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北京大学科技成果——重组水蛭素成果简介水蛭是我国传统中药，1800年前《神农本草经》中就有记载。
中医认为它有破血、逐瘀、通经的疗效，主要用于治疗瘕症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤。
西方也常用水蛭吸血以治疗某些疾病。
从水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分，水蛭素是其中活性最显著并且研究最多的一种成分，它是由65-66个氨基酸组成的小分子蛋白质（多肽）。
水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。
动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。
此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。
与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。
水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。
在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。
研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。
它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。
水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。
动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。
半致死剂量LD50>50mg/kg，远大于治疗所用的剂量（1mg/kg）。
尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。
水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何口服中药水蛭提取液仍然有疗效的原理。
聚乙二醇在药物制剂中的应用聚乙二醇别名聚氧乙烯醇或聚氧乙烯二醇，系环氧乙烷与单乙二醇（或双乙二醇）在碱性催化剂催化之下聚合而成，分子质量因聚合度不同而异，通常在200～35 000之间，PEG 的性质随分子质量而变化，目前常见的PEG种类有PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000等。
药物溶剂PEG200、PEG300、PEG400、PEG600 系无色、略有微臭的粘性液体，化学性质稳定，安全低毒，故常作为药物的溶剂。
另外，为了增加难溶性药物的溶解度，常使用潜溶剂即乙醇、甘油、丙二醇、苯甲醇、聚乙二醇等与水组成的混合溶剂。
用于软胶囊剂软胶囊剂的囊材多以一定比例的明胶、增塑剂和水等组成，因此对蛋白质性质无影响的药物和附加剂均可填充。
如各种油类、液态药物、药物溶液、药物混悬液和固体药物等。
由于低分子质量PEG 能与水混溶，故是水溶性药物和某些有机药物很好的溶剂，如硝苯地平软胶囊。
目前，软胶囊剂多为固体药物粉末混悬在油性或非油性（PEG400 等）分散介质中包制而成。
另有报道，水合氯醛应用聚乙二醇作为溶剂可大大降低它对明胶蛋白的分解作用用于注射剂由于PEG200～PEG600 可提高难溶性药物的溶解度且对水不稳定药物有稳定作用，故可作为注射用溶剂。
单一以PEG 作为注射用溶剂的注射剂并不多见，如噻替哌注射液以PEG400 或PEG600作为溶剂，可避免噻替哌在水中的聚结沉降作用；盐酸苄去氢骆驼莲碱注射液以PEG200 作为溶剂，安全稳定，贮放2 a 保持不变。
但一般多用混合溶剂（潜溶剂），如以V (PEG300): V(苯甲醇): V (丙二醇) = 80:5:15 时可作为质量分数为5 % 黄体酮或睾丸酮注射液的混合溶剂，此 2 种注射液经肌肉注射后，与体液接触即在局部析出药物沉淀，形成药物仓库，逐渐从组织中释放，具有长效作用，售商品有病毒灵注射液、安乃近注射液、痢菌净注射液、穿心莲注射液、菌毒杀星注射液等。
PEG修饰蛋白药物关键质控方法研究PEG修饰蛋白药物是一种常见的药物改良技术，它通过将聚乙二醇（Polyethylene glycol，简称PEG）共价地结合到蛋白质分子上，形成PEG蛋白复合物。
PEG修饰蛋白药物具有一定的优点，如延长药物在血液中的半衰期，增强溶解度和稳定性，降低免疫原性等。
然而，PEG修饰蛋白药物的质量控制对保证其药效和安全性至关重要。
本文将介绍PEG修饰蛋白药物关键质控方法的研究内容。
首先，对于PEG修饰蛋白药物的关键质控方法之一是蛋白质的PEG化程度的测定。
蛋白质的PEG化程度对其药效和稳定性有重要影响。
通常可以利用高效液相色谱（HPLC）技术或电泳技术来测定PEG化程度。
HPLC技术常用于测定PEG蛋白复合物中PEG的相对含量。
通过校正标准曲线，可以计算出样品中PEG的含量。
电泳技术则可用于测定PEG化蛋白与非PEG化蛋白之间的分子量差异，从而确定PEG化程度。
其次，PEG修饰蛋白药物关键质控方法的另一个方面是蛋白质的稳定性和活性检测。
PEG修饰可以改变蛋白质的结构和功能，因此需要对其稳定性和活性进行验证。
可以使用圆二色光谱（CD）、荧光光谱等技术来研究蛋白质的二级结构和三级结构的变化。
此外，可以使用酶活性测定、生物活性测定等方法来验证蛋白质的功能是否受到PEG修饰的影响。
此外，PEG修饰蛋白药物的质控方法还包括纯度和杂质的检测。
蛋白质的纯度是指样品中目标蛋白质的含量，常用的方法有SDS-、HPLC、质谱等。
杂质的检测包括有机杂质和无机杂质的检测。
有机杂质包括溶剂残留、杂蛋白等，可以通过液相色谱（LC）或气相色谱（GC）方法进行分析。
无机杂质如重金属离子等可以使用质谱等技术进行检测。
最后，PEG修饰蛋白药物的关键质控方法还包括溶解度和稳定性的研究。
由于PEG修饰可以增加蛋白质的溶解度，因此需要研究PEG修饰对蛋白质溶解度的影响。
稳定性是指蛋白质在制剂中的长期稳定性，包括在贮存和运输过程中的稳定性。
PEG的修饰作用京江学院药物制剂0702 3071158037 赵艳华摘要：聚乙二醇修饰即PEG化，是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。
自Davis1977年首次用PEG 修饰牛血清白蛋白以来，PEG修饰技术广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，多个PEG修饰药物上市或在临床研究中。
PEG修饰具有半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等。
关键词:PEG(聚乙二醇)；修饰高分子聚乙二醇（PEG）由于其毒性小、无抗原性、具有良好的两亲性，且生物相容性已获FDA认可，对蛋白质的改造具有无可取代的优势。
聚乙二醇化修饰技术通过共价键，将聚乙二醇与被修饰药物耦联，改善药物的理化性质和生物学活性，这种技术现已广泛应用于蛋白质(肽类)、酶、抗体及小分子药物。
1 PEG化学结构及性质1.1 PEG化学结构结构式CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH1.2 PEG性质【1】聚乙二醇系列产品通常情况下溶于水和多种有机溶剂，不溶于脂肪烃、苯、乙二醇等，不会水解变质，有广泛的溶解范围和优良的相容性、很好的稳定性、润滑性、成膜性、增塑性、分散性等。
系低毒物质，且无刺激性，属非离子型聚合物。
2 聚乙二醇修饰剂根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。
根据被修饰化合物包括蛋白质、多肽、单克隆抗体分子片段、以及小分子化合物等的不同分子量大小、分子结构以及其理化特性，公司采取不同的聚乙二醇化技术方法对这些化合物进行修饰【2,3】。
2.1随机修饰随机修饰蛋白质多以赖氨酸的ε-NH2或α-NH2为修饰目标，由于赖氨酸在蛋白质内通常数量较多，这种修饰引起蛋白质中多个赖氨酸被修饰，得到的产物是聚乙二醇化修饰异构体的混合物，目前FDA批准的已经上市的聚乙二醇化新药多数为随机修饰的产物。
水蛭素剂型研究进展毛全高【摘要】Hirudin is the active ingredient of leeches,which has good anticoagulant and antithrombotic function.But because of its short half-life and bleeding risk in clinics, its application effect is not ideal, so some researches in new dosage forms of hirudin have been made.This article reviewed the ways of drug delivery and dosage forms of hirudin based on its pharmacological effects and clinical application,so as to provide a reference for further research and clinical application.%水蛭素是水蛭的活性成分，具有良好的抗凝血和抗血栓作用。
但由于临床应用中存在半衰期短、出血危险等不足，实际应用效果并不理想，因此一些水蛭素新剂型的研究也在不断进行。
现结合水蛭素的不同药理作用和临床应用对其给药途径及给药剂型进行综述，以期为水蛭素以后的研究和应用提供参考依据。
【期刊名称】《安徽医药》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】5页(P2250-2254)【关键词】水蛭素;药理作用;临床应用;给药途径;给药剂型【作者】毛全高【作者单位】如皋市人民医院药剂科，江苏如皋 226500【正文语种】中文水蛭是我国传统中药中常用的活血化瘀通经的良药，始载于东汉时期的药物学专著《神农本草经》。
水蛭素(hirudin)是存在于水蛭唾液腺里的一种重要活性成分，是由65～66个氨基酸残基组成的小分子单链环肽化合物，相对分子质量为7 000。
2020年第19卷第12期水蛭素抗肿瘤作用研究进展□薛雪梅赵永恒高小康孙荣进柯威【内容摘要】水蛭素是水蛭的代表性抗凝血成分，越来越多的研究发现水蛭素除具有抗凝血、抗血栓作用外，还具有多种抗肿瘤作用。
现对国内外近几年关于水蛭素抗肿瘤研究报道进行归纳与总结，以期为水蛭素抗肿瘤药效的开发与利用提供参考。
【关键词】水蛭素；抗凝血；抗肿瘤【基金项目】本文为十堰市科学技术局引导性科研项目（编号：19Y17）和湖北医药学院人才启动金资助项目（编号：2018QDJZＲ19）研究成果。
【作者单位】薛雪梅，赵永恒，高小康，孙荣进；湖北医药学院药学院【通讯作者】柯威，湖北医药学院第一临床学院一、水蛭药材介绍及水蛭素结构特点水蛭是水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman、柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体［1］。
20世纪中期，德国学者Markwardt 首先从水蛭唾液中分离提纯水蛭素。
之后人们陆续完成水蛭素的氨基酸测序、二级与三级结构分析以及利用PCＲ技术合成重组水蛭素。
水蛭素由65 66个氨基酸组成，相对分子质量约为7KD，其C端富含酸性氨基酸，而N端含有3对二硫键，并且密集迭绕成核心环肽结构，使得分子结构更加稳定。
重组水蛭素由基因工程方法合成，与水蛭素相比，重组水蛭素63位酪氨酸残基未被硫酸化，使得其与凝血酶亲和性下降，但其药理活性与天然水蛭素相似，而且产量高、运用更加广泛。
二、水蛭素抗凝血作用简介水蛭素被认为是目前最强的天然凝血酶特异性抑制剂，与肝素这一经典的抗凝血药物相比，水蛭素抑制凝血酶活性不依赖于任何辅助因子［2］，同时，水蛭素引起的出血或血小板减少等副作用明显少于肝素。
另有报道重组水蛭素在发挥抗凝血作用时不影响血小板功能，对血小板也没有直接作用［3］。
基于在抗凝血、抗血栓方面优异的药理特性，水蛭素成为目前唯一一种由FDA批准用于临床的动物来源抗凝剂［4 6］。
中 国 药 科 大 学 学 报Jo ur nal of China Pharm aceutical University 2001,32(3):310～312聚乙二醇修饰干扰素 2b的分离纯化和制备林碧蓉,姚文兵*,沈子龙,吴梧桐(中国药科大学生物制药学院,南京210009)摘 要 目的 建立聚乙二醇修饰干扰素 2b的分离纯化方法。
方法 运用Superdex75Hig hlo ad制备型凝胶色谱柱,以含0.15mo l/L N aCl的0.01mo l/L磷酸盐缓冲液进行洗脱,流速为1.5ml/min,检测波长为215 nm。
结果 各洗脱组分经SDS-P A GE检测呈单一条带。
聚乙二醇修饰干扰素 2b的蛋白回收率为36.5%,抗病毒活性回收率为4.3%,比活度为4.74×107IU/mg,是原形干扰素 2b的10.4%。
结论 这种方法可以用于制备聚乙二醇修饰干扰素 2b。
关键词 干扰素 2b;聚乙二醇修饰干扰素 2b;分离纯化中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:1000-5048(2001)04-0310-19 干扰素是人或动物细胞在病毒或其他抗原诱导下产生的一类糖蛋白。
目前,临床上应用最为广泛的是干扰素 2b,主要用于治疗慢性肝炎和毛细胞性白血病等病毒性疾病和肿瘤[1]。
但是,人重组干扰素 2b不具有天然干扰素的糖基化结构,生物半衰期短,产生中和抗体高,大大限制了其临床应用。
聚乙二醇修饰技术能够增强蛋白质类药物的稳定性,提高生物利用度,降低免疫原性。
目前,应用这项技术进行修饰的蛋白质类药物有天冬酰胺酶,超氧化物歧化酶,白介素-2等[2]。
本文利用制备型高效液相色谱技术,对单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺酯( -methoxy-po lyethy lene gly col- -N-succinim idyl carbonate,SC-mPEG)修饰干扰素 2b反应液进行分离、纯化,获得聚乙二醇修饰干扰素 2b。
（并购重组）重组水蛭素的聚乙二醇修饰重组水蛭素的聚乙二醇修饰李雪芹，候蓓蓓，赵军，田明玉，修志龙*大连理工大学环境与生命学院大连116024摘要：目的水蛭素因血浆半衰期短而严重限制了其临床应用，聚乙二醇修饰能有效地延长其半衰期。
本文通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率，从而得到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。
方法采用液相和固相修饰方法,用琥珀酰亚胺活化的PEG20kDa分别在pH6.0、8.0的条件下对水蛭素的His和Lys进行定点修饰；用SDS-PAGE分析产物的修饰度，并用离子交换柱对修饰后的产物进行分离，然后用凝血酶滴定法测定水蛭素单修饰产物的体外抗凝活性。
另外用分子动力学模拟方法预测了pH8.0条件下PEG修饰的位点。
结果在pH6.0、8.0的条件下，水蛭素单修饰率都高达90%以上，但二者的单修饰活性保留率相差较大。
在pH6.0时，液、固相单修饰活性保留率为34%、34.8%；而在pH8.0时分别为55%、96%。
结论在pH8.0条件下，采用“离子交换柱辅助”固相修饰的方法对Lys进行定点修饰能得到较高产率和较高活性保留率的单修饰产物。
关键词：重组水蛭素；SC-mPEG；抗凝活力；分子动力学模拟PEGylationofRecombinantHirudinLiXueqin，HouBeibei，ZhaoJun，TianMingyu，XiuZhilong* DepartmentofBioscienceandBiotechnology,SchoolofEnvironmentalandBiolo gicalScienceandTechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024,Chi naAbstract:OBJECT Hirudinisthemostpotentinhibitorofthrombinfoundinnatu re.Althoughhirudinhasthestrongestanti-thrombinactivity invivo,itsshorthalf-lifeinserumsignificantlylimitsitsclinicalanticoagulantapplication.Currently,PE Gylationiscommonlyusedasaneffectivemethodtoprolongitshalf-lifeinserum. OurobjectofexperimentistochoosethebestPEGylationmethodaccordingtoth emonoPEGylatedrecombinanth irudin’s purityandtheanticoagulantactivityi nvitro.METHODS Solutionmethodandsolidmethodassistedby“packed-bed ”andanionexchangecolumnwereusedtofavortheformationofmono-PEGylat edhirudin.ThemildacidicandmildalkalinePEGylationstrategywasusedtotarget HisresidueandLysresidueofhirudinrespectivelyusingSC-mPEG20kDa.Thepeg ylatedproductswereisolatedbyanionexchangechromatogram.SDS-PAGEwas usedtoanalyzethepurityofPEGylatedhirudin.Thrombinmethodwasusedtoana lyzetheanticoagulantactivityofPEGylatedhirudin.Moleculardynamicsmodelin gwasusedtojudgetheprobabilityofPEGylationsite.RESULTS Themono-PEGyla tedproductwithapurityofmorethan90%wasobtainedatpH6.0andpH8.0.Butal argedifferenceinanticoagulantactivityexists:theanticoagulantactivityofsoluti onandsolidmethodswere34%and34.8%respectivelyatpH6.0；55%、96%atpH8.0.CONCLUSION Solidmethodassistedbyanionexchangecolumnat pH8.0wasabetterstrategytogetmono-PEGylatedr-Hirudin. Keywords：recombinanthirudin；SC-mPEG；anticoagulantactivity；moleculardynamicsmodeling前言水蛭素是含65个氨基酸残基与3个二硫键的多肽，分子量约7000，是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂[1],而凝血酶诱发的血液凝固是诱导血管血栓形成的重要原因，因此水蛭素对各种血栓病均有疗效。
然而水蛭素有一些显著的药用缺点，如血浆半衰期较短，一般只有60-100分钟，患者需不断注射才能维持抗凝效果，导致治疗成本较高，且重复注射也会引起一些不良反应[2-4]。
上世纪70年代以来，人们发现一些蛋白经过PEG修饰后，很多方面的药用特性大大改善。
之后，人们开展了对于水蛭素的PEG修饰研究。
GeorgeC.Avgerinos[5]等人采用基因工程方法对水蛭素氨基酸进行改造，用甲基营养酵母Hansenylapolymorpha特异性表达了只含两个Lys的水蛭素，采用对硝基碳酸酯活化的PEG5kDa进行修饰，并设计了工业等级纯化步骤。
这种对水蛭素修改的方式可以大大提高修饰产物的专一性，但是研究周期性较长且须具备一定的科研条件。
国内也有关于水蛭素PEG修饰的研究。
于爱平[6]等人采用SPA-PEG5kDa修饰水蛭素II，采用SourceQ15离子交换柱凝胶柱分离修饰产物，发现三修饰产物活力大大降低，为原蛋白的33.5%。
秦海娜[7]等人采用羰基二咪唑法活化的PEG5kDa 修饰水蛭素，采用凝胶色谱方法崔修饰产物进行分离，虽水蛭素可与修饰产物分离，但是修饰产物之间未能分离开。
本实验组旨在通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率来找到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。
修饰位点选择了His和Lys；修饰方法选择了液相修饰和“填料辅助”、“离子交换柱辅助”两种固相修饰方法。
1材料基因工程重组水蛭素（r-Hir）购自大连高新生物制药有限公司；水蛭素变异体2购自重庆科润生物医药有限公司；SC-mPEG20kDa购自北京键凯科技有限公司2实验方法2.1水蛭素His位点的PEG修饰2.1.1液相修饰HV2与SC-mPEG20kDa以摩尔比1:1溶于0.2MpH6.0磷酸盐缓冲溶液中（PBS），在25℃中反应1.5h。
反应产物用HiTrapQHP进行线性梯度洗脱。
2.1.2“填料辅助”的固相修饰在pH6.0下，将20mMPBS与r-Hir:SC-mPEG以摩尔比1:3在Q-SepheroseFF 介质中充分反应，反应完成后装柱、梯度洗脱。
2.2水蛭素Lys位点的PEG修饰2.2.1液相修饰HV2与SC-mPEG20kDa以摩尔比1:3溶于0.02MpH8.0PBS中，在23℃下反应。
SC-mPEG分三等分三次加入，每次反应30min。
反应结束后样品立即用HiTrapQHP进行线性梯度洗脱。
2.2.2“离子交换柱辅助”的固相修饰4ml1.5mg/mlHV2溶液(溶于PBS20mM,pH8A液）与溶于4ml20mM,pH8PBS 中的SC-mPEG先后以1ml/min的流速上样于柱中，使二者在柱中充分反应后进行在线梯度洗脱。
3分析方法3.1SDS–PAGE参考文献[8]，15%浓缩胶、4%分离胶，采用含5%氯化钡的0.1M碘液对PEG 进行染色。
表1为水蛭素PEG各修饰产物的理论分子量，可结合电泳图确定洗脱组分成分。
3.2生物活性测定参照文献[9]的方法，采用凝血酶滴定法。
3.3组氨酸修饰产物含量检测利用SC-mPEG与r-Hir的His残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构体的含量。
3.4Lys修饰位点预测采用溶剂可及表面积作为判定赖氨酸残基修饰可能性的判断标准，运用分子动力学模拟的方法分析和预测液相和固相修饰的位点。
4结果4.1水蛭素His位点的PEG修饰4.1.1液相修饰4.1.1.1修饰产物的分离纯化液相方法制备的PEG化水蛭素采用离子交换柱进行分离纯化、SDS-PAGE法进行组分鉴定。
结合表1、图2可以推测出图1中峰1，2，3分别为二修饰产物、单修饰产物、单修饰产物。
通过积分法计算出图1中各峰的面积，从而得出出各产物的比例：峰1：峰2：峰3=4.74%：94.6%：0.66%，可见单修饰产物是主要的修饰产物。
4.1.1.2单修饰产物的体外抗凝活性测定采用凝血酶滴定法对修饰水蛭素进行活性检测。
图3显示峰2相对于未修饰的r-hirudin 其抗凝活性保留率为34%,而峰3的抗凝活性保留率为19.2%。
峰2具有较高的抗凝活性保留率，并且是修饰反应的主产物（峰2占修饰反应产物的94.6%）,因此被选作本文的目标单修饰产物做进一步的分析。
4.1.1.3His-修饰位置异构体含量测定利用SC-mPEG 与r-Hir 的His 残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构体的含量。
图4中，峰2的79.71%被中性羟胺断开为r-Hirdin,表明His-修饰位置异构体含量为79.71%，是在0.2MpH6.0PBS 中修饰反应的主要的成份。
4.1.2“填料辅助”的固相修饰4.1.2.1修饰产物的分离纯化对在pH6.020mMPBS,r-Hir ：SC-mPEG=1：3反应所得固相修饰产物，采用阶段洗脱的策略进行分离、SDS-PAGE 法进行组分鉴定。
如图5所示，峰1为盐浓度突然增大造成的紫外吸收的波动，峰2经电泳检测,如图6所示，分子量为约27KDa ，推断为单修饰产物，峰3经高效凝胶过滤检测，因其具有和标准重组水蛭素相同的洗脱体积，推断其为未反应的水蛭素。
4.1.2.2His-修饰位置异构体含量测定利用中性羟胺法对修饰位置异构体的含量进行检测。
