CRISPRCas9植物基因敲除

植物功能基因组研究中的基因敲除技术植物基因敲除技术是近年来植物功能基因组研究中的一项重要技术。

通过该技术可以精准地删去植物基因组中的某个基因，从而研究该基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。

下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的原理和应用。

一、植物基因敲除技术的原理植物基因敲除技术是通过基因编辑技术实现的。

目前主要有CRISPR/Cas9和TALEN两种技术用于植物基因编辑。

这两种技术都是利用人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA 序列，从而实现基因敲除。

先来介绍一下CRISPR/Cas9技术。

CRISPR是一种天然存在于细菌中的免疫系统。

通过CRISPR系统，细菌可以识别并摧毁侵入其体内的病毒DNA。

科学家们发现，CRISPR系统中有一种酶叫做Cas9，可以切割DNA序列。

利用人工合成的RNA序列，可以将Cas9定位到需要切割的基因上，并切割掉该基因。

这样就实现了精准的基因敲除。

TALEN技术原理类似于CRISPR/Cas9，也是通过人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA序列。

TALEN技术主要是利用一种叫做TALEN（转录激活样核酸酶）的酶来实现基因敲除。

二、植物基因敲除技术的应用植物基因敲除技术已经成为植物功能基因组研究中的一项重要技术。

它可以用于研究植物生长、发育和代谢等方面的功能。

以下是该技术的一些具体应用：1.研究基因功能植物基因敲除技术可以用于研究基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。

通过敲除某个基因，可以观察其对植物生长、发育和代谢等方面的影响。

这种方法可以帮助科学家们更好地了解植物基因的功能。

2.筛选基因植物基因敲除技术可以用于筛选植物基因。

在研究植物新陈代谢方面，需要筛选大量的植物基因，以了解这些基因在植物代谢中的作用。

植物基因敲除技术可以快速地筛选出与目标代谢过程相关的基因，从而加速研究进程。

3.改良植物品种植物基因敲除技术可以用于改良植物品种。

cas9基因敲除原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，可以通过切割DNA序列
来实现基因敲除。

CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，是一种天然存在于细菌和
古细菌中的免疫系统。

Cas9则是CRISPR-Cas9系统中所使用
的酶。

CRISPR-Cas9系统通过三个主要组件来实现基因敲除：CRISPR RNA（crRNA），tracrRNA和Cas9。

首先，crRNA
和tracrRNA结合形成一个复合体，被称为单导螺旋RNA （sgRNA）。

sgRNA可以与Cas9酶结合，并引导Cas9 酶与
特定DNA序列中的目标基因相结合。

当Cas9与sgRNA定位到目标基因的特定序列时，它会切割DNA，导致基因序列中的断裂。

细胞会试图修复这个断裂，
但通常会导致不完整的修复，从而引起基因缺失或突变。

这就实现了基因敲除的目标。

此外，通过供应外源的DNA修复模板，可以利用Cas9的断
裂修复机制来进行目标基因的修复。

这种方法被称为基因敲入，可以在目标基因上插入新的基因组成部分。

总而言之，CRISPR-Cas9系统利用Cas9酶和sgRNA的组合，定位和切割特定的DNA序列，实现了基因敲除和敲入的目标。

这项技术在基因研究和治疗领域有着广泛的应用前景。

高效的西瓜CRISPR/cas9基因敲除技术张倩倩，许勇，田守蔚（编译）（北京市农林科学院蔬菜研究中心北京100097）目的与意义：基因编辑技术在植物基因功能鉴定以及重要农艺性状突变获得方面具有重要应用价值。

CRISPR/Cas9基因编辑技术已应用于许多植物物种，成功实现了靶点突变。

然而，目前在西瓜上还没有CRISPR/Cas9基因编辑技术相关的研究报道，该技术能否成功应用于西瓜研究及育种仍未可知。

以西瓜的ClPDS 基因（编码八氢番茄红素脱氢酶，突变后植株有明显白化表型）为靶基因，尝试建立西瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系，以期利用该技术在西瓜基因组实现精准编辑。

材料与方法：以西瓜自交系‘PI179878’为供试材料，利用PEG 介导的原生质体转化方法测试靶点特异性与效率，利用农杆菌介导法转化西瓜子叶建立西瓜稳定遗传转化体系，利用酶切、测序等方法检测突变效率及突变类型。

结果与分析：（1）靶点选择与载体构建：选择西瓜PDS 基因ClPDS （Cla010898）作为Cas9核酸内切酶的靶基因。

在第1和第3外显子分别选择1个靶点，BanI 和XhoI 酶切位点分别在这2个靶点预测的切割位点上，有利于识别突变。

每个靶点的sgRNA 分别被克隆到以pGreen 为骨架的PHSN401载体中，命名为PHSN1和PHSN2，用于原生质体转化。

2个靶点同时被克隆到pCAMBIA 为骨架的PHSE401载体中用于农杆菌介导的西瓜遗传转化。

（2）CRISPR/Cas9介导西瓜原生质体ClPDS 突变：利用PEG 介导的原生质体转染检测靶点的效率，采用PCR/限制性内切酶（PCR/RE ）试验检测靶位点的突变并估计突变率。

PHSN1或PHSN2分别转染到西瓜原生质体细胞中，打靶效率分别为51.6和42.1%。

结果表明，构建的CRISPR/Cas9载体可在西瓜细胞中瞬时表达，Cas9/sgRNA 复合体可以高效地对这2个靶点进行打靶。

CRISPR/Cas9 基因敲除技术CRISPR （ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。

在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。

CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。

多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。

Biomics专注于RNA基因调控多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。

CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。

CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。

其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。

z CRISPR与RNAi的区别目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA，而CRISPR通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列，是可以遗传的。

由于编码mRNA的DNA序列只占总DNA的极少部分，因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多，更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。

植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是一种重要的遗传工程技术，它可以通过靶向编辑基因组来实现对特定基因的敲除，从而研究该基因在植物发育、生长、抗逆性等方面的功能。

以下是关于植物基因敲除技术的详细步骤：第一步：选择目标基因需要选择要进行敲除的目标基因。

这一步需要对目标基因的功能有一定的了解，通常会根据研究的目的和需求来选定目标基因。

选定目标基因后，可以进行接下来的技术操作。

第二步：设计CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是当前应用最广泛的基因编辑技术之一。

在进行基因敲除时，需要设计特定的CRISPR引导RNA（gRNA），使其能够与目标基因的特定序列结合，从而实现Cas9蛋白对目标基因的靶向切割。

设计gRNA需要考虑靶向性和特异性，确保其能够精准地引导Cas9蛋白对目标基因进行切割。

第三步：构建敲除体系在确定了CRISPR/Cas9系统的设计后，需要构建敲除体系。

这一步通常包括将设计好的gRNA序列与Cas9蛋白共转染进入靶向植物细胞中，以实现CRISPR/Cas9系统在目标基因上的导向切割作用。

构建敲除体系还需考虑到转染方法和适当的转染浓度，以确保CRISPR/Cas9系统的有效导入和作用。

第四步：筛选突变体在CRISPR/Cas9系统的介导下，目标基因会发生切割并可能导致突变。

在转染后，需要对植物细胞进行筛选，找到含有目标基因敲除突变的细胞。

通常，可以利用转基因技术将CRISPR/Cas9系统与荧光标记等标记基因结合，从而对转染细胞进行筛选，并分离出含有目标基因敲除的细胞。

第五步：验证敲除效果针对潜在的敲除植株，需要进行验证敲除效果的实验。

这一步通常包括对植株进行PCR、测序等分子生物学方法的检测，以确认目标基因是否已经成功敲除。

还可以利用基因组学方法进行更深入的敲除效果验证，确认目标基因的确已被成功敲除。

第六步：进行功能研究一旦确定了目标基因的敲除效果，接下来可以进行目标基因的功能研究。

基因特异性敲除技术及其在生物学中的应用随着科技的不断进步，人类在生物学这个领域取得了很多令人瞩目的成就。

其中，基因编辑技术就是最为引人关注的研究方向之一。

特别是在基因特异性敲除技术（CRISPR-Cas9）的出现后，这项技术的研究进展更加迅速，引起了国际学术界的广泛关注。

本文旨在介绍基因特异性敲除技术的原理和应用，以及它对生物学领域产生的重大影响。

一、基因特异性敲除技术的原理CRISPR-Cas9技术是一种高效、精准的基因编辑技术，可以在基因组特定的位点上切断DNA分子。

它的核心机制是利用特定的酶类蛋白Cas9和靶向RNA (sgRNA)识别、结合并切割DNA。

这样，就可以针对性地修饰或删除基因序列，实现对基因的特异性敲除。

其原理流程如下图所示：其最显著的优点是具有较高的精准度、灵活性和便捷性。

这种技术对于研究基因功能、药物研发以及植物、动物育种等方面都具有重要意义。

二、基因特异性敲除技术的应用领域1.基因功能研究CRISPR-Cas9技术在基因功能研究方面的应用最为广泛。

通过使用这种技术，基因研究人员可以针对感兴趣的基因进行敲除，然后观察到其是否影响生物的表型。

通过这种方法，可以确定这些基因对组织、器官或生物的哪些方面有影响，从而更好地理解生物的本质。

以肺癌相关基因Pten作为例子，科学家利用CRISPR技术在小鼠中敲除了Pten，结果发现小鼠出现了肺癌，这一发现引发了对Pten在肺癌发生中的重要作用的研究。

2.药物研发CRISPR-Cas9技术还可以用于药物研发。

通过基因编辑技术，可以制造被编辑的小鼠模型，模拟人类疾病，并通过筛选药物对其进行治疗。

例如，科学家使用这种技术制造了一种基于肝癌基因的小鼠模型。

通过使用这种模型，科学家可以尝试使用多种药物，并确定哪种药物是最有效的。

3.植物与动物育种通过CRISPR-Cas9技术可以敲除或编辑目标基因，从而改变作物和动物基因组中的性状、性质等特征，用于促进育种工作的进展。

CRISPR/Cas9敲除细胞系构建步骤及方法一、技术简介CRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，也是目前研究最热的基因编辑技术。

由于其具有构建方法简单快捷、基因修饰效率高、成本低廉、实验周期短、适用范围广等诸多优点，目前已成功应用于人类细胞、斑马鱼、大/小鼠等多种动植物的基因组精确修饰。

二、实验流程1. 预实验1.1 Cas9导入细胞方法：尝试各种方法，如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等，确定高效导入Cas9方法。

1.2 药物浓度预实验：降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。

1.3 单克隆培养情况：确认细胞是否可以单克隆培养。

2. 基因敲除（敲入）2.1 靶点设计：一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点，靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。

第一批合成构建3个，效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。

2.2 载体构建和病毒包装：根据预实验结果，选择合适的普通载体或病毒载体（普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体）。

2.3 内源活性筛选：转染细胞或感染细胞48h后，使用Puro或Blasticidin筛选48h，提取基因组DNA。

使用T7E1酶验证打靶载体的活性，将有效的突变型PCR产物测序验证。

2.4 Donor载体（基因敲入）：根据筛选的gRNA靶点位置，构建Donor普通载体或腺病毒载体，共转染/感染Cas9-gRNA和Donor。

2.5 单克隆筛选：无限稀释到每孔1个细胞的数量，每株细胞铺至少2个96孔板。

细胞数量足够后，验证内源活性并送测。

2.6 获得突变型：如需纯合子，则可能需要重复步骤3-5。

CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用CRISPR(clustered，regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats）是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。

在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。

目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。

Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。

Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

由于PAM序列结构简单（5’-NGG—3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。

CRISPR—Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1］.通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA （singleguideRNA).融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。

通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作［2，3］。

目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒，质粒构建流程如下：Cas9质粒构建pGK1。

1设计2条单链oligo序列；退火形成双链DNA将双链DNA连接到载体中转化G10competentcell筛选阳性克隆；测序验证序列；质粒大提；电转染靶细胞在细胞内crRNA识别靶位点,Cas9对靶位点进行随机剪切CruiserTM酶切细胞池，计算突变率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆；将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。

902021年 第1期CRISPR/Cas9基因敲除研究进展白祥慧（青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008）摘 要：功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步，基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。

基因敲除手段种类繁多，其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术，具有高效、便捷、精确等优点，在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。

随着科研工作的逐渐深入，CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。

文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用，为科研工作的开展提供参考。

关键词：CRISPR/Cas9；基因；敲除中图分类号：S 852 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2021）01-0090-03Research progress of CRISPR/Cas9 gene knockoutBai Xianghui(College of Life Science, Qinghai Normal University, Qinghai Xining 810008)Abstract: The development of functional genomics has promoted the development of gene knockout technology, which has made great progress from vector construction to cell screening to animal models. There are many kinds of gene knockout methods, among which CRISPR/Cas9, as a common gene editing technology, has the advantages of high efficiency, convenience and accuracy, making it widely used in the construction of models in agriculture, medicine and biology. CRISPR/Cas9 technology has gradually infiltrated the field of plant and microbial research as scientific work demands. In the paper, the application of CRISPR/Cas9 in recent years is briefly reviewed to provide reference for the development of scientific research.Key words: CRISPR/Cas9; Gene; Knockout收稿日期：2020-11-17作者简介：白祥慧，硕士在读，研究方向为动物生理。

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。

CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解,从而提供免疫性.原理此系统的工作原理是crRNA( CRISPR—derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA （trans—activating RNA ）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。

而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。

作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor)，能够共定位RNA、DNA 和蛋白,从而拥有巨大的改造潜力。

将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。

因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力.应用基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具.但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长,成功率受到多方面因素的限制。

即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。

2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同,是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。

CRISPR cas9基因敲除原理及其应用CRISPR Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是一种新兴的基因编辑技术，它利用CRISPR系统和Cas9酶实现对基因组的精确编辑。

本文将对CRISPR Cas9的基本原理进行详细介绍，并探讨其在生物学研究、医学治疗和农业育种等领域的应用前景。

一、CRISPR Cas9基因敲除原理CRISPR Cas9基因敲除是利用CRISPR-Cas9系统对目标基因进行精确编辑的一项技术。

CRISPR是细菌和古细菌天然免疫系统中的一种防御机制，能够通过记录并抵御外源DNA入侵来保护细菌免受病毒感染。

而Cas9是CRISPR系统中的核酸酶，具有裁剪并去除外源DNA的功能。

CRISPR Cas9基因敲除的基本步骤如下：1.设计合适的引导RNA（gRNA），通过与目标基因序列特异性结合，将Cas9酶精确引导到目标基因的靶位点。

2.Cas9酶与gRNA结合后形成复合物，通过靶向性的DNA酶切活性，在目标位点引发DNA双链断裂。

3.在细胞的DNA修复过程中，通过非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）机制，导致插入或缺失DNA碱基，从而实现基因的敲除。

二、CRISPR Cas9基因敲除的应用CRISPR Cas9基因敲除技术在生物学、医学和农业领域有着广泛的应用前景。

1.基因功能研究：通过敲除特定基因，科研人员可以深入了解该基因在生物体内的功能以及相关的生理和病理过程。

CRISPR Cas9技术的高效性和精确性使得基因功能研究更加便捷和可靠。

2.疾病治疗：基于CRISPR Cas9技术，科学家可以直接敲除或修复与疾病相关的基因突变，为基因治疗提供了新的途径。

例如，将CRISPR Cas9应用于肿瘤治疗，可以针对肿瘤细胞中的特定基因进行敲除，达到抑制肿瘤生长和扩散的目的。

CRISPR基因编辑技术在植物育种中的应用随着科技的飞速发展，基因编辑技术也逐渐成熟。

CRISPR-Cas9是目前最常用的基因编辑技术之一，其可用于植物、动物、甚至人类的基因修改。

本文将重点介绍CRISPR基因编辑技术在植物育种中的应用。

一、CRISPR技术简介CRISPR技术是一种基因编辑技术，其核心是CRISPR-Cas蛋白和RNA分子。

CRISPR-Cas9蛋白是一种免疫系统酶，可切割DNA链。

该技术利用RNA分子将特定的序列引导到需要修饰的基因上，然后CRISPR-Cas9将目标DNA切割，再由细胞自身修复机制修复，从而实现基因编辑的目的。

二、CRISPR技术在植物育种中的应用2.1 基因敲除CRISPR技术可用于对植物基因进行敲除。

通过RNA分子指导CRISPR-Cas9蛋白在目标基因上切割，从而使得该基因无法被转录和翻译，达到基因敲除的目的。

这一技术可用于植物基因功能研究，如对于特定基因进行敲除后观察植物的表型变化，从而了解该基因在植物中的功能。

2.2 基因修饰除了基因敲除，CRISPR技术还可用于基因修饰。

该技术通过RNA分子引导CRISPR-Cas9蛋白在目标基因上切割后，再将特定的DNA序列插入到切割口，从而修改了该基因的序列。

这一技术可用于制备转基因植物，并应用于植物品质改良。

如利用CRISPR-Cas9技术改善植物的香味、色素含量等性状。

2.3 基因定点突变CRISPR技术可实现基因定点突变，即只修改目标基因上的特定位点，而不影响其它部分。

这一技术可用于解决植物品种的特定问题，如增加植物的耐逆性、减少病害感染等。

三、CRISPR技术对植物育种的影响3.1 缩短育种周期传统育种方法需要长时间的育种期，而CRISPR技术在育种中的应用可显著缩短育种周期。

科学家们可利用该技术在短时间内筛选出具有优异性状的植物种子，从而加速植物育种进程。

3.2 提高较传统育种方法更高的育种精度CRISPR技术与传统基因编辑技术相比，具有更高的育种精度。

CRISPRCas9基因敲除技术是什么？
CRISPR/Cas9系统由核酸酶Cas9和单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA)组成。

Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域——RuvC样结构域和HNH结构域（RuvC结构域负责切割靶向链，而HNH负责切割与sgRNA互补配对的非靶向链），它可以在DNA的特定位置引入DSBs。

sgRNA来源于反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）和CRISPR RNA（crRNA）。

每个crRNA包含一个保守的与tracrRNA互补的重复序列和一个与外源DNA互补的20 nt的转录间隔区。

tracrRNA与crRNA互补后结合Cas9蛋白，形成CRISPR/Cas9-sgRNA复合物，在基因组的目标位点产生双链断裂。

图1. CRISPR/Cas9系统的结构成分
（Sun J et al. Brief Funct Genomics. 2020;
Liu C et al. J Control Release. 2017）
TracrRNA/crRNA通常被设计成单链小片段的向导RNA—sgRNA。

sgRNA主要包含两个关键片段：3'端的双股RNA结构与Cas9蛋白结合，5'端的引导序列与目标DNA序列结合。

与TALENs相比，CRISPR/Cas9具有成本低、效率高和简单易用等优势，因而被人们广泛应用。

下表所列为TALENs和CRISPR/Cas9两种技术的比较：。

植物基因敲除技术步骤植物基因敲除是一个复杂的过程，涉及精确地去除或改变特定基因的序列，从而阻断该基因的表达。

这一技术在植物研究和农业生物技术中非常重要，用于研究基因功能、改善作物性状等。

以下是基本的植物基因敲除技术步骤：1.目标基因的选择和设计：●首先，研究人员需要确定要敲除的目标基因。

●设计特定于该基因的导向序列，通常利用RNA指导的核酸酶（如CRISPR-Cas9系统）实现特定位点的切割。

2.构建敲除载体：●制备包含所需敲除序列的载体，这可能包括导向RNA（gRNA）和Cas9或其他核酸酶的编码序列。

●将这些构建克隆到合适的载体中，用于植物转化。

3.植物细胞的转化：●使用农杆菌介导转化、基因枪或其他方法将构建的载体转移到植物细胞中。

●在细胞内，导向RNA将核酸酶引导至目标基因的特定位置，导致DNA双链断裂。

4.筛选和培养转化植物：●筛选含有敲除构建的植物细胞。

●使用组织培养技术促进这些细胞的生长和分化，形成完整的植物。

5.分析和验证基因敲除：●对转化植物进行分子水平的分析，确认目标基因已被敲除或改变。

●这通常涉及PCR、序列测定和/或基因表达分析。

6.表型分析：●观察和记录敲除目标基因后植物的表型变化。

●这有助于理解该基因在植物发育或代谢中的作用。

7.进一步的研究和应用：●基于敲除结果，进行进一步的功能验证实验。

●在农业或生物技术中应用敲除技术，例如开发抗病或高产的作物品种。

植物基因敲除是一个高度技术化的过程，需要精确的设计和细致的实验操作。

随着基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的发展，这一过程变得更加高效和精确。

CRISPR/Cas9 基因敲除技术CRISPR （ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。

在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。

CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。

多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。

Biomics专注于RNA基因调控多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。

CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。

CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。

其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。

z CRISPR与RNAi的区别目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA，而CRISPR通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列，是可以遗传的。

由于编码mRNA的DNA序列只占总DNA的极少部分，因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多，更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。

植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是现代植物遗传学领域的一项重要研究工具，它通过利用CRISPR/Cas9等工具精确地切断植物基因，从而实现对植物基因组的精准编辑和改造。

下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的步骤，希望对您有所帮助。

植物基因敲除技术步骤一、制备CRISPR/Cas9载体1.选择合适的CRISPR/Cas9载体：首先需要确定用于植物基因敲除的CRISPR/Cas9载体，一般选择含有Cas9核酸酶、sgRNA以及适当的植物选择标记的载体。

2.将目标基因sgRNA序列插入载体：利用分子克隆技术，将设计好的sgRNA序列插入CRISPR/Cas9载体中，确保sgRNA能够专一且高效地识别目标基因序列。

二、转化植物细胞1.选择合适的植物材料：根据研究需要选择适宜的植物组织或细胞系，比如拟南芥、水稻、玉米等。

2.利用农杆菌介导转化技术：将制备好的CRISPR/Cas9载体利用农杆菌介导转化技术导入植物细胞中，促使其整合到植物基因组中。

三、筛选敲除突变体1.培养转化的植物细胞：将转化的植物细胞进行培养，培养条件包括合适的培养基、光照和温度等。

2.筛选突变体：利用PCR、Southern blot等技术筛选出含有目标基因敲除的突变植株，确认其为敲除突变体。

四、鉴定敲除突变体1.验证基因组序列：对候选的敲除突变体进行测序鉴定，确认目标基因已被成功敲除。

2.确认敲除效果：通过表型观察、生物化学分析等方法，评估目标基因敲除对植物的影响，确认敲除效果。

通过以上步骤，可以实现对植物基因的精准敲除，为研究植物基因功能、开发新品种以及改良农作物品质提供了重要的技术手段。

植物基因敲除技术的不断完善和广泛应用，将为农业生产和生物科学研究带来更多的机会和挑战。

植物基因敲除技术及应用介绍
基因敲除是对基因组进行定点修饰的一项新技术，利用基因敲除技术可以精确的定位到基因组的某一位点上，在该位点剪断靶标DNA片段，插入或敲除或定点修改基因片段。

通过基因敲除，特定的敲除某一基因、或者插入某一基因、或者定点突变使基因失活，可以最直接有效的研究该基因功能以及它对植物各方面性状的影响。

该技术的广泛应用将大大简化育种、降低遗传变异修复、及修复各类基因研究的工作难度。

植物基因敲除要做到使植物受体既保留原有优良性状，又获得新的优良性状，因此，稳定、高效的植物基因敲除、遗传转化服务对于研究来说至关重要。

CRISPR-Cas9系统是继锌指核酸酶(ZFNs)和TALEN核酸酶之后的另一个可精确定点编辑基因组DNA的新技术，具有设计构建简单快速等优点。

已在人类细胞系、斑马鱼、小鼠、果蝇和酵母等多个物种中利用。

最近，国内外研究人员纷纷利用CRISPR-Cas系统定点突变了水稻、小麦、拟南芥等多种作物的特定基因，都证实CRISPR-Cas系统能够用于植物的基因组编辑。

与ZFN 和TALEN 的设计复杂和各种实验室试验相比，crispr或许相对简单点。

crispr／Cas系统允许个性化的小的非编码RNA来介导靶标基因组DNA的切割，从而使基因能够通过非同源末端结合和同源接到的修复机制来修饰基因。

植物基因敲除应用范畴
基因功能分析：在个体水平研究基因的功能
定点突变：建立点突变克隆，可用于药物靶点研究。

启动子功能分析：该方法建立的启动子分析系统，可有效地分析内源性启动子的强度，是一种最理想的分析系统。

⼿把⼿教你学会CRISPRCas9基因敲除技术（需要挑选成对的靶点⼀般在正义链和反义链上分。

h ttp:///a/214091994_177233(需要挑选成对的靶点⼀般在正义链和反义链上分别挑选靶点配对)C RISPR/Cas 是进⾏基因编辑的强⼤⼯具，可以对基因进⾏定点的精确编辑。

在向导 RNA（guide RNA， gRNA）和 Cas9 蛋⽩的参与下，待编辑的细胞基因组 DNA 将被看作病毒或外源 DNA，被精确剪切。

⼀、寻找⽬的基因的靶标使⽤在线设计⽹站 CRISPR direct，如需直接复制⽹址，可在⽣物学霸后台对话框回复 direct即可。

靶点挑选要点：1. 基因敲除靶点应设计在起始密码⼦附近（包括起始密码⼦）或者起始密码⼦下游的外显⼦范围内。

2. 不同Cas9/gRNA 靶点在基因敲除效率上有较⼤差异，因此同时设计构建2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。

3. N1-N20NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较⼩。

设计好的靶点序列应在基因库中进⾏ BLAST 检测。

4. Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。

⼀般在正义链和反义链上分别挑选相距 20～30bp 的靶点配对。

多对靶点的敲除效率常有较⼤差异。

由于基因敲除实验时间长，在正式对⽬的细胞进⾏敲除前对靶点进⾏验证和挑选⾮常必要。

⼆、插⼊⽚段设计插⼊寡核苷酸序列设计（必须 PAGE 纯化寡核苷酸）：正向序列5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’反向序列3’TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’插⼊⽚段的合成1. ⽤⽔将寡核苷酸稀释为 100 µM。