优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌

尼罗红荧光染色法的优化及应用石健;张雯婕;冯汛;胡雨婷;瑶池【摘要】The chlorella is screened as material to optimize Nile red fluorescent measure ,and it is used to trance the varia-tion on microalgae oil in sewage .The experiment finds out that the dye won’t work until microalgae is broken by ultrasonic , and the addition of DMSO will enhance fluorescence reaction .The optimization result isdetermined :VDMSO∶Vsewage = 1∶5 ,5 min broke cell by ultrasonic and dye 5min ,NR 1 .5 μg/mL .As to the application ,microalgae oil accumulation is only half compared to medium ,indicating that sewage is not conducive to microalgae oil accumulation ,and the best harvesting time is stationary phase ,when the yield and oil content reaches the highest of micro algae .%以自主筛选的小球藻为材料对尼罗红荧光染色进行条件优化，并用该方法追踪微藻在污水中的油脂含量变化。

实验发现，微藻只有经过超声波破碎，染色才会出现荧光，DMSO 的添加会增强荧光反应。

尼罗红-荧光光谱法测定亚心形扁藻油脂含量宋琪;李泉;邴欣;刘双;于道永【摘要】尼罗红-荧光光谱法能够快速地对微藻细胞中的油脂含量进行检测,但是该方法对所测微藻物种具有一定依赖性,在分析不同微藻细胞油脂含量前需要对测试条件进行优化.优化后的亚心形扁藻油脂含量分析条件为:藻液800×g离心5 min 去除培养基,用体积分数4％的二甲基亚砜(DMSO)水溶液重悬至OD750=0.3,尼罗红质量浓度0.8 μg/mL,避光40℃水浴恒温10 min,激发波长520 nm.发现亚心形扁藻在培养的对数生长后期油脂开始积累,稳定期后期油脂含量趋于恒定,优化后的尼罗红-荧光光谱法能够准确地检测亚心形扁藻生长过程中的油脂含量变化.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2016(041)010【总页数】4页(P98-101)【关键词】亚心形扁藻;尼罗红;荧光光谱法;油脂含量【作者】宋琪;李泉;邴欣;刘双;于道永【作者单位】中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580【正文语种】中文【中图分类】TS222;TQ646随着全球能源消耗量的不断增加，不可再生的化石能源日渐短缺，而使用化石燃料还会产生大量的CO2及硫、氮氧化物等有害气体危害环境。

生物柴油是一种通过甘油三酯或游离脂肪酸与短链醇的酯基转移反应或酯化作用形成的单烷基酯，它经过稍微改性或不改性就可以在传统的柴油机中使用[1]。

生物柴油由于环境友好及可再生性，成为较理想的替代能源之一。

微藻具有光合效率高、生长周期短、含油量高等优点，是生产生物柴油的理想原料[2]。

提高微藻油脂含量是降低生物柴油成本的重要途径，是微藻生物柴油产业化亟待解决的关键问题之一。

尼罗红和 BODIPY 荧光染料在微藻油脂含量测定中的应用郝翠翠;梁成伟;石蕾【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2017(34)1【摘要】In the face of energy crisis , using microalgae to produce biofuel and high value-added products has attracted great attention . Microalgae constitute a diverse group of microorganisms with advantages like fast and efficient growth .In addition, they do not compete for arable land and offer very high lipid yield potential .Microalgae are currently considered as the most promising alternative sources for the next generation of food , feed, cosmetics and renewable energy in the form of biofuel .Major challenges for the development of this resource are to select lipid-rich strains using high-throughput staining for neutral lipid content in microalgaespecies .Compared with traditional quality method, the fluorescent staining method is simpler , cheaper and easier to operate .In this article, the properties of fluorescent Nile red and BODIPY and the use of fluorescentfor lipid measurement in microalgae were summarized .%面对能源危机，利用微藻生产生物燃料及其相关高附加值产品引起了人们的极大关注。

快速高通量测定三角褐指藻油脂含量曹素娟;柳科欢;任玲萱;侯兴国;卿人韦;兰利琼【摘要】为了实现三角褐指藻细胞内油脂含量的快速高通量测定,探索了尼罗红荧光染色法检测其油脂含量的检测条件.采用96孔板并配合酶标仪考察三角褐指藻的预处理液的种类及其用量、染色液尼罗红的用量、染色温度、染色时间以及细胞浓度对荧光强度的影响,确立最优染色条件,并研究荧光强度与油脂含量之间的对应关系.结果表明,TritonX-100终浓度为0.05％时,通透效果最佳,每100 μL藻悬液中加3μL尼罗红染液(0.1 mg/mL),温度40℃,时间10 min,细胞浓度低于3×106个/mL 时,荧光强度(y)与油脂含量(x)之间呈现良好的线性关系:y=927.37x+15.913,R2=0.9247.方法优化后,90 min即内可完成对96个样品的处理及分析,极大提高了分析的通量.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(055)006【总页数】6页(P1331-1336)【关键词】三角褐指藻;高通量;油脂含量;尼罗红;荧光染色【作者】曹素娟;柳科欢;任玲萱;侯兴国;卿人韦;兰利琼【作者单位】四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064【正文语种】中文【中图分类】Q9451 引言近年来，由于化石燃料资源的日益枯竭，人类亟需找到替代品. 海洋微藻由于来源广泛、环境友好、可再生等优点吸引了越来越多人的关注. 目前生物柴油的来源主要有大豆、棕榈种子、菜籽油以及动物脂肪等[1-3]，但是这些仍然不能满足当前经济发展对生物柴油的需求，而且还存在与粮食作物竞争耕地的问题. 微藻具有生长周期短、可再生、不与粮食作物竞争耕地、生产的生物柴油清洁环保等特征，因此，利用微藻生产生物柴油日益受到关注. 尽管一些微藻如原始小球藻[4]、鞘藻属[5]、雨生红球藻[6]、杜氏盐藻[7]等可以高效地生产优质生物柴油. 但是微藻种类仍然非常有限. 如何从大量的微藻中快速高通量筛选出油脂含量高的藻种仍是一个亟需解决的问题. 目前，对油脂的定量测定主要采用的方法有Bligh-Dyer法[8]，简化重量法[9]，香草醛比色法[10]等，这些方法均需要提前将藻液离心冻干、反复萃取、旋转蒸发等，不仅需要的藻量较大，过程繁琐耗时，并且提取过程中所用的有机溶剂对人体有很大的危害性. 为了解决上述问题，实现油脂含量的快速高通量测定，本研究利用96孔板作为反应器并配合荧光染料、酶标仪测定，90 min内即可完成对96个样品的分析测定工作，极大地提高了分析的效率.尼罗红(9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one)是一种脂溶性的疏水性染料，能够与细胞内的脂类物质结合，在特定的激发波长下发射出橘黄色的荧光，因此常被用于哺乳动物、细菌、酵母、藻类等的油脂定量分析[11-13]. 经尼罗红染色的微藻细胞的荧光强度与细胞内油脂含量显著相关. 在定量分析中，尼罗红进入细胞与脂类结合以后，荧光强度的检测可以利用荧光分光光度计[13]、酶标仪[14]、流式细胞仪[15]等仪器. 采用酶标仪检测经尼罗红染色后细胞的荧光强度的方法，具有灵敏度高、操作流程简单、所需要的样品量少、一次可检测的多个样品等特点，利于产油微藻的快速筛选. 目前尼罗红染色富油微藻面临的主要问题是有些微藻细胞壁较厚，细胞通透性较差，油脂定量不准确. 通常可以采用物理方法如微波[16]、超声波[17]、化学方法如二甲基亚砜[14]或者TritonX-100等处理细胞，从而改善细胞的通透性.三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一种海洋硅藻，属于硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属[18]，是海洋硅藻研究的模式藻种. 三角褐指藻在对数生长期结束后开始积累油脂，油脂积累量可占细胞干重的20%～30%，应用前景非常广阔. 本文以三角褐指藻为研究对象，采用尼罗红荧光染色法，酶标仪检测，系统地优化染色条件，包括检测波长、预处理液的种类及其用量、尼罗红用量、细胞浓度、染色温度、染色时间、尼罗红用量等条件的优化，为微藻油脂的快速检测提供参考方法.2 材料与方法2.1 材料三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，编号为MACC/B288，来自中国海洋大学藻种种质库.尼罗红(Nile red)，购自索莱宝公司；丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、TritonX-100、甲醇、乙醇、异丙醇等均为分析纯.2.2 方法2.2.1 尼罗红母液的配制取一定量的固体尼罗红溶于丙酮中，质量浓度为0.1mg/mL，2～8 ℃避光保存.2.2.2 磷酸缓冲液(PBS)配方(pH 7.4) 称取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO43.5814 g，KH2PO4 0.272 g，溶于900 mL蒸馏水中，用1 M的盐酸调pH至7.4，定容至1 L，高压灭菌自然冷却后备用.2.2.3 藻种培养三角褐指藻采用常规方法培养，即高压灭菌的f/2培养基，培养温度(21±1) ℃，光照强度2500 lx，光暗比为12∶12(h∶h)，接种浓度(1.5～3.0)×105个/mL，每日摇动3～4次，并且随机调动三角瓶的位置使光照均匀，培养至对数生长期结束后开始取样.2.2.4 三角褐指藻生长曲线从接种日开始，于0～10 d，取三角瓶中细胞，进行细胞计数(B204LEDR生物显微镜)，绘制三角褐指藻生长曲线图.2.2.5 荧光光谱测定方法取96孔板(WHBA-96孔板)，在同一孔中依次加入80μL藻液、20 μL DMSO、2 μL尼罗红溶液，40 ℃避光染色10 min，采用全波长酶标仪检测(Thermo varioskan flash全波长酶标仪)，设置激发波长的范围为450～560 nm，发射波波长范围为510～720 nm.根据荧光光谱的扫描结果来确定最大激发波长和发射波长.2.2.6 染色条件的探索结合Chen[14] 等的方法和本实验室的研究经验，初始的染色条件为：取96孔板，每孔分别加入用水、PBS、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、DMSO、0.1%的TritonX-100处理的三角褐指藻悬液100 μL，除对照组为水，试验组采用浓度均为20%的透性化试剂[20, 21]，即各透性化试剂与藻液体积比为20∶80. 此外，为排除干扰，不加藻液的背景荧光值也分别测定.按每100 μL处理液加2 μL尼罗红母液，每个处理3个重复，40 ℃避光染色10 min，经酶标仪测定，实验结果为3个重复的平均值.采用单因素变量法，分别对每个参数进行优化.2.2.7 油脂含量的测定方法油脂的提取采用溶剂浸提法，取适量对数生长期结束后的三角褐指藻藻，分别稀释成0.5×106、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106 个/mL，分别取50 mL低温离心收集藻细胞，75 ℃真空干燥至恒重，将干燥的藻细胞移至研钵内充分研磨，然后将粉转至4.5 mL离心管内，并向离心管内加入2 mL石油醚∶乙醚(2∶1)进行抽提，在旋涡混匀器上振荡混匀，25 ℃浸提5～10 h，每30 min振荡混匀一次，加入1 mL10%的KOH溶液，振荡混匀，离心取上清至另一已称重的4.5 mL离心管中，旋转真空干燥仪中55 ℃烘干称重.2.2.8 数据处理方法所有测试都重复三次，数据统计分析采用SPSS17.0进行，采用均值±标准差(x±SD)为表示方法，不同样品之间的差异采用单因素方差分析进行比较，以P<0.05为有显著性.3 结果与分析3.1 三角褐指藻生长三角褐指藻在第5 d之前，后一天藻数目是前一天的约2倍，这是由于培养基中营养充足，藻的长势最佳(图1). 第0 d到第1 d由于藻种在新环境中需要一个适应期，所以几乎不会生长(藻数目由0.27×106个/mL上升至0.31×106个/mL)，第1 d至第2 d(藻数目由0.31×106个/mL上升至0.6×106个/mL，接近2倍增加)，第2 d至第3 d(藻数目由0.6×106个/mL上升至1.6×106个/mL同样接近2倍)，直到第5 d至第6 d(藻数目由5.67×106个/mL上升至7.12×106个/mL，增幅较小)，往后几天藻数目增幅越来越小，第5 d之后由于营养逐渐缺乏造成藻的生长速率变慢，对数生长期结束，后续实验样本采用接种第5 d后的藻.图1 三角褐指藻生长曲线Fig.1 The growth curve of Phaeodactylum tricornutum3.2 三角褐指藻尼罗红染色油脂的荧光光谱确定对尼罗红染色后的三角褐指藻进行荧光光谱扫描，获得荧光光谱扫描图.结果显示，尼罗红染色后的油脂最大激发波长为526 nm(图2)，最大发射波长为597 nm(图3). 尼罗红荧光染色法的最佳激发波长范围是450～550 nm，而最佳发射波长范围是540～605 nm[19]；而Ren[20]等的研究结果表明尼罗红染色法的最佳激发和发射波长分别为530 nm和568 nm；Siegler et al[21]的结果表明最适波长为527 nm和590 nm. 本文扫描波长的结果和前人的研究结果一致，这说明方法是可靠的.图2 最大激发波长扫描图谱图Fig.2 Maximum excitation wavelength scanning map图3 最大发射波长扫描图谱Fig.3 Maximum emission wavelength scanning map3.3 染色条件的优化3.3.1不同有机溶剂预处理对染色的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、2 μL尼罗红母液、40 ℃避光染色10 min条件下考察体积分数为20%的不同有机溶剂预处理对荧光强度的影响，结果见图4a.(a)(b)(c)(d)(e)(f)图4 三角褐指藻尼罗红染色法条件优化(a)注：对照组为水，试验组采用浓度均为20%, 不同字母表示差异显著(P<0.05)；(b)～(f)注：不同字母表示差异显著(P<0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)Fig. 4 Optimization of nile red dyeing method for Phaeodacylum tricornutumDifferent letters indicate significant differences (P<0.05)以水为对照，体积在藻液中占比均为20%的不同透性化试剂处理，检测荧光强度. 由图4a可知，与水和PBS相比，甲醇、丙酮处理的藻细胞荧光强度增加不明显，乙醇、异丙醇和DMSO处理的藻细胞荧光强度增加较明显，而荧光强度增加最明显的是0.1% TritonX-100处理过的藻细胞. 因此选择20%的TritonX-100(质量分数0.1%)作为藻细胞预处理液.3.3.2 0.1%的TritonX-100体积分数对染色的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、2 μL尼罗红母液、40 ℃避光染色10 min条件下考察不同体积分数0.1% TritonX-100对荧光强度的影响，结果见图4b.结果显示，0.1% TritonX-100体积分数从1%～20%，荧光强度依次升高，20%达到最大值(图4b). 低浓度的预处理液渗透性弱，因此在一定浓度范围内，随着预处理液浓度增大荧光强度也增大；20%～40%范围内，由于较高浓度的TritonX-100会对藻细胞产生毒性，因此荧光强度逐渐降低. 整体而言，20%的荧光强度最大，1%的最小. 因此， 0.1% TritonX-100最适体积分数为20%.3.3.3 不同浓度尼罗红对染色的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、0.1% TritonX-100体积分数为20%，40 ℃避光染色10 min条件下考察不同体积尼罗红母液对荧光强度的影响，结果见图4c.结果显示，0.1 mg/mL尼罗红丙酮溶液体积为0.5～3 μL时，荧光强度依次增大，3 μL时达到最大值，当尼罗红丙酮溶液体积超过3 μL时，由于高浓度尼罗红对藻细胞有一定的毒害性，荧光强度逐渐变小(图4c). 因此，优选尼罗红用量3 μL为最适用量.3.3.4 染色时间对染色的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、3 μL尼罗红母液、0.1% TritonX-100体积分数为20%，40 ℃避光染色10 min条件下考察不同染色时间对荧光强度的影响，结果见图4d.由图4d可知，当染色时间为3～10 min时，荧光强度依次增大，10 min时荧光强度达到最大；10～30 min，而随着时间的增加荧光逐渐淬灭，荧光值逐渐变小. 因此，仍优选10 min为最佳染色时间.3.3.5 不同染色温度对荧光强度的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、3 μL尼罗红母液、0.1% TritonX-100体积分数为20%，40 ℃避光染色10 min条件下考察不同染色温度对荧光强度的影响，结果见图4e.由图4e可知，当染色温度在20～40 ℃时，荧光强度逐渐变大，40 ℃时荧光强度达到最大，当染色温度为40～60 ℃时，由于高温影响了藻细胞活性，荧光值变小. 因此，后续实验仍选40 ℃时为最佳染色温度.3.3.6 不同浓度藻细胞对荧光强度的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、3μL尼罗红母液、0.1% TritonX-100体积分数为20%，40 ℃避光染色10 min条件下考察不同藻细胞浓度对荧光强度的影响，结果见图4f.由图4f可知，当藻细洗吧胞个数为1×106～3×106个/mL时,荧光强度逐渐增大，当藻密度为3×106个/mL时，荧光强度达到最大，当藻密度大于3×106个/mL 时，由于藻互相遮盖，造成染色不均匀，荧光强度逐渐降低. 因此，优选藻密度为3×106个/mL时为最佳藻细胞浓度.3.4 藻液油脂含量与荧光强度的相关性分析为了建立三角褐指藻的油脂含量与荧光强度之间的相关关系，分别采用上述优选的尼罗红染色法和溶剂浸提法，测定了在藻细胞浓度不同、藻液体积相同的条件下藻的荧光强度和油脂含量，对荧光强度(y)和油脂含量(x)之间进行回归分析，结果见图5.图5 藻液油脂含量与荧光强度的相关性分析Fig.5 Correlative analysis of oil content and fluorescence intensity of algae由图5可以看出，当荧光强度为0～140，细胞浓度为0.5×106、1×106、2×106、3×106个/mL时，其相关性较好，回归方程为y=927.37x+15.913，R2=0.9247,说明其相关性较好. 因此，可以利用尼罗红染色法快速检测三角褐指藻内油脂的含量.4 讨论尼罗红染色法为测定微藻细胞内油脂含量提供了一种便捷的方法，该方法最大的优势是高通量. 但是由于藻细胞外面的一层厚而坚硬的细胞壁，为油脂含量的测定带来了困扰，不经透性化试剂处理可能会导致油脂定量误差. 并且其他染色条件也影响检测效果，如染液浓度、藻细胞浓度、染色时间和温度等，因此优化各种染色条件对建立一种快速准确高效的方法具有重要价值. 经过透性化试剂处理，三角褐指藻荧光值在处理前后有了较大改变，其中其中20%体积比的TritonX-100(质量分数0.1%)的处理效果最佳. 推测透性化试剂，尤其是TritonX-100，改变了三角褐指藻细胞壁和细胞膜的通透性，提高了尼罗红对油脂的染色效果. 对其他影响如染液浓度、藻细胞浓度、染色时间和温度也进行了优化，极大地提高了染色灵敏度和准确度.综上，本研究采用96孔板高通量方法，尼罗红荧光染色，酶标仪快速检测，对染色条件进行了优化，建立了一种准确、快速高效、高通量的尼罗红荧光染色检测三角褐指藻油脂含量的方法，为进一步三角褐指藻的研究打下良好的基础，为其他微藻油脂的快速检测提供了参考方法.参考文献:【相关文献】[1] Felizardo P, Correia M J, Raposo I, et al. Production of biodiesel from waste fryingoils[J]. Waste Manag, 2006, 26: 487.[2] And M G K, Dalai A K. Waste cooking oil an economical source for biodiesel: a review [J]. Ind Eng Chem Res, 2006, 45: 2901.[3] Song D, Fu J, Shi D. Exploitation of oil-bearing microalgae for biodiesel [J]. J Biotechnol, 2008, 24: 341.[4] Miao X, Wu Q. Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil [J]. Bioresour Technol, 2006, 97: 841.[5] Sharif Hossain A B M, Salleh A, Boyce A N, et al. Biodiesel fuel production from algae as renewable energy [J]. Prep Biochem Biotech, 2008, 49: 250.[6] Razon L F, Tan R R. Net energy analysis of the production of biodiesel and biogas from the microalgae: Haematococcus pluvialis, and Nannochloropsis[J]. Applied Energ, 2011, 88: 3507.[7] Tang H, Abunasser N, Garcia M E D, et al. Potential of microalgae oil from Dunaliella tertiolecta as a feedstock for biodiesel [J]. Applied Energ, 2011, 88: 3324.[8] Bligh E G, Dyer W J. A rapid method of total lipid extraction and purification [J]. Can J Biochem Physiol, 1959, 37: 911.[9] 丛峰, 孙雪, 徐年军. 几种小球藻油脂含量检测方法的比较及优化[J]. 宁波大学学报：理工版, 2012, 25: 20.[10] Ahlgren G, Merino L. Lipid analysis of freshwater microalgae: a method study [J]. Arch Hydrobiol, 1991, 121： 295.[11] Genicot G, Leroy J L, Soom A V, et al. The use of a fluorescent dye, Nile red, to evaluate the lipid content of single mammalian oocytes [J]. Theriogenology, 2005, 63: 1181.[12] Kimura K, Yamaoka M, Kamisaka Y. Rapid estimation of lipids in oleaginous fungi and yeasts using Nile red fluorescence[J]. J Microbiol Methods, 2004, 56: 331.[13] Bertozzini E, Galluzzi L, Penna A, et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red [J]. J Microbiol Methods, 2011, 87: 17.[14] Chen W, Zhang C, Song L, et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae [J]. J Microbiol Methods, 2009, 77: 41. [15] Silva T L D, Santos C A, Reis A. Multi-parameter flow cytometry as a tool to monitor heterotrophic microalgal batch fermentations for oil production towards biodiesel [J]. Biotechnol Bioproc E, 2009, 14: 330.[16] Chen W, Sommerfeld M, Hu Q, et al. Microwave-assisted Nile red method for in vivo quantification of neutral lipids in microalgae.[J]. Bioresour Technol, 2011, 102: 135. [17] 刘新颖, 汪志平, 于金鑫,等. 布朗葡萄藻脂质含量的荧光光谱检测方法的改进[J]. 生物工程学报, 2013, 29: 382.[18] 郭婷, 代易颖, 陈孔翔,等. 同源重组敲除三角褐指藻基因的研究[J]. 四川大学学报：自然科学版, 2017, 54: 173.[19] Alemánnava G S, Cuellarbermudez S P, Cuaresma M, et al. How to use Nile Red, a selective fluorescent stain for microalgal neutral lipids [J]. J Microbiol Methods, 2016, 128: 74.[20] Ren H Y, Liu B F, Kong F, et al. Improved Nile red staining of Scenedesmus sp. by combining ultrasonic treatment and three-dimensional excitation emission matrix fluorescence spectroscopy[J]. Algal Res, 2015, 7: 11.[21] Siegler H D L H, Ayidzoe W, Ben-Zvi A, et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures[J]. Algal Res, 2012, 1: 176.。

中国生物工程杂志China Biotechnology ，2012，32（1）：64-72微藻细胞油脂含量的快速检测方法*张敬键1吕雪娟2李爱芬1万凌琳1吴洪3尹顺吉3张成武1＊＊（1暨南大学生命科学技术学院热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心广州510632）（2华南农业大学测试中心广州510642）（3新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室廊坊065001）摘要以斜生栅藻（Scenedesmus obliquus JNU20）为实验材料，采用尼罗红（NR ）荧光光谱法和傅里叶变换红外光谱法（FTIR ）测定该藻细胞中的油脂含量。

研究结果表明NR 的最佳染色条件为：染色前微波处理40s ，二甲基亚砜体积分数1%，NR 最终质量浓度1．5μg /ml ，染色时间5min ，染色温度40ħ。

比较了NR 荧光光谱法、FTIR 与传统重量法测定的该藻在不同时相的油脂积累情况，利用激光共聚焦显微镜观察了细胞中油体形成的动态过程。

实验结果表明NR 荧光光谱法、FTIR 与传统重量法测定的结果显著相关（R 2=0．9258，R 2=0．9844），但NR 荧光光谱法和FTIR 更简便快速，研究结果为规模化筛选高含油量藻株及跟踪产油微藻油脂积累过程奠定了基础。

关键词斜生栅藻油脂尼罗红荧光光谱傅里叶变换红外光谱中图分类号Q949收稿日期：2011-09-20修回日期：2011-10-27*国家“863”计划（2009AA06440）、国家“973”计划（2011CB2009001）、国家自然科学基金（31170337、41176105）、广东省教育部产学研结合项目（2010A090200008）、珠海市科技重点项目（PC20081008）资助项目＊＊通讯作者，电子信箱：tzhangcw@jnu．edu．cn面对能源危机，利用微藻生产生物燃料及其相关高附加值产品引起了人们的极大关注，已成为目前化石能源替代燃料研究的热点。

中国油料作物学报Chinese Journal of Oil Crop Sciences优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌岳秀宏1，李祥宇4，刘鹏阳1,5，陆姝欢4，万霞1,2,3*（1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉，430062；2.农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北武汉，430062；3.农业部油料加工重点实验室，湖北武汉，430062；4.嘉必优生物技术股份有限公司，湖北武汉，430073；5.湖北大学，生命科学学院，湖北武汉，430062）摘要：裂殖弧菌是商业化生产二十二碳六烯酸（DHA ）的重要菌株。

为了快速检测裂殖壶菌细胞油脂含量，本文基于尼罗红荧光染色法，系统地筛选了激发光与发射光，并探究了简化细胞处理步骤，在不使用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞的条件下，优化二甲基亚砜（DMSO ）体积分数、尼罗红用量、染色时间及细胞密度等因素对裂殖壶菌胞油脂检测的影响，并通过气相色谱法与荧光染色法的相关性分析，验证该方法的准确性。

结果表明背景荧光未对荧光强度测定造成干扰；细胞密度在一定范围内，荧光强度与油脂含量的相关性良好，通过荧光强度可以较为准确地反映裂殖壶菌油脂含量。

最佳染色及检测条件为：细胞密度0.7<OD 600<1.3，尼罗红浓度1μg/mL ，DMSO 浓度20%，激发光515nm ，发射光576nm ，常温避光染色20min 。

本研究优化后尼罗红荧光染色法可应用于高含油量的裂殖弧菌突变株或亲缘关系相近的高油脂菌株的高通量筛选。

关键词：裂殖壶菌；油脂含量；尼罗红荧光染色中图分类号：TK6文献标识码：A文章编号：1007-9084（2019）05-0796-08Simplified and rapid lipid determination of Schizochytrium sp .by optimized Nile red fluorescence staining YUE Xiu-hong 1，LI Xiang-yu 4，LIU Peng-yang 1,5，LU Shu-huan 4，WAN Xia 1,2,3*（1.Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430062,China;2.Key Laborato⁃ry of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops,Ministry of Agriculture,Wuhan 430062,China;3.National and Local Joint Engineering Laboratory of Oil Lipid Processing Technology,Wuhan 430062,China;4.CABIO Biotechnol⁃ogy Company Limited,Wuhan 430073,China;5.College of Life Sciences,Hubei University,Wuhan 430062,China ）Abstract:Schizochytrium sp .is an important strain for commercial production of docosahexaenoic acid (DHA).Improving DHA production by physicochemical mutagenesis is an important link in the development of microbialfermentation DHA industry.In order to establish a rapid optimal Nile red fluorescence staining method for determin⁃ing the lipid content in Schizochytrium sp .,we systematically examined the effect of excitation wavelength,emission wavelength and explored the condition of cells without phosphate buffer solution washing.We also optimized the concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO)and Nile red,staining time and cell density.The results showed that the culturing medium did not interfere with the determination of fluorescence intensity.In addition,we evaluated thecorrelation between the florescence intensity of Nile red staining and gas chromatographic method.The lipid contentwas positively correlated to the fluorescence intensity,when the cell density was within a certain range.We con⁃clude that lipid content of Schizochytrium sp.can be effectively determined by fluorescence intensity.The optimal conditions for determining of lipid content in Schizochytrium sp were obtained as follows :cell density was 0.7<OD 600<1.3,the concentration of Nile red was 1μg/mL,DSMO concentration was 20%(v/v),staining time was 20min,andthe excitation and emission wavelengths was 515nm and 570nm.The optimized Nile red fluorescence staining 2019，41（5）：796-803doi ：10.19802/j.issn.1007-9084.2019059收稿日期：2019⁃03⁃08基金项目：十三五重点研发计划(2016YFD0501209-01)；中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP-2013-OCRI)；中国光谷“创新人才”计划（K159）作者简介：岳秀宏(1993-)，女，硕士研究生，研究方向为微生物代谢与酶工程，E-mail:1280356506@ *通讯作者：万霞(1981-)，女，湖北武汉人，副研究员，从事脂质化学与营养创新研究，E-mail:wanxia@岳秀宏等：优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌method could be used to rapidly and high-throughput screening of mutants with high lipid content in Schizochytri⁃um or closely related strains.Key words:Schizochytrium sp.；lipid content；Nile red fluorescence dyeing二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一种重要的ω-3系列超长链多不饱和脂肪酸，由22个碳和6个双键组成[1]。