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革兰氏染色法的步骤革兰氏染色法的步骤革兰氏染色法是一种常用的细菌分类和鉴定方法。
它根据细菌细胞壁的结构和化学成分，将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
下面将详细介绍革兰氏染色法的步骤。
一、准备工作1.1 器材准备首先要准备好必要的器材，包括显微镜、无菌玻璃片、无菌钢笔、灯笼或 Bunsen 灯、草酸洗涤液、碘酒、脱色剂（95% 乙醇）、甲苯或二甲苯等。
1.2 样品准备样品可以是从患者体内采集的分泌物或组织样本，也可以是实验室中培养出来的纯种菌株。
无论哪种样品，都需要进行处理以获得高质量的染片。
二、染色操作2.1 制备涂片将无菌玻璃片取出并标记，然后用无菌钢笔在玻璃片上滴上一滴水或生理盐水。
取一小部分样品，用钢笔或无菌棉签将其涂抹在涂片上，制成薄而均匀的染片。
2.2 固定细胞将涂片用灯笼或 Bunsen 灯加热，使其完全干燥。
然后将涂片固定，可以使用草酸洗涤液或甲醛等固定剂进行固定。
2.3 染色操作（1）革兰阳性菌的染色操作① 将碘酒滴在涂片上，静置 1 分钟。
② 用脱色剂（95% 乙醇）冲洗涂片，直到洗出的颜色不再变深。
③ 用甲苯或二甲苯清洗干净，并在空气中晾干。
（2）革兰阴性菌的染色操作① 将甲基红溶液滴在涂片上，静置 1 分钟。
② 用脱色剂（95% 乙醇）冲洗涂片，直到洗出的颜色不再变深。
③ 将碘酒滴在涂片上，静置 1 分钟。
④ 用脱色剂（95% 乙醇）冲洗涂片，直到洗出的颜色不再变深。
⑤ 用甲苯或二甲苯清洗干净，并在空气中晾干。
三、观察和解释结果使用显微镜观察染色后的涂片。
革兰阳性菌会呈现紫色或暗紫色，而革兰阴性菌则会呈现红色或粉红色。
根据细菌的染色结果，可以推断出其细胞壁的结构和化学成分，进而进行分类和鉴定。
总结革兰氏染色法是一种简单而可靠的细菌分类和鉴定方法。
其步骤包括制备涂片、固定细胞、染色操作以及观察和解释结果。
通过这种方法，可以将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌，并推断出其细胞壁的结构和化学成分，为临床诊断和治疗提供重要参考依据。
革兰氏染色法步骤详解革兰氏染色法是微生物学中常用的染色方法之一，用于区分细菌的结构和特征。
本文将深入讨论革兰氏染色法的步骤，并提供对这个方法的观点和理解。
一、引言在微生物学中，革兰氏染色法是一种重要的技术手段，通过染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
这个方法的基本理念是利用染料与细菌细胞壁的化学成分相互作用，以实现细菌分类和分析的目的。
二、步骤详解1. 准备细菌标本在进行革兰氏染色前，需要准备细菌培养物或细菌纯培养物作为标本。
可以从实验室中的细菌培养物中选取一个单一的菌落，或者从培养基上划取一小段细菌生长物。
2. 固定细菌标本取一片清洁的玻璃载玻片，利用火焰将其杀菌。
将玻片放在洁净的培养皿中，并滴加一滴蒸馏水。
用平净的无菌棒或无菌铂丝取一小部分细菌标本，涂抹在玻片上。
用火焰消毒无菌棒或无菌铂丝，然后将其放回细菌培养物中。
3. 固定细菌标本将滴有细菌标本的玻片迅速通过火焰，使细菌固定在玻片上。
这一步骤中的火焰杀菌具有重要意义，可以避免后续步骤中的交叉污染问题。
4. 革兰氏染液的使用革兰氏染液通常由蓝色染料结晶紫（crystal violet）、碘化物、脱色剂和红色染料伊苏胺组成。
将预先制备好的革兰氏染液滴在固定的细菌标本上，让其覆盖整个玻片。
5. 染色时间控制整个样本与染色剂接触的时间是关键因素之一，通常控制在1分钟左右。
过长或过短的染色时间都会对结果产生影响，甚至会导致假阳性或假阴性。
6. 去色在染色后，用脱色剂洗去多余的染色剂。
一般来说，用酒精或乙醚轻轻洗涤玻片，直到洗涤剂下流出的颜色不再变深为止。
7. 洗净将玻片放在自来水龙头下冲洗，直到洗涤液中不再有染色剂冲走为止。
这个步骤至关重要，因为过多的染色剂残留可能影响结果的准确性。
8. 透明化将玻片轻轻摇干，然后在显微镜下观察。
可以用透明液（一般为苏木精或环己烷）再次冲洗玻片，使细菌更加透明。
9. 观察细菌将处理过的玻片放在显微镜下观察。
革兰氏染色法的过程及原理之老阳三干创作一,过程1 ．涂片将培养的不合菌辨别作涂片（注意涂片切不成过于浓厚）,枯燥、固定.固定时通过火焰l 一2 次即可,不成过热,以载玻片不烫手为宜.2 ．染色( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴,约一分钟,水洗.( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水,并笼盖约一分钟,水洗.( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净,并衬以白布景,用95 ％酒精滴洗至流出酒精方才不出现紫色时为止,约20 一30 秒钟,立即用水冲净酒精.( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟,水洗.( 5 ）镜检枯燥后,置油镜不雅察．革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色.以分离开的细菌的革兰氏染色反响为准,过于密集的细菌,经常呈假阳性.( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比.二,原理革兰氏染色法（Gram stain ）不但能不雅察到细菌的形态并且还可将所有细菌区分为两大类：染色反响呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G＋暗示：染色反响呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌,用G 一暗示.细菌对于革兰氏染色的不合反响,是由于它们细胞壁的成分和结构不合而造成的.革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫一碘复合物被保存在细胞内而不容易脱色,因此,呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液（番红）的颜色,因此呈现红色.革兰氏染色的关头在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色,不敷时,阴性菌可被误染为阳性菌.此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反响.青霉素作用机制搅扰细菌细胞壁的合成.青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似,可与后者竞争转肽酶,阻碍你粘肽的形成,造成细胞壁的缺损,使细菌失去细胞壁的渗透屏障,对细菌起到杀灭作用.溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏多糖的碱性酶,只要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的B-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分化成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物流出而使细菌溶解,溶菌酶还可以和带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA,RNA,脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活,因此该酶具有抗菌消炎,抗病毒等作用判断细菌有无鞭毛的办法电镜不雅察,鞭毛染色,半固体穿刺培养,菌落形态不雅察描述细菌与古细菌在细胞膜上的主要化学区别在革兰氏阴性菌的表层,有由肽葡聚糖形成的细胞壁,在壁的外面,又有由蛋白质、磷脂质、脂多糖形成的膜层,与里面的细胞质膜相对应,特称此层为细菌外膜.外膜比细胞质膜的磷脂质含量低,但脂多糖的含量则比较高.外膜的蛋白质与细胞质膜不合,主要部分为数种蛋白质所组成.其主要蛋白质的部分与特异的内面的肽葡聚糖以共价键结合.脂多糖存在于外膜的最外层.在外膜中仅知有磷脂酶,在细胞与外界的联系中,已看到有许多功效的蛋白质,即有各类噬菌体、维生素B12、大肠杆菌素等的受体存在,而其一部分蛋白质则与DNA的复制、细胞割裂有关,此外,外膜对水溶性低份子物质容易透过,但对抗菌物质则是透过的屏障,它对革兰氏阴性菌间的透过性带来很大的差别.对于古细菌来说,细胞壁不含肽聚糖,有的以蛋白质为主,有的含杂多糖,有的类似于肽聚糖,但都不含胞壁酸、D型氨基酸和二氨基庚二酸.缺乏细胞壁的原核生物,除了自然界天然存在的缺壁细胞,比方支原体外,实验室菌种的突变、人为抑制新细胞壁合成、和对现成细胞壁进行酶解都可以得到缺壁细胞.缺壁细胞主要有四类：Ｌ型细菌,原生质体,球状体,以及支原体.Ｌ型细菌；形成；实验室或宿主体内通过自发性突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷菌株特点；细胞膨大,对渗透敏感,在培养基上可形成油煎蛋状菌落,具有正常的繁衍能力实践意义；没有了细胞壁的机械固定,细胞及其柔韧,呈多样性,成为“滤过型细菌”.原生质体,球状体；形成；用溶菌酶除尽原有的细胞壁,再用青霉素抑制新生细胞壁的合成,最后得到一层仅有细胞膜包裹的圆球状渗透敏感细胞特点；无完整的细胞壁,细胞呈球状,对渗透压极其敏感,革兰氏染色阴性,细胞不克不及割裂,对相应噬菌体不敏感,无繁衍能力实践意义；比正常有细胞壁的细菌更容易导入外源遗传物质,是研究遗传规律和进行原生质体融合育种的良好资料支原体；形成；在长期进化中形成,适应自然生活条件特点；细胞膜中含有甾醇,故机械强度较大实践意义；青霉素等针对细胞壁杀伤的抗生物对其无效,但是抑制蛋白质合成的抗生素（四环素,红霉素等）和破坏含甾醇细胞膜结。
革兰氏染色法的过程及原理精编版MQS system office room 【MQS16H-TTMS2A-MQSS8Q8-MQSH16898】革兰氏染色法的过程及原理一，过程1．涂片将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰l一2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2．染色(1）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
(2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
(3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20一30秒钟，立即用水冲净酒精。
(4）复染用番红液染1一2分钟，水洗。
(5）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
(6)同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
二，原理革兰氏染色法（Gramstain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G一表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
革兰氏染色法操作规程一、实验准备1.工作台、培养瓶、试管、移液器等必需设备材料的清洁和消毒。
2.需要的培养基、试剂和染色剂的准备。
3.微生物实验室内的操作区域消毒。
4.需要检测的细菌样本，应是新鲜培养的活菌。
二、实验步骤1.将培养的细菌接种物涂布于平板培养基上，培养时间一般为16小时到24小时，以获得足够数量的活菌。
2.取一到两个细菌菌落，用无菌吸铬钢线将菌落挑取，加入到新鲜制备的无菌蒸馏水中制备细菌悬浮液。
3.将细菌悬浮液分装到无菌试管中，并对其进行标记以便辨别。
4. 将试管放入无菌离心机进行离心处理，离心速度一般为3000rpm，离心时间约为5分钟。
5.取出离心后的试管，将离心液倾倒掉，保留细菌沉淀。
6.用无菌注射器吸取一定量的蒸馏水，在细菌沉淀中做三次洗涤，每次洗涤后进行离心处理。
7.吸尽洗涤液后，用吸水纸吸去残余水分，使细菌沉淀尽量干燥。
8.用火焰消毒的铅笔划定干净试验玻片两侧的带标记区域。
9.取少量细菌沉淀用铅笔将其在试验玻片上涂成条状。
10.将涂有菌液的玻片放置在火焰中加热烘干，将菌液固定在玻片上。
11.将固定好的玻片依次进行以下操作：(1)滴加革兰氏碘液，静置1分钟。
(2)用蒸馏水清洗草绿色的碘液，盖过玻片的边缘。
(3)滴加酒精洗涤剂(80%)，使玻片浸泡在酒精中，30秒内亮紫色的溢出。
(4)用蒸馏水冲洗玻片，直至玻片溢出无色为止。
(5)滴加索式葡萄染料，使玻片完全覆盖，静置30秒。
(6)用蒸馏水冲洗玻片，直至落出少量菌落。
12.用吸水纸将玻片表面水分吸干，然后放置在通风处晾干。
13.晾干后的玻片放到显微镜下，用油镜检测。
14.观察和记录细菌的形态特征，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的结构差异。
三、实验注意事项1.所有的试剂和设备都要经过严格消毒处理，防止外部污染。
2.操作过程中要注意无菌操作，避免细菌受到污染。
3.离心过程中要注意离心机的平衡，以免产生震动。
4.细菌沉淀尽量干燥，以便于后续染色步骤。
革兰氏染色液操作步骤及注意事项革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过这种方法，可以将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类。
以下将详细介绍革兰氏染色液的操作步骤及注意事项。
一、操作步骤1、涂片制备首先，在干净的载玻片上滴一小滴生理盐水。
然后，用无菌接种环挑取少量待检细菌培养物，与生理盐水混合均匀，形成薄薄的菌膜。
最后，让涂片自然干燥。
2、固定将干燥后的涂片通过火焰加热固定，加热时要让玻片背面接触火焰，来回通过 2 3 次，以杀死细菌并使其牢固地附着在玻片上。
3、初染在涂片上滴加结晶紫染色液，染色 1 2 分钟。
之后，用细水流轻轻冲洗涂片，直至流下的水无色为止。
4、媒染滴加碘液覆盖涂片，媒染 1 分钟。
同样用细水流冲洗，去除多余的碘液。
5、脱色用 95%的乙醇脱色，脱色时间约 20 30 秒，直到流出的乙醇无色或稍显淡紫色为止。
立即用细水流冲洗，终止脱色。
6、复染滴加沙黄复染液，染色 1 2 分钟。
用细水流冲洗，吸干水分后，在显微镜下观察。
二、注意事项1、涂片质量涂片不宜过厚，否则会影响染色效果，导致细菌重叠，难以分辨。
涂片应均匀，避免出现局部厚、局部薄的情况。
2、固定温度和时间固定时火焰温度不宜过高，以免破坏细菌形态。
固定时间要适中，过长或过短都会影响染色结果。
3、染色时间每种染色液的染色时间都要严格控制。
初染时间不足，会导致革兰氏阳性菌染色不充分；时间过长，则可能使革兰氏阴性菌也染上颜色。
脱色时间更是关键，脱色过度会使革兰氏阳性菌被误判为阴性菌；脱色不足，则会使革兰氏阴性菌被误判为阳性菌。
4、冲洗方式冲洗时水流要细、缓，避免直接冲掉涂片上的细菌。
冲洗的角度要合适，尽量从玻片的一端冲洗，避免染色液在玻片上残留。
5、染色液质量染色液应定期配制或购买新鲜的，以保证染色效果。
储存染色液时要注意避光、防潮，防止其变质。
6、显微镜观察观察时要先低倍镜找到视野，再换高倍镜观察。
革兰氏染色技术操作方法
1、将待染细胞涂片在室温下空气干燥；
2、固定：在干燥细胞涂片上加入固定液，室温下静置10分钟；
3、洗涤：用蒸馏水冲洗干燥细胞涂片；
4、染色：加入革兰氏染色剂液，室温下静置1分钟；
5、洗涤：用蒸馏水冲洗干燥细胞涂片；
6、脱色：滴加脱色液，室温下轻轻晃动，直至出现清晰的紫-蓝-紫三色带；
7、洗涤：用蒸馏水冲洗干燥细胞涂片；
8、除水：在空气中干燥细胞涂片。
注意事项：
1、固定液和脱色液均为有毒溶液，操作时必须戴手套，并注意通风保护；
2、染色时间和脱色时间不宜过长，否则会使细胞结构模糊或丢失；
3、洗涤和除水时要充分清洗，否则会影响染色质量；
4、在使用前要检查染色剂液的pH值，若过酸或过碱会影响染色效果。
革兰氏染色实验报告实验目的，通过革兰氏染色实验，观察和比较革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在染色后的显微镜下的形态特征，从而对细菌进行初步鉴定。
实验材料和方法：1. 实验材料，革兰染色试剂（碘液、靛洋红、洗涤液）、玻璃片、无菌吸管、显微镜、革兰氏阳性菌培养液、革兰氏阴性菌培养液。
2. 实验步骤：（1）取一张无菌玻璃片，用无菌吸管分别取革兰氏阳性菌培养液和革兰氏阴性菌培养液滴于玻璃片上。
（2）将玻璃片放在火焰上加热，使细菌液均匀分布在玻璃片上。
（3）用吸管滴加碘液，静置1分钟后倾倒干净。
（4）用吸管滴加靛洋红，静置1分钟后用水冲洗干净。
（5）将玻璃片挂在显微镜载玻片上，用100倍镜观察。
实验结果：在显微镜下观察，革兰氏阳性菌呈紫色或蓝紫色，球菌呈葡萄簇状，链球菌呈链状排列；革兰氏阴性菌呈红色或粉红色，杆菌呈杆状或弯曲状排列。
实验结论：通过本次实验，我们成功地进行了革兰氏染色，观察到了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在染色后的形态特征。
革兰氏染色是一种简单而有效的细菌初步鉴定方法，对于临床医学和微生物学研究具有重要意义。
实验注意事项：1. 实验过程中要保持玻璃片的无菌状态，避免外界污染。
2. 染色试剂的使用要按照规定比例和顺序进行，避免试剂浓度不足或过高影响染色效果。
3. 在观察细菌形态时，要注意调节显微镜的焦距和光线，以获得清晰的观察效果。
4. 实验结束后，要及时清洗实验器材，保持实验台面的清洁。
总结：革兰氏染色实验是微生物学实验中常用的一种方法，通过本次实验的学习和实践，我们对革兰氏染色的原理和步骤有了更深入的理解，并且掌握了正确的操作技巧。
革兰氏染色在细菌鉴定和临床诊断中具有重要的应用价值，希望通过今后的学习和实验，能够进一步提高自己的实验操作能力和科研水平。
