实验一 淀粉酶活力测定
【目的要求】了解淀粉酶活力测定的原理，掌握其测定方法。
【实验原理】淀粉被淀粉酶水解，切断淀粉链的a—1，4-糖苷键，对碘呈蓝紫色的反应消失，这种呈色消逝的速度可以表示水解的程度，因而能衡量酶的活力。
【试剂和器材】
1．试剂
(1)碘原液 称取碘11g，碘化钾22g，加水溶解，稀释至500mL。
(2)稀碘液 取碘原液2mL，加碘化钾20g，稀释至500mL，此试剂随配随用。
(3)2％淀粉液 称取干燥过的可溶性淀粉2g，加5mL蒸馏水，搅拌混匀，再徐徐倾入70mI。煮沸的蒸馏水中。继续煮沸2min，冷却至室温，加入磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液(pH6)。
(4)磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)45.23g，柠檬酸(C6H8O7，·H20)8．068g，加水溶解，稀释至1000mL。
(5)标准比色液 称取氯化钴(CoCl2·6H2O)25g和重铬酸钾3.34g，溶解100 mL 0.01mol/L
HCl，其5倍稀释液作标准。
B 0.04%铬黑T
2．样品细菌口一淀粉酶。
3．器材电热恒温水浴；试管；量筒；吸量管(1mL)。
【操作方法】
1．取试管1支，加20mI。2％淀粉，混匀，在30℃水浴中，使管内温度达到30℃。
2．将淀粉酶0.5mL加到30℃的淀粉液中，混匀，在30℃C水浴中保温，自加入记时，经5min后取反应液l mL，加入盛有5 mL稀碘液的试管中。混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，记录反应进行的时间。
3．计算。在上述条件下，每1小时催化1mL2％可溶性淀粉水解的酶量，定为1个酶活力单位。
《生物化学与生化药品实验》102
实验103．1a一淀粉酶的活力测定
一、目的 了解并掌握一种旷淀粉酶活力测定的简便方法，测定a一淀粉酶分离纯化过程中每步的酶活力，并计算酶活力的回收。
选修1《生物技术实践》知识点归纳
实验1 大肠杆菌的培养和分离
1.微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生
物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，
有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核,只有一环状DMA分子
(拟核)。以分裂(二分裂)的方式繁殖,分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分
为革兰氏阳性菌(革兰氏染液染色后,再脱色处理,细菌仍保留染色液的颜色)和
革兰氏阴性菌两大类,区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性(细胞
壁薄,有荚膜)、兼性厌氧的肠道杆菌。
2.细菌的分离方法有两种:划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通
用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环
蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线,在划线的过程中菌液逐渐减少,细
菌也逐渐减少,。划线最后,可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培
养10~20小时后,一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞,形成菌落,不会重叠。
在斜面上划线,则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的
大肠杆菌的工程菌,可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌
的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因),如在培养基中加入一定量的氨
苄青霉素,由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因,所以在划线后只有存在抗
性基因的工程菌能生存下来。
涂布分离时,需要先将培养的菌液稀释,通常稀释10-5~10-7倍之间,然后取
0.1mL不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在
培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落，每个培养
基里有20个以内的单菌落为最合适。
优点：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂 。
在培养微生物时,必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的,各
种培养基也必须是无菌的,转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂
淀粉酶活性的测定
一、原理
淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中α－淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β－淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α－和β－淀粉酶。Α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。本实验采用加热钝化β－淀粉酶测出α－淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α＋β）比较，求出β－淀粉酶的活力。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。
（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴（37℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。
（三）试剂（均为分析纯）：1. 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；4.1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
淀粉酶测定（比色法）
本法是基于测定淀粉水解时生成的葡萄糖量来测知土壤的淀粉酶活性。
试剂
1）2%淀粉
2）甲苯
3）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。
4) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。
操作步骤
称取5g土，置于50mL三角瓶中，并加入1.5ml甲苯，15min后，注入10mL水和5ml2％淀粉溶液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
另设无基质和无土对照。
培养结束时，加入35ml水，迅速过滤至50ml容量瓶，并用水定容。从中吸取滤液1mL，注入25mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水定容至25mL，15min后在分光光度计上于波长508nm处比色。
每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定淀粉酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
结果计算
以5h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示淀粉酶活性（Suc）：
Suc＝a·V·n/m
式中：a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。
