9.4 层析分离法

第三章层析分离法1. 主要教学目标：学习和掌握柱色谱、纸色谱和薄层色谱法的原理、技术和应用。

2. 教学方法和手段：采用板书及与多媒体课件相结合，课堂上师生互动，采用启发式和提问式的教学方式，并且课堂上学习的表现记入学生的平时成绩。

3. .教学重点及难点：柱层析及基本理论；纸色谱色谱法又称层析法，是一种广泛应用的分离方法。

色谱分析法是在1906年由俄国植物学家Tsweet首先系统地提出，他将叶绿素的石油醚液流经装有CaCO3的管柱，并继续以石油醚淋洗时，发现由于CaCO3对于叶绿素中各种色素吸咐能力的不同而使它们彼此分离，于是管中出现不同颜色的谱带，如图3─1所示。

图3-1 Tsweet的色谱工作图尤如光谱一样，这样就有可能对它们进行定性分析和定量测定，于是他将这种彩色分层物定义为层析谱，而将这种分析方法称为色谱分析法。

色谱法(Chromatograph)这—名词是由希腊字“Chroniatus”(颜色)和“graphein”(记录)二字合并而成。

并发表了“植物界的色素”专论。

到1931年，Kuhn和Leaerer又成功地适用Tsweet的方法分离了植物的色素，才使这一方法得到公认和广泛应用。

1935年人工合成离子交换树脂后，为离子交换色谱的广泛应用提供了物质基础。

1938年苏联的Izmailo等创立了薄层色谱法，主要是用于药物分析，应用于无机物分析则是50年代末才开始的。

应用于稀土元素的分离是1964年由Pterce开始的。

1941年Martin和Synge首先介绍了分配色谱法，并将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，使色谱方法在理论上向前推进了一步。

1944年Consden，Cordon和Martin首先开始了纸色谱法，Martin和Synge并用此法成功地分离了氨基酸的各种成份，获得1952年的诺贝尔奖。

1947年美国的Boyd和Spedng等人发表一系列论文，报告他们应用离子交换色谱法分离裂变产物和稀土元素混合物的情况。

层析分离法《层析分离法》是一项重要的实验分析技术，它可以用来分离和鉴定物质，这种技术被广泛应用于化学分析领域，被用于分离，鉴定和测定物质的组成成分和反应产物。

种技术已被广泛应用在食品、药品安全检测，环境污染监测以及材料表征等领域，因其分离准确、选择性强以及分析时间短等优点，在分析领域具有重要的地位和价值。

层析分离法的基本原理是利用空间分离原理，将能够在特定空间内运动的物质分离出来。

它的空间分离原理是基于物质不同的流体性能，将物质经过预先混合的流体层，然后在某一特定的体积内分道扬镳，从而实现物质的分离。

析分离技术可以有效地分离物质，使得混合物中的组分被完全分离，这种分离准确度非常高，可以达到99%以上，且可以在实验条件下进行重复性实验，更容易获得准确的结果。

层析分离法的基本工艺流程是：先将原料溶液进行调节，利用离子交换和混合，然后将上述溶液注入层析柱中，利用不同流体在层析柱中的运动特性，分离出混合物中的组分，然后使用检测仪器进行定量或定性分析。

在层析分离法分离鉴定时，可以根据不同分析需要，选取不同的柱材料和溶剂，以实现不同的分离结果。

比如，选择极性分子容易沉淀的柱材料和溶剂，可以有效地实现有机物的选择性分离。

另一方面，将非常稳定的离子溶剂和非极性柱材料结合应用，可以有效地实现无机盐类混合物的分离及鉴定。

层析分离法有一定的局限性，最主要的限制是柱材料的种类有限，而且这种方法只能分离出混合物中较大的分子，而小分子可能无法有效地分离出来。

此外，由于溶剂的不稳定性，柱材料的运动可能会受到影响，导致测定结果的不准确。

总之，层析分离法是一种广泛应用的实验分析技术，它的优点是分离准确、选择性强以及分析时间短，可以用于分离，鉴定和测定物质的组成成分和反应产物。

但是，这种技术也有一定的局限性，比如柱材料种类有限，溶剂的不稳定性等。

所以，在应用层析分离技术时，要根据实际分析需要，综合考虑和选择合适的材料，确保测定的准确性。

层析分离技术层析分离技术是一种重要的分离方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。

它基于物质在不同相之间的分配差异，通过多次分配和分离步骤，将混合物中的组分分离开来。

本文将从层析分离技术的原理、类型和应用方面进行介绍。

一、层析分离技术的原理层析分离技术基于物质在不同相中的分配差异，利用不同相中物质的亲疏水性、极性、分子尺寸等特性进行分离。

其原理可以概括为：当混合物通过固定相（静相）时，不同组分会因其与固定相的相互作用力不同而以不同速度通过固定相，从而实现分离。

1. 柱层析：柱层析是最常见的层析分离技术，其主要包括液相层析和气相层析两种形式。

液相层析是在液相中进行分离，常见的有凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等；气相层析则是在气相中进行分离，常见的有气相色谱层析、气体吸附层析等。

2. 纸层析：纸层析是一种简单易行的层析分离方法，主要用于分离和鉴定有机化合物。

通过将样品溶液滴到纸上，然后在纸的一端浸入溶剂中，溶剂在纸上上升时，样品中的组分会因其与纸或溶剂的相互作用力不同而以不同速度迁移，从而实现分离。

3. 薄层层析：薄层层析是将样品溶液均匀涂布在薄层层析板上，然后将其浸入溶剂中进行分离。

薄层层析具有操作简便、分离效果好的特点，广泛应用于药物分析、天然产物分离等领域。

三、层析分离技术的应用1. 生物化学：层析分离技术在生物化学研究中得到广泛应用，如蛋白质纯化、核酸提取、酶活性分析等。

2. 药物分析：层析分离技术是药物分析中常用的方法之一，可以用于药物的纯化和分离、药物代谢产物的分析等。

3. 环境监测：层析分离技术可以用于环境中有机物、无机物和杂质的分离和测定，如水质检测、土壤污染分析等。

4. 食品安全：层析分离技术在食品安全领域也有广泛应用，可以用于食品中有害物质的检测和分离，如农药残留、重金属含量等。

层析分离技术作为一种重要的分离方法，具有原理简单、分离效果好、应用广泛的特点。

通过不同类型的层析分离技术，可以实现对混合物中不同组分的高效分离和纯化。

层析分离法的基本原理层析分离法，听起来挺高大上的，其实说白了，就是一个分开混合物的聪明办法。

想象一下，咱们在厨房里做饭，油和水总是爱分开，层析分离法就是利用这种原理，把不同的东西分开。

这个方法特别适合那些复杂的混合物，比如药品、食品或者天然产物。

它的原理可以说是相当简单，关键在于不同成分的移动速度不同。

就像咱们走路，穿高跟鞋的和穿运动鞋的，走的速度可是天差地别。

说到层析，就不得不提“固定相”和“流动相”这俩个小伙伴。

固定相就像是站在路边的朋友，牢牢地站在那儿不动；而流动相则像是开着车飞驰而过的你。

在分离的过程中，不同的成分在这两者之间进行“争夺战”。

有些成分喜欢固定相，觉得在那儿待着舒服；有些则更喜欢流动，相当于追逐速度的感觉。

经过一番较量，大家都各自找到自己的位置，最终分开了。

这过程就像是生活中那些有趣的小插曲。

比如说，有的人在聚会里总是抢风头，像是极具存在感的流动相；而有的人则安静地待在角落里，默默地吸引着注意，就像固定相。

层析分离法的美妙之处就在于，这种“争夺战”能够让我们看到原本混杂在一起的成分，瞬间变得井然有序。

说到底，科学就是要把混乱变得条理分明，让我们能够一目了然。

层析分离法有很多种类，像气相层析、液相层析等等。

气相层析就好比你在马路上开车，而液相层析则像是在水上划船。

每种方法都有自己的“个性”，有的快速，有的精细。

气相层析适合一些挥发性较强的物质，就像你在煮水时蒸汽迅速跑出来；液相层析则能处理那些不容易挥发的东西，像是你用水煮的食材，慢慢渗透。

层析分离法的应用可谓是无处不在。

药物分析、环境检测、食品安全等领域都少不了它的身影。

比如说，想知道一块巧克力里到底加了多少可可，层析法就能帮你搞定。

想象一下，咱们吃着巧克力，心里却不知道它的成分，真是吃不安心！而层析分离法的到来，让这一切变得透明，变得明了。

它不仅能帮我们了解成分，还能提高产品的质量。

比如在制药过程中，层析法可以用来提纯药物，确保咱们吃进去的药是安全的。

Ft V R R •=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。

按固定相的基质（载体）类型分类：层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。

色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。

也有人将层析称为色谱。

用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。

层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。

高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。

色层分离过程包含两部分：●固定相：载体或载体+功能基团●流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。

液相色谱的基本原理和参数●保留时间(t R )和保留体积(V R )从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t R 表示。

在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V R 表示。

理论塔板数的计算公式为：2)(σRt N =容量因子k ' 和平衡常数K某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。

而平衡常数K 为平衡时，物质在两相的浓度比：)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量=)/)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度（物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。

于是有 溶质在固定相停留的时间分数= '1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：)'11(k u u m b += 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比： Ro R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时，m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+='0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率： 塔板高度（H ）和塔板数（N ）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。

9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。

所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。

当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。

与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。

反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。

分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。

按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。

将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。

改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。

亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。

具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。

亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。

亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。

2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。

主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。

不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。