甲苯胺蓝染色渗透试验

甲苯胺蓝染色原理甲苯胺蓝（Methylthioninium chloride）是一种用于组织切片染色的有机染料，也被称为甲苯蓝或亚甲基蓝。

甲苯胺蓝在组织学染色中广泛应用，特别在神经组织中的染色效果显著，常用于突触研究和神经元计数。

甲苯胺蓝的染色原理涉及到其本身的分子结构和组织切片中的某些成分之间的相互作用。

首先，甲苯胺蓝是一种亲电性染料，其分子结构含有亚甲基蓝的三个苯环。

这些苯环中的一个或多个苯基与细胞组分中的负电荷基团（如DNA核苷酸、蛋白质等）发生吸附和离子相互作用。

这种吸附和离子相互作用使得甲苯胺蓝能够与细胞内的核酸物质结合，并产生特定的染色效果。

其次，甲苯胺蓝在染色过程中通过可逆地与细胞组分中的电荷基团发生氧化还原反应来增强或改变染色效果。

在染色溶液中，甲苯胺蓝会接受电子，从而减少其氧化态，形成无色的还原型甲苯胺蓝。

当染色溶液接触到切片表面时，甲苯胺蓝被氧化，恢复到其有色的氧化态，从而显现出染色效果。

这种还原氧化循环的发生使得甲苯胺蓝能够在组织切片上形成持久的染色效果。

此外，甲苯胺蓝还可以与细胞中的多种有机物质发生特异性反应。

例如，甲苯胺蓝可以与DNA中的磷酸核苷酸结合，形成深蓝色的染色复合物。

这种DNA与甲苯胺蓝的结合形成了一种可靠的染色方法，常用于观察细胞核的形态和位置。

此外，甲苯胺蓝还可以与某些神经细胞蛋白质中的酚基团发生偶联反应，从而形成深蓝色的染色效果。

这种特异性反应可以帮助研究人员定位神经元的位置，并观察神经元之间的连接情况。

总结来说，甲苯胺蓝染色的原理是通过染料分子与细胞中的带负电荷的核酸和蛋白质等电荷基团的吸附和离子相互作用，以及发生氧化还原反应来产生染色效果。

甲苯胺蓝与细胞内不同成分的特异性反应可用于观察细胞核的形态和位置，以及神经元的连接情况。

因此，甲苯胺蓝成为一种常用的神经组织切片染色方法，为神经科学研究提供了重要的工具和技术支持。

甲苯胺蓝染色液(0.5%,硼酸盐法)简介：甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料, 属于醌亚胺染料类, 这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。

甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用, 组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。

甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类, 帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。

另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质，遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，临床上经常用于肥大细胞染色。

Leagene 甲苯胺蓝染色液(Toluidine Blue,1%,硼酸盐法)由于硼酸盐缓冲液呈强碱性，更利于组织细胞的着色。

组成：操作步骤(仅供参考)：(一)肥大细胞染色1、脱蜡至蒸馏水。

2、根据切片厚度和组织的不同，浸染于甲苯胺蓝染色液。

3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗。

4、冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。

5、快速和无水乙醇脱水。

6、 二甲苯透明，封固。

染色结果：肥大细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。

(二)软骨染色1、 石蜡切片入二甲苯。

2、 系列乙醇各。

3、 自来水洗。

4、 入Toluidine Blue O Stain ，浸染。

5、 自来水洗，滤纸吸干水分。

6、 丙酮分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。

7、 逐级乙醇脱水。

编号 名称 DA0059 Storage Toluidine Blue O stain (0.5%,硼酸盐法) 100ml RT 避光 使用说明书 1份8、二甲苯透明，中性树胶封固。

染色结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色。

(三)细胞涂片染色1、用乙醇溶液稀释甲苯胺蓝染色液, 一般要求稀释即可。

2、细胞涂片后，立即放入乙醇中固定，取出放在纸巾上。

3、滴加稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。

4、将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。

5、无需干燥，直接镜检。

尼氏染色液(甲苯胺蓝法)简介：尼氏体(Nissl body)或称尼氏小体是分布于神经细胞胞质内的三角形或椭圆形小块状物质，能被碱性染料如硫堇、亚甲蓝、甲苯胺蓝和焦油紫等染料染成紫蓝色。

各种神经细胞内都含有尼氏体，但其形状、数量、分布位置常常不同。

尼氏体也存在于树突中，但不在于轴突和包体的轴丘。

尼氏体会因为生理状态的变化而变化，尼氏体是神经元内合成蛋白质合成的重要部位，当神经元受到刺激后，包体内的尼氏体会明显减少。

Leagene 尼氏染色液(Nissl Stain ，甲苯胺蓝法)采用甲苯胺蓝(Toluidine blue)作为核心染料，可以用于石蜡组织切片的尼氏体染色，尼氏体的存在和消失是神经细胞是否受损的重要指标，当发生脑炎、脑缺血、轴突反应等情况时，尼氏体会发生溶解甚至消失。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、 新鲜组织固定于乙醇、Carnoy 固定液或10%中性福尔马林溶液后，常规脱水包埋。

2、 切片厚6-8µm，常规脱蜡至水。

3、 蒸馏水冲洗。

4、 切片入Toluidine blue Stain ，将染色缸置于恒温箱浸染。

5、 蒸馏水稍冲洗。

6、 入70%乙醇冲洗。

7、 95%乙醇迅速分化。

分化不易控制，如果分化失败，可重复步骤4。

8、 无水乙醇迅速脱水。

二甲苯透明，中性树胶封固。

染色结果：尼氏体紫蓝色 细胞核棕红色注意事项：1、 尼氏体离体后容易溶解，所以组织取出后应立即固定，否则难以着色。

2、 组织固定起着非常重要的作用，固定可采用乙醇、Carnoy 固定液或中性福尔马林溶液。

编号 名称 DK0023 Storage Toluidine blue Stain 100ml RT 避光 使用说明书 1份3、本染色液对石蜡组织切片的尼氏染色效果较好。

4、染色后的标本务必避光保存，否则容易褪色。

5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

相关：编号名称DC0032 Masson三色染色液DC0080 Russell改良Movat五色套染染色液DF0111 中性福尔马林固定液(10%)DG0005 糖原PAS染色液DH0001 改良Lillie-Mayer苏木素染色液DJ0001 普鲁士蓝染色液(核固红法)PW0040 Western blot一抗稀释液TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)。

包装封口验证编制：日期：审核：日期：批准：日期：目录一、总则1. 1验证目的1. 2 验证依据1. 3 验证范围1. 4 工艺概述1. 5验证用监视和测量设备1. 6 验证小组及职责二、IQ 验证开展三、OQ验证开展3. 1 工艺参数设置3. 2 试样准备3. 2. 1 试验对象3. 2. 2质量要求四、PQ验证开展4. 1工艺参数设置4. 1. 1 运行试验4. 2 性能确认4. 2. 1 包装材料密封过程的适应性4. 2. 2 包装材料的微生物屏障特性4. 2. 3 包装材料与贮存、运输过程的适合性五、验证结果及分析5. 1 验证结果5. 2 验证结论六、再验证6. 1 影响过程参数的原材料改变6. 2 设备相关改动，与吸塑、热封部位的维护、改动6. 3 设备地点的变迁6. 4产品上市后每年的重新确认6. 5有严重产品相关质量事故发生一、总则1. 1 验证目的对单包装封口过程有效性进行验证，确认产品的封口参致是否完持续充分、适宜，有效,以确保本公司单包装封口过程能满足产品加工要求。

1. 2 验证依据1)《医疗器械生产质量管理规范附录无菌医疗器械》；2)《医疗器械生产质量管理规范无菌医疗器械现场检查指导原则》；3) 各设备操作规程以及使用说明书；4）GB/T19633 《最终灭菌医疗器械包装》，YY/T0698.5-2009《最终灭菌医疗器械包装材料第5部分》1. 3 验证范围适用于本公司生产的医用一次性防护服，初包装采用塑料复合膜袋。

涉及该过程的设备如下：表1:封口机技术参数表1. 4工艺概述a、接通电源，调节加热时间，温度速度，待温度稳定后方可使用。

b、将产品放入包装袋，将袋内空气排出。

c、双手持袋沿封口机输送带相同转动方向放入产品（从右往左）。

封好后整齐摆放在工位器具内。

d、包装袋封口处应对齐放平，将袋口抹平（进料口）送入，当封口处被封口带咬合使包装袋自动向前行进，此时不要任意推动或阻挡，否则会造成封口皱叠或故障。

通过染料渗透试验法检验多孔医用包装密封泄漏的标准试验方法1 范围1.1 本实验介绍了能够检验并定位泄漏处的材料和步骤，其中泄漏处等于或大于一个由50微米（0.002寸）丝形成的槽，这条丝是在一个透明薄膜和一块多孔板材之间形成的包装封边上。

染料渗透溶液局部性应用于封边以便检验泄漏。

在接触染料渗透液特定时间之后，就可以在包装上目测到这种染料的渗透。

1.2 这种测试方法意在用于有一个透明薄膜和一块多孔板材形成封边的包装上。

本试验仅限于可以保留住染料渗透液，防止在最短20秒内使整个密封区变色的多孔材料。

无涂层纸张最容易受泄漏影响，因而必须小心评估此试验的用途。

1.3 本试验要求染色渗透液必须和不透明度的包装材料很易对比。

1.4 以国际单位标出的数值是标准值，圆括号内的是参考值。

1.5 本标准不旨在讨论所有安全注意问题，如果有也是结合其用途。

本标准使用者负责制定适宜的安全健康条例并在使用前决定其条例限制的适用性。

2. 参考资料2.1 ASTM标准F 1327 关于医用包装防潮材料的专用术语2.2 ANSI 标准Z1.4 特征测试的抽样程序及表格3. 术语3.1 wicking(吸收)一种液体向一个纤维材料主体移动的过程。

这与在F1327 中定义的泄漏是完全不同的。

3.2 dye penetrant（染料渗透液）--一种染料和表面活性剂的水溶液，用于渗透并指示在吸收进行之前隐蔽的泄漏处的位置。

3.3 channel (槽)—一个横过仅供微生物穿过的包装密封宽度的连续敞开的小通道。

它是本实验的主要目的，就是在染料通过它时可以目测出现的泄漏。

4. 意义和用途4.1 有害生物或特有污染可能会通过泄漏进入到装置中。

这些泄漏会频繁在相同或不同材料的包装成分的密封中发现。

泄漏有可能也会由包装材料上的小孔导致。

4.2 这个染料渗透过程仅适用于一个包装密封上的单独泄漏。

在多孔材料上发现的很多小的泄漏可以由其他技术进行检测，在此不作叙述。

1 目的
用甲苯胺蓝水溶液，注入密封纸塑袋内部，以检测粘合效果是否良好，以确认是否达到无菌医疗用品封装的要求。

2 范围
纸塑袋无菌包装系列产品。

3 职责
质量部实验室负责按照此规程检测该项目。

4 规程
4.1溶液配制
取一个500mL容量瓶，先装100mL～200mL水，再加入2.5g Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），搅拌均匀后，再加入0.25g甲苯胺蓝，充分溶解后，加水定量至500mL。

4.2测试步骤、
4.2.1待测品预处理
在温度（23±2）℃和相对湿度（50±2）%环境下放置24h，然后进行测试。

4.2.2用塑胶吸管吸取适量的甲苯胺蓝水溶液，注入纸塑袋内，保持纸塑袋封口处的液面大于5mm。

4.2.3移动纸塑袋，使甲苯胺蓝溶液均匀分布在纸塑袋各缝合处5s～30s；检查缝合处是否有任何
渗透至袋外的现象。

4.2.4判定标准：如果有任何渗透发生，则视为不合格。

5 相关文件和记录
5.1 相关文件
5.1.1 YY/T 0681.4-2010《无菌医疗器械包装试验方法染色液穿透法测定透气包装的密封泄漏》
5.1.2 YY 0698.5-2009《最终灭菌医疗器械包装材料第5部分：透气材料与塑料膜组成的可密封组合袋
和卷材要求和试验方法》
5.2 相关记录
QMR-050 《纸塑袋进货检验记录》。

北京雷根生物技术有限公司
肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)
简介：
甲苯胺蓝(T oluidine Blue O)中的阳离子有染色作用, 组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。

甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类, 帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。

临床上，经常用甲苯胺蓝对软骨细胞和肥大细胞进行染色。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 石蜡切片入二甲苯2次。

2、 系列乙醇各1min 。

自来水洗。

3、 入Toluidine Blue O Stain 浸染。

4、 自来水洗2min ，滤纸吸干水分。

5、 95%乙醇分色至肥大细胞呈紫蓝色，背景呈淡蓝色。

6、 95%乙醇1min 。

无水乙醇2次，每次2min 。

二甲苯透明，中性树胶封固。

染色结果： 肥大细胞颗粒
紫蓝色 背景
淡蓝色
注意事项：
1、 针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。

2、 固定液最好采用Carnoy 固定液。

3、 甲苯胺蓝染色后不宜采用低浓度乙醇脱水，否则容易导致褪色。

4、 分色后应快速入95%乙醇、无水乙醇、二甲苯的时间不宜过久，否则容易导致褪色。

有效期： 12个月有效。

编号 名称 DA0050 Storage Toluidine Blue O Stain 100ml RT 避光 使用说明书 1份。

SD大鼠甲苯胺蓝染色步骤1、甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞表型将第二代软骨细胞以2x105/ml的密度接种到24孔细胞培养板上，并在与原代培养相同的条件下制备细胞爬片。

常规培养48小时后，进行甲苯胺蓝染色。

具体操作步骤如下：(1)倾去培养液，pbs充分漂洗3次，加入10％的中性甲醛常温下固定30min。

(2)倾去10％的中性甲醛，pbs充分漂洗3次，加入70％的乙醇固定30min除去四价铵离子，以免影响染色。

（3）倒出70%乙醇溶液，用PBS冲洗3次，在空气中干燥，加入甲苯胺蓝乙醇溶液（0.2g甲苯胺蓝溶于100m1的30%乙醇中）染色20分钟(4)pbs充分漂洗3次，迅速用无水乙醇再漂洗1次。

（5）取出爬升件，干燥中性树脂密封件，在电子显微镜下观察并取出。

2.I型胶原免疫细胞化学染色鉴定软骨细胞表型ⅱ代软骨细胞以2×105／ml的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中，与原代培养条件相同，制作细胞爬片，常规培养48h后行免疫细胞化学法染色。

实验过程严格遵照免疫细胞化学染色试剂盒说明书进行操作，pbs缓冲液代替一抗作为阴性对照组。

具体操作步骤如下：（1）倒出培养基，用冷PBS冲洗3x3分钟，加入1毫升4%多聚甲醛，室温固定15分钟。

（2）使用PBS清洗样品3x3分钟。

每个样品加入1滴新鲜制备的3%H2O2，并在室温下培养10分钟。

（3）使用PBS清洗样品3x3分钟。

每个样品加入0.5 m（0.1%Timton+o.1 mg甘氨酸）的膜穿透溶液，并在冰上培养30分钟。

(4)pbs清洗标本3x3min，每张标本滴加5mg／ml的动物非免疫封闭血清(bsa)0.5ml，室温下封闭1h。

（5）向密封膜中加入50ul以1:150稀释的兔抗鼠II型胶原多克隆抗体，使标本与一抗充分接触，并将其置于4℃的湿盒中过夜。

阴性对照组用PBS缓冲液代替一抗。

（6）用PBS清洗样品3x3min，加入二抗工作液，37℃孵育20min。

通过染料渗透试验法检验多孔医用包装密封泄漏的标准试验方法1 范围1.1 本实验介绍了能够检验并定位泄漏处的材料和步骤，其中泄漏处等于或大于一个由50微米（0.002寸）丝形成的槽，这条丝是在一个透明薄膜和一块多孔板材之间形成的包装封边上。

染料渗透溶液局部性应用于封边以便检验泄漏。

在接触染料渗透液特定时间之后，就可以在包装上目测到这种染料的渗透。

1.2 这种测试方法意在用于有一个透明薄膜和一块多孔板材形成封边的包装上。

本试验仅限于可以保留住染料渗透液，防止在最短20秒内使整个密封区变色的多孔材料。

无涂层纸张最容易受泄漏影响，因而必须小心评估此试验的用途。

1.3 本试验要求染色渗透液必须和不透明度的包装材料很易对比。

1.4 以国际单位标出的数值是标准值，圆括号内的是参考值。

1.5 本标准不旨在讨论所有安全注意问题，如果有也是结合其用途。

本标准使用者负责制定适宜的安全健康条例并在使用前决定其条例限制的适用性。

2. 参考资料2.1 ASTM标准F 1327 关于医用包装防潮材料的专用术语2.2 ANSI 标准Z1.4 特征测试的抽样程序及表格3. 术语3.1 wicking(吸收)一种液体向一个纤维材料主体移动的过程。

这与在F1327 中定义的泄漏是完全不同的。

3.2 dye penetrant（染料渗透液）--一种染料和表面活性剂的水溶液，用于渗透并指示在吸收进行之前隐蔽的泄漏处的位置。

3.3 channel (槽)—一个横过仅供微生物穿过的包装密封宽度的连续敞开的小通道。

它是本实验的主要目的，就是在染料通过它时可以目测出现的泄漏。

4. 意义和用途4.1 有害生物或特有污染可能会通过泄漏进入到装置中。

这些泄漏会频繁在相同或不同材料的包装成分的密封中发现。

泄漏有可能也会由包装材料上的小孔导致。

4.2 这个染料渗透过程仅适用于一个包装密封上的单独泄漏。

在多孔材料上发现的很多小的泄漏可以由其他技术进行检测，在此不作叙述。