a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验方案

实验：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用

背景资料

一、酶

酶（enzyme）催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。

1．高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；

2．专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；因此在食用酵素当今在功能上，主要有四种：高浓缩SOD酵素如复方天然酵素主要用于乳腺瘤、子宫肌瘤、卵巢囊肿等肿瘤方面；长生酵素直接补脾补肾补气血，全面调理；纤体酵素专门转化脂肪减肥；肠毒清酵素则专门清理肠皱褶的毒素。

3．多样性：酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。

4．温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的，因此，纯正酵素是中性的，温和的，不存在副作用，或“好转反应”。对于有刺激性而必然存的“好转反应”，除了本身腐败以外，也有可能有药品的添加。

5．活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。

6.易变性：大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏；

7.有些酶的催化性与辅助因子有关。

酶与无机催化剂的比较

酶 无机催化剂

相同点 1）改变化学反应速率，本身几乎不被消耗；

2）只催化已存在的化学反应；

3）加快化学反应速率，缩短达到平衡时间，但不改变平衡点；

4）降低活化能，使化学反应速率加快。

5）都会出现中毒现象。

不同点 1）酶具有高效性，催化效率比一般催化剂高出107-1013；

2）具有高度专一性，只对特定的一种或一类底物起作用；

3）更易受环境因素和生物体生理条件的影响，酶是蛋白质和核酸组成，易变性失活，所以酶在反应时不断产生和分解；

4）酶的催化活性是被调节控制的、有序进行的；

5）条件温和：常温常压，pH接近中性。

但酶易受环境影响而失活，包括温度、PH值等，例如一般来说动物体内的酶最适温度在35到40℃之间，植物体内的酶最适温度在40-50℃之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃。动物体内的酶最适PH大多在6.5-8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.8，植物体内的酶最适PH大多在4.5-6.5之间。 另外，反应中反应产物和酶的分工和回收困难等缺点限制了酶在工业上的广泛应用。

二、固定化酶及其应用

固定化酶（immobilized enzyme），就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。

固定化酶的形式多样，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产；或在反应器中进行批式搅拌反应；也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学；又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。现在又有人用酶膜（包括细胞、组织、微生物制成的膜）与电、光、热等敏感的元件组成一种装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息的传递及环境保护中有害物质的检测。最常用的是酶膜与离子选择电极组成的生物传感器，例如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成，脲经脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又继续被硝化菌氧化，总耗氧量则通过氧电极反映出电流的变化，用以计算脲的含量。

1、天然酶的缺点

（1）天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活

（2）溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本

（3）反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用

2、固定化酶的优缺点

优点 缺点

固定化酶 ①极易将固定化酶与底物、产物分开；

②可以再较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；

③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；

④酶反应过程能够加以严格控制⑤产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；

⑥较游离酶更适合于多酶反应；⑦可以增加产物的收率；

⑧酶的使用效率提高，成本降低。

① 固定化时，酶活力有损失；

② 增加了生产的成本，工厂初始投资大；

③ 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；

④ 与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；

⑤胞内酶必须经过酶的分离程序。

三、酶的固定法

1、吸附法

物理吸附法：将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂有机载体如纤维素，无机载体如活性碳、多孔玻璃等（酶与载体形成范德华力）备注：范德华力也叫分子间力。分子型物质能由气态转变为液态，由液态转变为固态，这说明分子间存在着相互作用力，这种作用力称为分子间力或范德华力。分子间力有三种来源，即色散力、诱导力和取向力。色散力是分子的瞬时偶极间的作用力，它的大小与分子的变形性等因素有关。一般分子量愈大，分子内所含的电子数愈多，分子的变形性愈大，色散力亦愈大。诱导力是分子的固有偶极与诱导偶极间的作用力，它的大小与分子的极性和变形性等有关。取向力是分子的固有偶极间的作用力，它的大小与分子的极性和温度有关。极性分子的偶极矩愈大，取向力愈大；温度愈高，取向力愈小。

离子交换法：利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团，与离子交换及形成离子键，而被交换结合到交换剂上）

2、包埋法（将酶包埋在多孔载体中，包埋成格子型或微胶囊性，常用载体：聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素、海藻酸钠凝胶）

包埋法的原理是将酶截流在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中。通过聚合作用或者离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截流。凝胶聚合物的网络可以阻止酶的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来。

3、载体结合法

最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。

4、交联法：是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。其中使用最广泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生反应，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。但是交联法中酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。

（后附酶的固定法详细介绍）

四种方法的比较

实验目的

1．能够制备固定化的α-淀粉酶

2．能够说出固定化的α-淀粉酶水解淀粉的测定的原理并且会独立操作此过程

实验原理

一、选择石英砂做吸附剂原因

1.石英砂本来是不带电的，其上之所以有电荷是因为：石英砂表面的硅原子水合后产生硅烷醇基团SiOH,硅烷醇基团可以通过摄入水体中的H+和OH-而带电：

SiOH+H+

当石英砂表面为SiOH2+，蛋白质在大于其等电点时，其带负电荷，被石英砂表面的正电荷吸附；但石英砂表面为SiO-时，溶液中的Ca离子就会起到桥联作用，在溶液中Ca离子存在以下平衡：

Ca(OH)+在吸附过程中起着至关重要的作用，它的多少决定了石英砂表面的负电荷的转化率的多少，也就决定了石英砂对蛋白质的吸附率的高低。当pH的值为11.00左右时，虽然石英砂表面的负电荷的转化率较低，但是溶液中负电荷大大增加，导致石英砂表面上的负电荷密度增加，这成为主导因素，会使Ca离子的平衡向左移动，Ca（OH）+也适当增加，石英砂表面的负电荷的转化率增高，表面逐渐带正电荷，蛋白质在大于其等电点时带负电荷，石英砂从而起到吸附蛋白质的作用。

2.石英砂外观呈多棱形、球状，，具有机械强度高、截污能力强、耐酸性能好等特点。石英砂滤料起到过滤作用，就像水经过砂石渗透到地下一样，将水中的那些悬浮的物阻拦下来，主要针对那些细微的悬浮物。

3.利用石英砂的理化性质，它不会破坏蛋白质的结构，即不会破坏酶的活性。.

二、淀粉酶

淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。（1）α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）； Ca2++OH- Ca（OH）+

Ca（OH）+ Ca(OH)2 → ← SiOH2+ +H2O

SiOH+OH- ← →SiO-+ H2O （2）β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α－1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α－1，4－glucan 4-glucanohydrolase）和 α－1， 4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1，4－glucan maltohydrolase）的名称等而被使用。

α-淀粉酶

α-淀粉酶（α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的α-1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。

1、性质和特征

1.1底物特异性

α-淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。

1.2最适 pH和最适温度

反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。

通常情况下α-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。真菌和细菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH为3，碱性α-淀粉酶的最适pH在9～12。另外，温度和钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的仅一淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有25℃～30℃，而最高的能达到100℃～130℃。另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响[12]。