作用等步骤，可以研究蛋白质相互作用等生物学过程。

在实际应用中，需要综合考虑实验设计、阳性和阴性对照、验证方法等因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。

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酵母双杂交步骤酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。

下面将介绍酵母双杂交的步骤。

第一步：构建酵母双杂交载体酵母双杂交载体是用于表达融合蛋白的质粒。

一般来说，酵母双杂交载体包括两个部分：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。

DBD 和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。

常用的酵母双杂交载体有pGBKT7和pGADT7。

第二步：构建酵母双杂交菌株酵母双杂交菌株是用于表达融合蛋白的酵母菌株。

一般来说，酵母双杂交菌株包括两个部分：DBD和AD。

DBD和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。

常用的酵母双杂交菌株有AH109和Y187。

第三步：酵母双杂交筛选酵母双杂交筛选是用于筛选蛋白相互作用的方法。

一般来说，酵母双杂交筛选包括两个步骤：初筛和确认。

初筛是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp）筛选出具有融合蛋白的酵母菌株。

确认是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）筛选出具有蛋白相互作用的酵母菌株。

第四步：酵母双杂交验证酵母双杂交验证是用于验证蛋白相互作用的方法。

一般来说，酵母双杂交验证包括两个步骤：β-galactosidase检测和Western blot检测。

β-galactosidase检测是通过检测酵母菌株中β-galactosidase的活性来验证蛋白相互作用。

Western blot检测是通过检测融合蛋白的表达来验证蛋白相互作用。

酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。

通过构建酵母双杂交载体和酵母双杂交菌株，进行酵母双杂交筛选和酵母双杂交验证，可以得到蛋白相互作用的信息。

LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3,可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD（202个氨基酸残基组成的LexA蛋白）与目标蛋白（钓饵，Bait）的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexAX8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点（EcoRI与XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白）等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA,但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。

分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成1 .载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2 .酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3 .大肠杆菌菌株：E.coliKC8株4 .对照质粒：质粒用途pLexA-53,pB42AD-T阳性对照pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam（LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用）假阳性检测质粒5 .引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。

分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

酵母自激活验证步骤咱今天就来说说酵母自激活验证步骤哈。

你想想看，酵母就像个小魔法师，有时候它可能会自己偷偷“施展魔法”，这可不行，咱得把它的小把戏给弄清楚。

首先呢，咱得准备好各种材料和工具，这就好比战士上战场得有趁手的兵器呀。

把需要的酵母菌株啊、培养基啊啥的都准备齐全喽。

然后呢，把酵母菌株接种到合适的培养基上，这就像是给小魔法师找个表演的舞台。

让它在那儿好好待着，看看它会不会自己就开始闹腾。

接着呀，观察培养的情况。

这可得瞪大眼睛仔细瞧，不能放过任何一个小细节。

看看有没有啥异常的现象出现，是不是自己就开始活跃起来啦。

要是发现有点不对劲，那咱就得进一步研究啦。

这就好像侦探发现了一点蛛丝马迹，得顺着往下深挖。

可以做一些对照实验，和正常情况的酵母对比对比，看看差别到底在哪里。

再之后呢，分析数据也很重要哇。

那些实验结果就像一个个小线索，得把它们串起来，才能找到真相。

可别小瞧了这些数据，它们能告诉我们很多东西呢。

你说这酵母自激活验证步骤是不是挺有意思的？就跟解谜似的。

咱得一步一步慢慢来，不能着急。

就像盖房子，得一块砖一块砖地垒起来，才能盖得结实。

要是不认真对待这些步骤，那可就麻烦喽。

说不定就会得出错误的结论，那可就得不偿失啦。

所以哇，咱得仔细着点儿，可别马虎大意。

而且呀，做这个还得有耐心。

有时候可能一次两次都发现不了问题，但咱不能放弃呀，得继续坚持下去。

就像挖宝藏，不挖到底怎么知道有没有宝贝呢。

总之呢，酵母自激活验证步骤虽然听起来有点复杂，但只要咱认真对待，肯定能把这个小魔法师给看透透的！你说是不是呀？。