实验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白

盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白(选学)【目的和要求】1.掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。

2.学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，包括制胶、灌胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。

3.了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用，利用盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质和血清球蛋白-血清清蛋白-铁氧还原蛋白的混合液。

【实验原理】盘状聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。

改变单体的浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，将次凝胶灌装于直立的玻璃管中，再加样品，进行电泳分离，称为盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。

一般常采用7.5%的盘状聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，2.4%的分离核酸。

盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳又常分为两大类，第一类是连续的凝胶电泳，第二类是不连续的凝胶电泳不连续的凝胶电泳亦可称为盘状电泳。

在这种电泳过程中，除去一般的电荷效应外，还有两种物理效应：（1）凝胶对样品分子的筛选效应：颗粒小，形状为圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大形状不规则的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力较大，移动较慢。

（2）不连续系统对样品的浓缩效应：高度的浓缩效应，大大提高电泳分离的分辨率，特别适用于稀浓度的样品的分离。

【实验试剂与仪器】试剂：新鲜不溶血的动物细胞，凝胶缓冲液（pH=8.9），分离胶缓冲液（28%Acr-0.735%Bis），浓缩胶缓冲液（pH=6.7），浓缩胶贮液，过硫酸铵溶液（当天用当天配置），核黄素铵溶液，40%蔗糖溶液，Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3），0.1%溴酚蓝指示剂，染色液，脱色液。

仪器：常压电泳仪；圆盘电泳槽；玻璃管（内径约0.5cm～0.7cm，长度约8 cm～10cm）；有机玻璃架（或自制木头架）；微量进样（100μl）器；5ml注射器；长、短注射针头；长、短颈滴管；日光灯或100w白炽灯；乳胶管；玻璃球（或小段玻璃棒）；培养皿；烧杯；洗耳球。

教案首页第__3__次课授课时间：2006年11月13日～11月17日总黄酮生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。

在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。

简介近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。

类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。

它们对健康的好处有：（ 1 ）抗炎症（ 2 ）抗过敏（ 3 ）抑制细菌（ 4 ）抑制寄生虫（ 5 ）抑制病毒（ 6 ）防治肝病（7 ）防治血管疾病（8 ）防治血管栓塞（9 ）防治心与脑血管疾病（10 ）抗肿瘤（11 ）抗化学毒物等。

天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。

近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验，证实类黄酮既是药理因子，又是重要的营养因子为一种新发现的营养素，对人体具有重要的生理保健功效。

目前，很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。

例如，茶叶提取物和银杏提取物。

葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年，其防治动脉硬化、治偏瘫、防止大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等不乏数例较多的临床报告。

从法国松树皮和葡萄籽中提取的总黄酮" 碧萝藏"-- （英文称PYCNOGENOL ）在欧洲以不同的商品名实际行销应用25 年之久，并被美国FDA 认可为食用黄酮类营养保健品，所报告的保健作用相当广泛，内用称之为" 类维生素" 或抗自由基营养素，外用称之为" 皮肤维生素" 。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚合系统)-1一、目的：1．学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

2．掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。

3．比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。

二、原理：（一）盘状电泳原理盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2厘米），然后再进行电泳分离。

盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性（discontinuity），凑巧分离出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。

因此，英文名称为disc electrophoresis，中文直译为盘状电泳。

仪器装置：（见图15-1）。

上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。

上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。

上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。

这里仅以Davis和Orstein（1964）用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便说明其基本原理。

此系统是一个高pH的碱性系统，或称阴离子系统，最初用于分析血清蛋白，但也适用于其他的酸性和中性蛋白。

很多细胞蛋白质，或病毒的结构蛋白在此系统中（pH8—9）解离成阴离子，向阳极移动。

系统由下列三种不连续的凝胶组成。

即在每支玻璃管中装有三层不同的凝胶（见图15-2）。

最上层为样品胶，中层为浓缩胶（又称间隔胶或积层胶），下层为分离胶（又称电泳胶）。

在盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。

由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高。

例如人血清用纸电泳(PH8.6)可以分成5—7个成分，而用盘状电泳也可分成20—30个条带清晰的成分（参看图15-3）。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。

2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。

在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。

根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。

一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。

图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。

本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。

【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。

2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。

这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。

血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理本实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。

电荷和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。

由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高。

血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳仅能分成5~7个组份，而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12~30个组份。

操作(一)凝胶柱的制备：1．取已准备好的10×0.6cm的玻管，从一端量至7cm处，用玻璃腊笔划线。

起始端用胶布包封好后，插入橡皮塞中，垂直放好。

2．分离胶的制备：(1)按分离胶配制表的比例(附后)，取1号、2号试剂和蒸馏水加入一小烧杯中，混合后，再加入3号和4号试剂，混匀后即成为分离胶溶液(此溶液约在半小时内聚合为聚丙烯酰胺凝胶，故应尽快操作。

如室温较高时，为防止过快聚合，可放置冰浴中操作。

或根据聚合速度的快慢，适当调整TEMED的加入量)。

(2)用5ml注射器、18号针头或用长细滴管吸取分离胶溶液，将其沿玻管管壁注入玻管，直至7cm划线平面。

(3)用长细滴管吸取蒸馏水，沿管壁在分离胶的液面上加注0.5cm高的水层。

加水时必须缓慢细流，尽量减少胶液表面的震动与混合。

(加注水层是为了使凝胶聚合后的表面平整而不致出现弯月形，并能使凝胶与空气隔绝。

这一步很重要，它将直接影响分辨率与带形)。

(4)将加注好的凝胶管静置1小时，以进行聚合反应。

在聚合过程中，起初凝胶与水层的界面逐渐消失，待胶体形成后，其界面又将重新可辨。

这一现象可用来观察判断凝胶的聚合是否完成。

3．浓缩胶的制备(1)按浓缩胶配制表的比例取2号、5号试剂和蒸馏水加入另一小烧杯中，混合后，再加入3号和4号试剂，混匀后即成为浓缩胶溶液。

(在制备浓缩胶时，也常用核黄素催化的光聚合来代替过硫酸铵催化的化学聚合作用)。

(2)用滴管和滤纸小心地吸去已聚合好的分离胶胶面上的水液。

注意切勿触及胶面。

(3)用长细滴管或注射器吸取浓缩胶溶液，在分离胶胶面上沿玻管壁小地注入0.5~1 cm高的胶液。

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白[实验目的](1)学习聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳原理。

(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

(3)比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白的操作效果。

[实验原理]带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N'，N'—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。

[实验试剂]1、待测样品：新鲜血清2、制备分离胶、浓缩胶有关试剂：(1)凝胶缓冲液：称取1 mol/L HCl 48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED 0.23mL,加重蒸馏水至80mL 使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100mL ，至棕色瓶，冰箱储藏。

(2)分离胶贮液，一般有两种配法：ⅰ28％Acr-0.735％Bis贮液：丙烯酰胺28.0克，甲叉双丙烯酰胺0.735克,加重蒸馏水使其溶解然后定容至100mL.ⅱ30％Acr-0.8％Bis贮液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸馏水使其溶解定容至100mL.以上两种溶液需用棕色试剂瓶盛放,4℃储存,一般可放置一个月左右.(3)分析纯过硫酸铵(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃储存仅能用一周,最好当天配置.上述三种试剂用于制备分离胶.(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED 0.46mL,加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃储存.(5)浓缩胶贮液:称取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，过滤后至棕色瓶4℃贮存。

实验聚丙烯酰胺凝胶圆盘状电泳法分离血清蛋白Poly-acrylamide Gel electrophoresis(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，透明且有弹性，化学性质比较稳定，受PH和温度的变化影响较小，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，几乎不产生吸附和电渗作用。

在制备凝胶时通过改变单体浓度和交联度，可以根据实验目的及样品分子特性,随意控制凝胶孔径大小，且制备的凝胶重复性好。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Poly-acrylamide Gel electrophoresis, 简称PAGE)常用于蛋白质的分离鉴定，也可用于分离小分子核酸或核酸片段。

此外，由于聚丙烯酰胺凝胶纯度高及不溶性，不致污染样品，该法还适用于少量样品的制备。

本实验通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和操作技术。

一、[实验原理]聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide ,简称Arc）和交联剂甲叉双丙烯酰胺(N,N＇-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化系统的作用下,聚合而成的具有三维网状立体结构的大分子物质。

本实验以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂，过硫酸胺(AP)为引发剂。

O —CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—CH2=CH—C C=O CONH2NH NHCH2=CH—CONH2+ CH2CH2NH NHCH2=CH—C C=O CONH2O —CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—丙烯酰胺N,N’-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺聚丙烯酰胺一般情况下，凝胶的浓度大或交联度大，蛋白质迁移的速度慢，电泳时间长，反之迁移速度快，电泳时间短。

通常凝胶的筛孔透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的，而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。

聚丙烯胺凝胶电泳所以能把一个蛋白质混合物分离开来 , 除决定于被分离分子的大小和形状外 , 还决定于分子所带的电荷等因素本实验采用电泳基质的不连续体系，这种不连续的PAGE在电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应；②凝胶的分子筛效应；③一般电泳分离的电荷效应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质Separating Serum Protein by PAGE一、目的1.把握聚丙烯酰胺凝胶电泳的大体原理2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE）,是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采纳电泳基质的不持续体系（即凝胶层的不持续体系、缓冲液离子成份的不持续性、pH的不持续性及电位梯度的不持续性），使样品在不持续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度1—2mm），然后再进行电泳分离。

聚丙烯酰凝胶电泳的进程中有三种物理效应：（1）样品的浓缩效应，（2）凝胶的分子筛效应，（3）一样电泳的电荷效应。

使样品分离成效好，分辨率高。

例如人血清用醋酸纤维素薄膜电泳（）能够分成5—7个成份，而用聚丙烯酰胺凝胶电泳那么可分成20—30条带清楚的成份。

下面就聚丙烯酰胺凝胶电泳说明三种物理效应的原理。

1、样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不持续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩然后再被分离。

（1）凝胶层的不持续性：两层不同的凝胶，其作用如下：浓缩胶：为大孔胶，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序慢慢在其与分离胶的界面积聚成薄层。

分离胶：为小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离。

（2）缓冲液离子成份和电位梯度的不持续性：在浓缩胶当选择，电泳槽缓冲液pH为，HCl几乎全数释放出Cl-,甘氨酸（等电点在；羧基解离 pKa1=, 氨基—NH3+解离pKa2=）在此条件下有极少部份的分子（1—%）解离成为甘氨酸负离子NH2CH2COO-在下，大部份蛋白质都以负离子形式存在（大多数蛋白质等电点接近于）。

这三种离子都带有相同电荷，当电泳系统通过必然电流后三种离子同时向正极移动，而且它们的有效泳动率按以下顺序排列。

（有效泳动率=泳动率m·解离度d）m Cl d Cl>m蛋d蛋>m甘d甘依照有效率泳动率的大小，最快的称为快离子，最慢的称为慢离子，电泳刚开始时，两种凝胶都含有快离子，只有电泳槽中电泳含慢离子，电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，就会专门快超过蛋白质，因此，在快离子的后面形成一离子浓度低的区域即低电导区。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质一、实验目的：1、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

2、掌握圆盘电泳的操作方法。

二、实验原理：1.聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺( Acr )单体和少量交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺( Bis )在催化剂过硫酸铵( Ap )和加速剂四甲基乙二胺( TEMED )的作用下发生聚合反应而制得的。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。

即凝胶的浓度决定凝胶筛孔的平均直径，凝胶的交联度决定凝胶筛孔的最大直径。

2.采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。

3.连续系统缓冲液的pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场力的作用下，主要靠电荷及分子筛效应得到分离4.不连续系统①浓缩效应：a.凝胶层孔径不连续:浓缩胶大孔径，具有浓缩效应；分离胶小孔径，具有分子筛效应。

b.pH值不连续:电泳缓冲液pH=8.3;浓缩胶pH=6.7;分离胶pH=8.9。

c.缓冲液离子不连续:电泳液中Gly-(慢离子);凝胶中CI+(快离子);Pr介于二者之间。

d.电位梯度不连续：电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度(电位与电导率成反比),使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。

蛋白质是大分子物质，此时解离度又不大，自然状态下电荷密度不高，但在等速电泳界面，为满足各横断面电流相等的要求，唯一可能就是分子相互靠近，以达到与Cl-离子、Gly-离子相同的电荷密度，于是发生浓缩效应。

②电荷效应：v=Eq/6πrη③分子筛效应：样品组分根据其分子量大小不同而分离，分子量小的泳动速度大。

三、实验步骤：1.准备电泳管每人取电泳管1支，标好号码，玻棒堵住底部，加1—2滴40％蔗糖于底端。

2.分离胶制备吸取1号2ml、2号4ml、水2ml，在桑玻氏管中混匀，用真空泵抽气至无气泡为止，抽气后加3号8mL，混匀备用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质一、电泳的概念带有电荷的离子在电场中称动的现象称为电泳。

电泳技术的发展：1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳后用光学系统使各种蛋自所形成界面折光率差别成为曲线图象，发现血清蛋白可分为4~5高峰，即白蛋白、α(α1和α2)、β和γ球蛋白，使电泳技术开始应用于临床研究。

但这类电泳仪结构较复杂，价值昂贵不易推广。

1940年代，Kӧnig和Wieland等发明用滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化，而且可使许多组份相互分离为区带，所以这类电泳被称为区带电泳，而Tiselius 的电泳装置则称界面自由电泳，纸上电泳发明后在临床上到广泛的应用。

1950年发展为琼脂凝胶电泳。

1953年又发展为电泳后用免疫沉淀线检测的免疫电泳。

1955年Smithies以淀粉胶为支持物进行血清蛋白电泳分离，结果可分为十余条区带，这是由于淀粉胶尚具有分子筛作用使蛋白更有效地分离，淀粉胶的制备不易标准化是该法的缺点。

1959年Davis发明聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺具有耐热、透明、化学性质稳定等优点，并可以不同浓度的丙烯酰胺单体聚合为各种不同大小孔径的凝胶，即可制备各种不同孔径的分子筛，对于蛋白质和核酸等大分子物质的分离提供了有用的技术。

六十年代以来又出现了等电聚焦电泳和等速电泳等新电泳技术。

二、电泳的基本原理设一带电粒子在电场中所受的力为F，F的大小决定于粒子所带电荷Q的电场的强度X，即：F= QX又按Stoke氏定律，一球形的粒子运动时所受到的阻力F’与粒子运动的速度v、粒子的半径r、介质的粘度η的关系为：F’= 6πrηV当F＝F’时，即达到动态平衡时：QX= 6πrηV移项得：V／X= Q／6πrηV/X表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率(mobility)，也称为电泳速度，以ｕ表示。

由公式可见，粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质，包括其所带电荷及其大小和形态。