Real-Time PCR 简介

实时荧光pcr原理实时荧光PCR原理。

实时荧光PCR（Real-time PCR）是一种能够在PCR过程中实时监测DNA扩增情况的技术。

它通过引入荧光探针或染料，实时检测PCR反应体系中的DNA量的变化，从而实现对PCR过程的实时监测和定量分析。

实时荧光PCR的原理主要包括以下几个方面：1. 荧光探针。

在实时荧光PCR中，常用的荧光探针包括TaqMan探针、Molecular Beacon探针和SYBR Green染料。

这些荧光探针在PCR过程中与靶标DNA结合，并产生荧光信号。

通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进程。

2. 荧光信号检测。

实时荧光PCR系统配备了特殊的光学检测装置，能够实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化。

当靶标DNA逐渐扩增，荧光信号也会随之增加。

通过检测荧光信号的变化，可以实时获取PCR反应的动态信息。

3. 数据分析。

实时荧光PCR系统通常配备了专门的数据分析软件，能够实时处理和分析检测到的荧光信号。

通过对荧光信号的定量分析，可以计算出PCR反应体系中靶标DNA的初始量，并绘制出PCR扩增曲线。

通过PCR扩增曲线的形态和特征，可以对靶标DNA进行定量分析和检测。

4. 应用领域。

实时荧光PCR技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括基因表达分析、病原微生物检测、基因型分析等方面。

由于其高灵敏度、高特异性和高准确性，实时荧光PCR已成为现代分子生物学研究和临床诊断中不可或缺的技术手段。

总结。

实时荧光PCR技术通过引入荧光探针和光学检测装置，实现了对PCR反应的实时监测和定量分析。

它在生命科学领域有着广泛的应用前景，为基因分析、疾病诊断和药物研发等领域提供了强大的技术支持。

随着技术的不断进步和完善，实时荧光PCR技术必将在未来发挥更加重要的作用。

主题：Real-Time PCR概述：Real-Time PCR技术，又称实时定量荧光PCR(real-time quantitative PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

Real-Time PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

常用方法：SYBR green（荧光染料掺入法）和Taqman probe（探针法）。

目的：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。

原理：1.SYBR green（非特异性荧光标记）:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2.Taqman Probe（特异性荧光标记）:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

步骤：1.RNA抽提（以细胞样品为例，操作步骤同RT-PCR）1.1弃去培液，PBS洗2遍，加入1ml Trizol，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入1.5ml EP管内，静置5min。

（Trizol量根据细胞密度可适当调整，建议：6孔板细胞长满~1ml Trizol）1.2加入200μl氯仿（三氯甲烷），用手剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟。

real-time pcr名词解释
外文名【Real-time Quantitative polymerase chain reaction】
中文名【实时荧光定量多聚核苷酸链式反应】
中文简称【实时荧光定量PCR】
外文简称【RT PCR】
【实时荧光定量PCR技术】，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

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Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

【技术原理】
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。

它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。

二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。

实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。

根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。

实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。

三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。

（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。

实时荧光定量（Realtime ）PCR检测●原理所谓的实时荧光定量 PCR ，其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。

PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（ threshold value )。

定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。

荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。

对某一样品的C（ t ）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。

CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表 CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。

因些只要获得未知样品的 CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

SYBR Green Ⅰ荧光染料●荧光定量 PCR 实验过程a. 准备样品及试剂PCR Master Mix ；光学96孔板和光学盖；客户样品cDNA （浓度不低于10ng/ul ）；b. 设计并合成引物和 TaqMan 探针c. 定量 PCR 实验d. 引物和探针稀释e. 制备标准曲线样品取一个客户的样品做至少5个梯度稀释，用于做标准曲线。

实时荧光定量 PCR 技术简介实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。

现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA探针对目标基因进行定量。

一、利用荧光染料进行定量一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所有的双链DNA 结合，并产生荧光。

游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。

利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。

然而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。

二、利用荧光探针进行定量荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。

此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。

荧光探针的5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。

在PCR 反应过程中，引物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5’-3’核酸外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。

每增加一条目的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧光信号会逐渐增强。

使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。

实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）是一种基于PCR技术的高效、准确且可靠的DNA分析方法。

其主要原理
是通过在PCR反应过程中实时监测DNA扩增产物的累积量，从而定量测定起始DNA模板的数量。

实时定量荧光PCR的核心是使用荧光探针的方法来定量检测PCR反应过程中的DNA扩增产物。

在PCR反应中，荧光探
针包含一个荧光染料和一个荧光素（quencher）分子。

当探针
与PCR反应中的模板DNA序列互补结合时，荧光染料与荧光素分子之间距离较远，荧光信号强度较高。

而当PCR反应进
行到延伸阶段，DNA聚合酶酶活将荧光探针的酶切位点切除，导致荧光染料与荧光素分子之间距离缩小，荧光信号强度降低。

根据荧光信号的变化情况，可以推算出PCR反应过程中DNA
扩增产物的实时累积量。

为了实现定量测定，实时定量荧光PCR还需要设置一个标准
曲线。

首先，制备一系列包含已知浓度的DNA标准品，然后
通过实时定量荧光PCR测定这些标准品的荧光信号。

根据标
准品荧光信号与其对应浓度之间的关系，构建标准曲线。

最后，通过比较待测样品的荧光信号与标准曲线，可以确定样品中的DNA起始数量。

实时定量荧光PCR在科学研究和临床诊断中具有广泛应用。

它可以用于分析基因表达水平、研究遗传变异、检测病原体等。

相比传统的定量PCR方法，实时定量荧光PCR具有灵敏度高、
精确性好、操作简便等优点，成为分子生物学领域中不可或缺的实验技术之一。