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293T人胚肾细胞说明书及注意事项1.简介：SV40 T-抗原的温度敏感基因后产生的高转染效率的衍生株，表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
在本库通过支原体检测。
在本库通过STR检测。
所有肿瘤细胞和病毒转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，操作者需注意自身防护。
基本培养条件:培养基：90％DMEM+10％胎牛血清温度：37℃气相：95％空气，5%二氧化碳2.细胞运输：本细胞为贴壁细胞，常规运输方式是将细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满新鲜的完全培养液并封好瓶口进行运输。
根据气温的高低及运输距离的远近，我们可能采取以下两种方式运输。
活细胞胰酶消化离心后血清发货；冻存管发货。
3.客户收到细胞后请严格按照以下要求进行操作。
3.1培养前的注意事项：A. 细胞出库前都是生长良好,我们会对出库细胞进行拍照留档(建议用户在收到细胞时拍照片,细胞拍照时请用100X 、200X倍数各拍上2~3张照片留存,可用作细胞状态的对比,拍摄的照片应当清晰)。
B. 用户在收到细胞后,先观察培养瓶是否完好,培养液是否外渗,培养液是否浑浊。
3.2新购细胞的初步培养：客户收到细胞后在未开封前,先用75％酒精将培养瓶外表擦拭干净,镜检细胞贴壁情况。
将细胞置于培养箱中进行1-2小时的缓冲，待细胞恢复基本生长状态后，进行后续细胞实验。
细胞恢复基本生长状态后，倒置显微镜下观察整个细胞生长情况：A. 细胞密度未达85％时，用75％酒精喷洒培养瓶后放在生物操作台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸取剩余培养液，只留6~8ml培养液继续培养。
B.细胞长满（达85-95％），即可进行传代。
3.3细胞培养：A.细胞密度未达85％时，5~8ml培养液继续培养。
B.培养基营养耗尽时，需及时换新鲜培养基；C.细胞长满（达85-95％），即可进行传代。
传代参考步骤如下：a.弃去培养液，用无钙镁D-PBS洗涤1-2次b.对于T25培养瓶来说，加入2-3ml 0.25%的胰酶-EDTA消化液，置37℃消化，并不时用显微镜观察细胞消化情况，如细胞回锁变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落，则迅速回操作台，加入6-8ml含10％血清的完全培养液，终止消化并轻轻吹打细胞，使其变成单细胞悬液。
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
精心整理293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
细胞的复苏：快速取出冻存的低代次293细胞，将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。
在超净工作台中，以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中，加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。
6～8h后待细胞贴壁更换培养基。
(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10mL培养基中和细胞消化液，培养6～8h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。
293t细胞滴度和纯度测定方法293T细胞是一种广泛应用于生物学研究的人类胚胎肾细胞系，通常用于表达外源蛋白，研究细胞信号转导、基因调控、病毒感染等领域。
在实验中，准确测定293T细胞的细胞滴度和纯度是非常重要的，因为这直接关系到实验结果的准确性和可重复性。
本文将介绍293T细胞的滴度和纯度测定方法，希望能对从事相关研究的科研工作者有所帮助。
一、293T细胞的细胞滴度测定方法1.1传统显微镜计数法传统的细胞滴度测定方法是使用显微镜和计数板进行细胞计数。
具体步骤如下：步骤一：取出培养好的293T细胞液体培养物，用1ml吸头吸取适量的细胞悬液。
步骤二：将适量的细胞悬液加入到计数板的计数室中，用显微镜在计数室内进行细胞计数。
步骤三：根据计数室内的细胞数量和计数室的体积，计算出细胞的浓度。
优点：传统显微镜计数法简单易行，对设备要求不高。
缺点：由于人为误差和计数室的体积测量误差，可能导致测定结果的不精确性。
1.2体积浓度计算法体积浓度计算法是通过测定一定体积内细胞数目来计算细胞的浓度。
具体步骤如下：步骤一：取出适量的细胞悬液，将其转移至离心管中，用离心机进行离心，将上清液倒掉，留下细胞沉淀。
步骤二：用PBS溶解细胞沉淀，使得细胞变成均匀悬液。
步骤三：取出一定体积的细胞悬液，用显微镜计数确定细胞数量，根据所用体积和细胞数量计算出细胞的浓度。
优点：能够减少计数室体积测量误差，提高测定精度。
缺点：需要进行细胞的离心和洗涤等操作，操作相对繁琐。
二、293T细胞的纯度测定方法2.1细胞表型鉴定法细胞表型鉴定法是通过观察细胞的形态特征、生长特性等来评估细胞的纯度。
具体步骤如下：步骤一：观察细胞的形态特征，包括细胞形状、大小、颜色等，正常293T细胞应该呈现规则的长梭形。
步骤二：观察细胞的生长特性，包括细胞的生长速度、聚集性等，正常细胞应该有较快的生长速度。
步骤三：确定细胞的纯度，如果细胞呈现异常形态或者生长速度缓慢，则可能存在杂质细胞。
293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。
3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。
293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。
293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。
293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。
一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。
一般用高糖的DMEM 培养基。
2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
293T细胞中包装慢病毒的方法慢病毒包装实验方案实验步骤一、细胞培养1、用含10% FBS的H-DMEM培养基于37 °C、5% CO2培养箱中培养293T细胞，其中加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10 μg/ml ciprofloxacin防止支原体污染，2、待10cm皿中细胞融合度到80%左右，用0.25%胰酶消化293T细胞，分到两个6cm皿中，另一盘10cm 293T作同样处理，使细胞在接种之后的18-24 h达到70%融合度。
●注意事项293T细胞转染慢病毒24h之前，培养液中停止使用抗生素和ciprofloxacin，减少对病毒转染的影响；注意接种后的293T细胞密度，过高和过低的细胞密度都会导致转染后细胞死亡。
二、细胞转染3、每个6-cm培养皿在转染之前4 h用5 ml 不含血清的H-DMEM培养基换液，4、应用500 μl Optimum和14.18 μl Lipofactamine2000混匀于室温静置5 min，将500 μl Optimum、1.7 μg 慢病毒载体、1.13 μg psPAX2和0.57 μg MD2.G混匀配制成DNA mixture，然后与静置 5 min的Optimum/Lipofactamine2000混匀，于室温静置20 min后，将混匀后的mixture加入到培养基中。
5、6 h之后将培养基更换为含10% FBS的H-DMEM完全培养基，6、分别收集48 h、72 h和96 h的细胞上清液。
●注意事项①293T细胞容易脱落皿底，加H-DEME沿皿侧壁缓慢加入，并且边加边轻微摇晃使培养基均匀分布皿底防止细胞无培养基死亡②质粒换算要准确，③将mixture加入培养基中要边滴边摇晃培养皿使其mixture与培养基混匀，这样直至结束。
细胞生物学杂志 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００９， ３１（１）： １３０ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｊｃｂ．ｏｒｇ
２９３Ｔ细胞的培养
细胞培养是目前极为普遍使用的研究手段。
目前国内很多实验室在细胞培养过程中会遇到各种问题，在很大程度上影响了研究工作的进展。
通过分析来电咨询中所提出的各种情况，我们认为有不少问题具有普遍性。
为此在这里开辟一个技术咨询的专栏，把我们的经验和技术手段与大家一起共享，共同探讨如何更好地解决细胞培养中的种种问题。
同时，欢迎广大读者把自己在工作中收获的点滴心得体会在这里与大家交流，以期共同提高。
本期向大家介绍如何养好２９３Ｔ细胞。
今后将陆续介绍各种常用细胞的培养要点。
欢迎读者提出有关细胞培养的各种问题，我们将组织有关的专家撰文作相关的解答。
－－－－－－－－－－编者
２９３Ｔ细胞是由２９３细胞派生， 表达ＳＶ４０大Ｔ抗原的人肾上皮细胞系， 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白， 或是用以包装病毒。
２９３Ｔ为贴壁细胞， 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为： 完全培养基： 高糖ＤＭＥＭ， １０％胎牛血清； 冻存液： 胎牛血清或完全培养基， １０％ ＤＭＳＯ。
传代方法为：
１．吸掉２９３Ｔ细胞培养瓶内的培养液；
２．吸取适量的无Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋的ＰＢＳ， 轻轻把贴壁的细胞洗两遍；
３．加少量的０．０５％胰蛋白酶－ＥＤＴＡ （一般２５ｃｍ２的培养瓶加１ ｍｌ， ７５ ｃｍ２的培养瓶加２￣３ ｍｌ）， 放到培养箱温育２０ ｓ；
４．细胞消化完毕， 加适量培养液终止消化， 并吹打细胞， 制成均匀的细胞悬液；
５．加足量的培养液， 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是， ２９３Ｔ细胞的贴壁性不强， 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以， 在更换新鲜培养液或者用ＰＢＳ冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去， 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候， 只需要用０．０５％胰蛋白酶－ＥＤＴＡ即可轻松把细胞消化下来， 不需要消化很长时间。
有些同学反映２９３Ｔ细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿１ ｍｌ移液枪反复轻轻吹打， 直至肉眼看不到大的细胞块为止， 然后加适量的培养液混匀， 这时候在显微镜下观察， 可见大多数细胞都是单个的， 只有少量的２￣３个细胞聚在一起。
一般２９３Ｔ细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到９０％融合， 再以１∶４￣１∶８的比率传代。
合适的传代周期为２￣３天。
传代过程中，消化的时间越短越好， 显微镜下观察到８０％细胞脱
落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前，应该把培养瓶或培养皿沿Ｘ、Ｙ轴方向水平移动几下， 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻２９３Ｔ细胞的冻存液可以用９５％小牛血清加５％二甲基亚砜， 复苏率很高。
２９３Ｔ细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转染的效率， 应尽量选择传代次数少， 培养总时间短的细胞。
从细胞形态上看， 相差显微镜下观察立体感强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很高。
虽然２９３Ｔ细胞的应用非常广泛， 几乎每个实验室都有一株自己的２９３Ｔ细胞株， 但是经常有同学提出： 为什么在正常的培养条件下， 细胞却很难传代下去， 包装病毒效率很低， 对转染效率也不满意呢？
事实上， 引起类似问题的元凶是一种生物界最小的原核细胞生物－支原体。
支原体污染后， 它们不会使细胞死亡而是与细胞长期共存， 培养基不发生浑浊， 细胞无明显变化， 外观上给人以正常感觉， 但事实上细胞正在受到到多方面影响， 如引起细胞变形， 影响ＤＮＡ合成， 抑制细胞生长等。
我们曾经收集到四株分别来自四个不同实验室的２９３Ｔ细胞， 经检测均为支原体阳性， 令人惊讶的是这四株细胞都已经不是典型的２９３Ｔ细胞形态， 每两株之间比较竟然形状各不相同， 很难相信这是同一种细胞！这些支原体阳性细胞普遍传代周期长， 显微镜下观察细胞碎片多， 长期支原体感染已经使这些细胞羸弱不堪， 胞内ＤＮＡ和蛋白质合成受到严重的影响。
因此， 有效地防治支原体污染， 杜绝交叉感染对提高实验效率， 稳定实验结果至关重要。
我们的经验是把防治支原体污染作为细胞培养的一项日常工作， 除了对细胞培养设备环境的清洁外， 还需在器材消毒， 操作员培训， 严格把关新引入细胞株的质量等方面做大量细致的工作。
（徐兰 刘敏英）。
