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生物工程中的基因转导技术与应用基因转导技术简介生物工程中的基因转导技术是指将外源的基因通过适当的方法导入到宿主细胞内，并使其能够稳定地表达出来。
目前广泛应用的基因转导技术主要包括转染法、病毒介导转导、基因枪法、微泡法等。
其中，转染法是直接将外源基因与一种具有催化功能的物质如聚乙烯亚胺（PEI）混合后作为载体，将混合物滴加到培养细胞上，让其通过细胞膜进入到细胞内，通过细胞内的代谢途径实现基因表达。
这种方法需要大量的外源DNA，而且转染效率较低。
病毒介导转导是指将外源基因与一种病毒蛋白质进行结合，制成一种嵌合病毒，通过感染细胞实现基因转导。
这种方法虽然转导效率高，但对安全性颇有争议，因为嵌合病毒的安全性较难保证。
基因枪法是通过在DNA颗粒场中加速DNA颗粒，使其能够穿透细胞膜并直接进入到细胞核内，实现基因转导。
这种方法相对较为简单，但需要额外的设备和对DNA颗粒的精细操作。
微泡法是近年来发展起来的一种基因转导技术，利用微泡的自然结构和表面的有效载体性质将DNA包裹在内，以达到高效率的基因转导。
这种方法因操作简便、效率高、安全性好等特点而逐渐成为研究热点。
基因转导技术的应用目前，基因转导技术已广泛应用于生物工程领域中的基因修饰、基因克隆、新药开发、基因治疗等方面。
基因修饰是指利用基因转导技术将外源基因导入到细胞内，使其编码的蛋白质与宿主细胞内的蛋白质发生相互作用或交换信息，从而实现基因修饰。
这种方法在生命科学、医学、农业等领域都有所应用。
基因克隆是指将特定的基因序列扩增出来，并对其进行重组、变异等处理，进而实现对基因功能的研究和利用。
基因转导技术在基因克隆研究中起到了至关重要的作用，它能够扩大特定基因序列的数量，并在特定的细胞内实现高效表达。
新药开发是指通过对疾病发生机制和新型药物作用机理的研究，在基因水平上探索新型药物的开发方向。
基因转导技术的应用可以帮助研究人员在基因水平上研究药物作用机理，为新药的开发提供重要的基础研究依据。
基因剪切技术的应用研究基因剪切技术是一种重要的基因工程技术，已经成为了生命科学领域中的一个重要研究领域。
基因剪切技术可以对基因组进行定向编辑，从而改变基因组中的特定序列，使得某些基因表达被正常调控或者被抑制。
基因剪切技术在医学、农业和工业生产等领域的应用，对于人类的健康和生存，有重要的意义。
一、基因剪切技术的概念基因剪切技术又称基因编辑技术，是一种用于编辑染色体DNA序列的基因工程技术。
它可以对基因组进行精确的定向编辑，从而改变基因组中的特定序列，使某些基因表达被正常调控或被抑制。
基因剪切技术包括ZFNs、TALENs和CRISPR等技术。
二、基因剪切技术的原理基因剪切技术通过引入人工的核酸酶，对目标DNA序列进行裁剪或编辑。
这些核酸酶可以被设计成靶向特定的DNA序列，并引起双链断裂，从而触发DNA修复机制，在修复过程中对目标序列进行编辑或者剪切。
三、基因剪切技术的应用3.1 医学应用基因剪切技术在医学方面的应用主要涉及到基因治疗、癌症治疗和传染病治疗。
例如，基因剪切技术可以用于修复遗传病患者的病基因，恢复其正常的功能。
基因剪切技术还可以被用来治疗癌症。
许多肿瘤以及癌细胞都有着对基因维持生物活性的依赖，基因剪切技术可以通过针对癌细胞中的特定基因进行编程，从而有效地抑制肿瘤生长和扩散。
此外，对于一些传染病，例如HIV等病毒，利用基因剪切技术可以设计出新型的治疗方法。
3.2 农业应用基因剪切技术在农业领域的应用主要体现为通过剪切特定的基因，来调控植物的防御机制、促进植物生长和抗逆应变能力。
例如，在小麦的研究中，科学家们通过基因剪切技术使小麦种子中水分含量降低，从而提高小麦的耐旱性和保鲜能力。
基因剪切技术还可以被用来增强作物的抗病能力或者提高其营养含量，为农业生产提供更多有效的手段。
3.3 工业生产应用基因剪切技术在工业生产上也有广泛的应用。
比如，基因剪切技术可以被用来优化酵母、真菌等微生物的代谢途径，增强产生有用生产物的效率。
基因敲除技术的原理与应用
基因敲除技术是基因工程领域常用的一种技术手段，它通过干扰特定
目标基因的表达，来研究该基因在生物体中的功能、调控及其对生物现象
的影响。
基因敲除技术的原理与应用十分广泛，对于生物学研究、疾病治
疗和农业改良有着重要的意义。
1.生物学研究：基因敲除技术被广泛用于研究基因在生物体中的功能
以及其对生物现象的影响。
常用的模式生物如小鼠、果蝇、斑马鱼等，通
过基因敲除技术产生基因敲除动物模型，可以帮助科学家研究基因的功能、调控机制和疾病机理。
2.疾病治疗：基因敲除技术可以用于治疗一些与单基因遗传病相关的
疾病。
通过针对致病基因的敲除，可以恢复或改变细胞的功能，从而治疗
疾病。
举例来说，基因敲除技术已经成功用于治疗部分遗传性免疫缺陷病、囊性纤维化、血友病等疾病。
3.肿瘤治疗：在癌症治疗中，基因敲除技术可以用于针对癌细胞中的
致瘤基因进行敲除，从而抑制肿瘤的生长和扩散。
此外，还可以对肿瘤的
信号通路进行调控，达到治疗肿瘤的目的。
4.农业改良：基因敲除技术可以应用于农业领域，通过有针对性地敲
除一些基因来改良植物的性状，提高农作物抗病性、抗旱性和耐盐性。
以
水稻为例，基因敲除技术已经成功应用于提高水稻对稻瘟病、稻瘟病菌和
稻瘟霉素的抗性。
总之，基因敲除技术具有广泛的应用前景。
它可以对生命科学研究、
疾病治疗和农业改良等领域做出重要贡献。
随着技术的不断发展和优化，
基因敲除技术的应用将会更加广泛，为人类的健康和农业产业发展带来更多的福利。
【收稿日期】2008205220【作者简介】贺松(19822),男,硕士在读,从事基因工程菌的构建及其应用的研究,Email:jar m190@;张德纯,通讯作者,Email:zhangdechun46@s ohu .com文章编号:10052376X (2009)022*******【综 述】基因敲除方法及其应用贺松,张德纯(重庆医科大学病原生物学教研室,重庆 400016)【关键词】 基因敲除;基因打靶;同源重组;RNA 干扰【中图分类号】Q781 【文献标识码】A 基因(gene )是核酸分子中储存信息的遗传单位,是指储存有功能的蛋白质多肽链或RNA 序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。
基因敲除(Gene knockout )是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能;或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。
基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。
基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,此后经历了将近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家CAPECCH I 和OL I V ER S M I TH I ES 、英国科学家EV 2ANS 因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,基因打靶技术才获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA 干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。
农杆菌介导柑橘遗传转化体系的优化农杆菌介导的柑橘遗传转化效率一直不高,为进一步提高柑橘的遗传转化效率,本研究以金柑、糖橙及柠檬实生苗上胚轴节间茎段为试材,比较系统地研究影响其再生及转化效率的各种因素,完善它了们的遗传转化技术体系。
同时,在优化遗传转化技术体系的基础上,成功将“外源基因清除系统”(Gene-Deletor)以及“果实无核化”基因导入金柑和糖橙橙中,同时将YFP基因导入柠檬中。
主要研究结果如下：1金柑再生及遗传转化技术体系的建立以35d苗龄金柑(完全暗培养)的实生苗上胚轴节间茎段为外植体,水平放置培养于不定芽再生培养基(MS+3mg·L-16-BA)上培养50d左右,不定芽再生率可达到90%；切下不定芽放置于生根培养基(1/2MS+3mg·L-1IBA+1g· L-1AC)上,不定芽生根率可达86%。
以35d苗龄(暗培养25d+光照10d)的金柑实生苗上胚轴节间茎段为遗传转化的外植体,用液体共培养培养基(MS+2mg·L-6-BA+1mg·L-1NAA+1mg·L-1KT+20mg·L-1AS, pH=5.4)重悬农杆菌菌液至OD600=0.3后,侵染30min,转入共培养基中,25℃黑暗条件下首尾相连培养3d,再转入筛选培养基(MS+3mg·L-16-BA+50mg·L-1kan+400mg·L-1cef)进行阳性芽的筛选,可获得较高的GUS阳性率。
应用以上优化的遗传转化体系,成功将‘’Gene-deletor"和“果实无核化”基因导入金柑细胞中,获得23株转基因株系,转化效率可达6.07%。
2糖橙遗传转化技术体系的优化以30d苗龄(暗培养20d+光照10d)的糖橙实生苗上胚轴节间茎段为外植体,在共培养基(MS+3mg·L-16-BA+20mg·L-1AS, pH值5.7)上,19℃C共培养条件下共培养3d后转移到筛选培养基中,最后获得GUS阳性率为29.4%。
1、有关基因工程 PPT 中出现的概念术语的英文写法需掌握genetic engineering 基因工程open reading frame, ORF 开放读码框exon 外显子intron 内含子recombination 重组replication 复制transcription 转录translation 翻译expression 表达purpose gene 目的基因functional cloning 功能克隆phenotypical cloning 表型克隆differential screening 差异筛选法subtractive hybridization, SH 差减杂交法DDRT-PCR mRNA 差别显示技术representative differentiation analysis, RAD代表性差异分析suppression subtractive hybridization, SSH抑制性差减杂交mapbased gene cloning 图位克隆transposon tagging cloning 转座子标签克隆denaturation 变性anealling 退火extension 延伸polymerase chain reaction PCR 聚合酶链反应anchored PCR 锚定PCR Inverse PCR 反向PCR gene library 基因文库vector 载体restriction endonuclease 限制性内切酶ligase 连接酶intermediate expression vector 中间表达载体chimeric gene 嵌合基因disarmed vector 卸甲载体Co-integrated vector 共整合载体Cis-vector 顺式载体binary vector 双元载体trans vector 反式载体green fluorescent protein,GFP 绿色荧光蛋白Part4purpose gene 目的基因totipotency 全能性vitrification 玻璃化agrobacterium- mediated 农杆菌介导genetic transformation 基因转化leaf disc transformation 叶盘转化法DNA-Direct Introduction DNA 直接导入liposome 脂质体liposome fusion 脂质体融合法liposome injection 脂质体注射法electroporation 电穿孔法gene gun, particle gun, biolistics,biological ballstics, microprojectile 基因枪法germ line transformation 种质转化microinjection 显微注射法direct injection or macroinjection 直接注射法pollen–tube pathway 花粉管通道法Part5transgenic plant 转基因植物total DNA 植物细胞总DNA CTAB (cetyltriethylammonium bromide)十六烷基三乙基溴化铵SDS (Sodiumn-Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠gus β- 葡萄糖苷酸酶基因gfp 绿色荧光蛋白基因antigen 抗原antibody 抗体ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay):酶联免疫吸附法Part6GMOs 转基因生物gene transfer 基因逃逸via gene-deletor technology 外源基因清除male sterility 雄性不育seed sterility 种子不育marker free 无标记2、第一章绪论中关于基因工程发展历史中关于理论发现和技术发明的几个重要事件、全球转基因作物现状概况理论发现：(1)遗传物质的化学本质是DNA (Avery等，1944)(2)DNA双螺旋结构模型和半保留复制机制(Watson and Crick, 1953)(3)遗传密码的破译(Nirenberg等，1964)和“中心法则”(Crick, 1957)技术发明：(1)限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割技术(Smith和Wilcox, 1970)、(2)DNA连接酶的发现(Weiss和Richardson，1966)与DNA片段的连接(Berg和Jackson, 1972)、(3)基因工程载体的发现与应用(Cohen,1973)为基因工程技术提供了技术保障。
一基因敲除的概述基因敲除，是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。
这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。
基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
现在基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。
既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。
二基因捕获法的原理基因捕获的方法酷似以报告基因为诱饵来捕获基因。
其基本过程是将一含报告基因的DNA 载体随机插入基因组,从而产生内源基因失活突变,并通过报告基因的表达激活提示插入突变的存在,及突变内源基因表达特点。
通过筛选得到的插入突变的ES 细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型,进而分析表型来研究突变基因功能。
每一种ES 细胞克隆中含有不同的突变基因,在短期内可建立大量含不同基因突变的ES 细胞克隆库。
突变基因的序列可通过基于PCR 的一些方法鉴定,同时还可能发现一些在体内表达或不表达的新基因。
三基因捕获法的分类根据报告基因在载体中的位置及报告基因激活表达的方式，基因捕获分为3种类型。
1 增强子捕获载体。
含有一个最小的启动子和翻译起始位点,当载体整合到顺式增强子元件附近时,此增强子将调控报告基因的表达。
对报告基因在体内表达的ES 细胞系插入位点进行克隆鉴定发现插入位置邻近编码序列。
关于增强子捕获的诱变比率还未见报道,但插入的性质预示由增强子捕获产生功能失活的突变比率较低,因此,增强子捕获载体在小鼠体系中未得到广泛应用。
2 启动子捕获载体。
通常由不含启动子成分的报告基因和一筛选标记基因组成,只有当载体插入到内源基因编码区序列中产生融合转录本时报告基因才可能表达。
因而启动子捕获的致突变比率很高。
然而载体插入到外显子的频率非常低,捕获效率较增强子捕获至少低200倍。
基因工程技术的原理与应用例题和知识点总结一、基因工程技术的原理基因工程，也称为重组 DNA 技术，是一种在分子水平上对基因进行操作和改造的技术。
其基本原理是在体外将不同来源的 DNA 分子进行剪切、拼接和重组，然后将重组的 DNA 分子导入到受体细胞中，使其在受体细胞中表达和遗传。
基因工程的操作主要包括以下几个步骤：1、目的基因的获取从生物体的基因组中直接分离：对于一些结构和功能比较清楚的基因，可以通过限制性内切酶将其从基因组 DNA 中切割下来。
人工合成：如果已知基因的核苷酸序列，可以通过化学方法人工合成目的基因。
PCR 扩增：利用聚合酶链式反应（PCR）技术，以少量的 DNA 为模板，快速扩增出大量的目的基因。
2、基因载体的选择和构建基因载体是能够携带目的基因进入受体细胞的工具。
常用的基因载体有质粒、噬菌体和病毒等。
载体需要具备自我复制能力、多个限制性内切酶切点、标记基因等特点。
3、目的基因与载体的连接通过限制性内切酶切割目的基因和载体，产生相同的黏性末端或平末端。
然后利用 DNA 连接酶将目的基因和载体连接起来，形成重组 DNA 分子。
4、将重组 DNA 分子导入受体细胞常用的导入方法有转化（细菌）、转染（动物细胞）和农杆菌介导转化（植物细胞）等。
5、重组体的筛选和鉴定由于导入受体细胞的重组体中可能存在未成功重组的分子，因此需要进行筛选和鉴定。
常用的筛选方法有抗性筛选、标记基因筛选、核酸分子杂交筛选等。
二、基因工程技术的应用例题1、基因工程在农业领域的应用抗虫棉的培育：将苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因导入棉花细胞中，培育出具有抗虫特性的棉花品种。
举例：某地区常年遭受棉铃虫的侵害，导致棉花产量大幅下降。
科研人员通过基因工程技术，将一种能够编码产生杀虫蛋白的基因导入棉花植株中。
经过筛选和培育，获得了抗虫棉新品种。
在种植过程中，这种抗虫棉能够有效地抵御棉铃虫的危害，减少了农药的使用量，提高了棉花的产量和质量。
