淀粉酶实验方案
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淀粉酶发酵制备
一、实验目的
1.学习并掌握从大曲中分离产淀粉酶菌种的方法 1．学习并掌握液体摇瓶发酵法制备α-淀粉酶的工艺；
2．掌握α-淀粉酶酶活测定原理及方法。
二、实验原理
α-淀粉酶生产菌主要有芽孢杆菌和霉菌等。芽孢杆菌所产α-淀粉酶由于活
性高，发酵周期短，酶的耐热件高，尤其是枯草杆菌为大多数工厂所采用。 α-淀粉酶比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。β-淀粉酶与α-
淀粉酶相反，它不耐热但耐酸，70℃ 保温 15 min 可使其钝化。通常提取液中
α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在
70℃加热15 min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉
酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。另外，β-淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的
3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还
原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活
大小。
三、实验器材与试剂
1．实验器材
（1）烧杯，三角瓶，玻璃棒，试管，容量瓶、离心管、移液管。
（2）电炉（加热板）、高压灭菌锅、恒温水浴锅、摇床、离心机、电子天平。
2．材料与试剂 （1）菌种：大曲粉中产淀粉酶的菌种（经查资料为枯草杆菌）
（2）培养基：
1）斜面培养基：可溶性淀粉2%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，
pH 7.0-7.2。
2）种子液体培养基：可溶性淀粉1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0-7.2。
3）发酵培养基：葡萄糖 5%，豆饼粉5%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，无水
氯化钙0.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH7.0-7.2。
（3）酶活测定： 1）称取碘11 g，碘化钾22 g，加水溶解，稀释至500 mL。
2）标准稀碘液：取碘原液15 mL，加碘化钾8 g，定容至500 mL。
3）比色稀碘液：取碘原液2 mL，加碘化钾20 g，定容至500 mL。
4）2%可溶性淀粉：称取干燥可溶性淀粉2 g，先以少许蒸馏水混合均匀，再徐
徐倾入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸2 min，待冷却后定容至100 mL（此液当天配制使用）。
5）pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取Na2HPO4·12H2O 45.23 g，柠檬酸
（C6H8O7·H2O） 8.07 g，加蒸馏水定容至1 000 mL。
四、 实验方法与步骤
实验流程如下：
菌种平板分离→斜面种子制备→液体种子制备→摇瓶发酵→淀粉酶活性的
测定
1．菌种平板分离 （1）准备工作：
将实验所需培养皿10套一组用报纸包好，1mL刻度吸管，在高压灭菌锅内灭
菌121℃，30min湿热灭菌。
将制无菌水的试管各加入9mL蒸馏水，塞上硅胶塞，用报纸包好。按斜面培
养基配方配制实验所需的斜面培养基，一部分装于三角瓶中，用8层纱布加两层报纸包好。另一部分分装于试管中，装量为试管的1/4，塞上硅胶塞用报纸包好。
将无菌水试管、培养基试管和三角瓶进行121℃，30min湿热灭菌，灭菌后试管
摆斜面凝固好待用。
（2）倒平板：将灭好菌的培养基冷却到用手握瓶颈不烫手（或冷凉到50℃
左右，防止平板上凝结过多的水珠），开始倒平板，倒入量约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，待凝后即为平板。
（3）梯度稀释：在超净工作台中将大曲粉加到装有无菌水的三角瓶中使大
曲的菌分散于无菌水中。
（4）涂布分离：将事先准备好的无菌水试管按10-1、10-2……10-7标上序号，
吸取1mL菌悬液，以10倍稀释法稀释至10-7，然后取后3个稀释度的稀释液各0.1mL，分别接于事先倒好培养基平板上，每个稀释度做三~五个平板，用无菌涂
布棒将每个平板涂布均匀。
（5）培养：将涂布好的平板标上所接种的菌种浓度梯度序号，用报纸包好，
放到生化培养箱中37℃，湿度50%左右避光培养48h。
2.菌种斜面培养: 对于平板上长出的枯草芽孢杆菌单菌落进行描述记录，并同时制片镜检。然后选择不同型单菌落在超净工作台上在无菌条件下，用接种
环（针）挑取一环分离的菌种，分别接于斜面培养基中，用报纸包好，置37℃，
培养48h .
3．摇瓶种子培养
（1）培养基制作：按照摇瓶种子培养基配方配制所需培养基（液体种子的接种量为发酵液的10%），配制好后，按每只250mL三角瓶30mL进行分装，分装好后
用八层纱布上面附两层报纸用线绳扎口，放于高压锅中121℃灭菌30min。
（2）接种：用接种环从斜面挑取单菌落，在无菌条件下接入灭菌后的种子液体
培养基，37℃培养至对数期（大约12 h左右）。
4．液体培养基制备及接摇瓶 （1）发酵培养：发酵培养基配制及灭菌参考上述步骤，采用8层纱布。取斜面
菌种，去2~3环菌种接入灭菌后的发酵培养基中，37℃下培养48-72 h。转速
120r/min，
5．酶活测定
（1）粗酶液制备：取放瓶后发酵液适量，3000r/min离心10 min，取上清，即为待测酶液。
（2）方法,取5 mL 质量分数0.5%可溶性淀粉溶液,在37 ℃水浴中预热10 min,
加入适度稀释的粗酶液0.5 mL,37 ℃水浴震荡,准确反应5 min 后,用5 mL 0.l
mol/L H2SO4终止反应. 取0.5 mL 反应液与5 mL 稀碘液显色,在620 nm 处测光密度. 以0.5 mL 水代替0.5 mL 反应液为空白,以不加酶液（加同体积的缓冲
液）的管为对照. 酶活力根据以下公式计算:
酶活力（U）=（R0-R）×50×D /R0，
式中: R0,R 分别表示对照和反应液的光密度，
D 为酶的稀释倍数， 调整D 使（R0-R） /Ro 在0.2~0.7，酶活定义为在37 ℃,pH 6.0 条件下,
5 min 内水解1 mg 淀粉的酶量为1 个活力单位.
