RTPCR常见问题分析

RT-PCR合成目的cDNA中可能会遇到的问题及处理概述从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。

总之cDNA 的合成和已成为当今真核分子生物学的基本手段。

自70年代中叶首例cDNA问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。

cDNA合成及的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA到于适当载体(噬菌体或质粒)。

一、RNA制备模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。

由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。

所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。

所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。

凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。

DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。

试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。

但DEPC 能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。

Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。

PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化PCR虽然为一个简单的实验,但在实际过程中可能会出现各种问题.产生问题的原因可能来源于以下几个方面：实验操作，试剂质量，PCR反应过程中各种试剂的含量,以及反应条件，温度设置等，本文对各个方面进行了讨论，大家遇到问题后可以对号入座的查一下.当然，具体问题的解决还依靠实验者就可能的原因逐项排除,并不断的摸索才能彻底解决.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改.酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

Real-Time RT-PCR常见问题分析1.某一孔荧光信号特别强问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？原因：①试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；2. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？原因：①反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；3. 部分样本扩增效率过低问题：部分样本扩增效率过低？原因：①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效；4.阴性对照或空白对照翘尾，可能原因：1、模板提取环境有污染。

2、模板提取操作有污染。

3、配液过程存在污染。

问题：阴性对照或空白对照翘尾？原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；5. 直线型扩增曲线问题：直线型扩增曲线？原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制物；6.没有扩增曲线问题：没有扩增曲线？原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage 1阶段；②电脑设定了自动休眠；7.基线下滑问题：扩增曲线有一个下滑阶段？原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；8.扩增曲线断裂问题：扩增曲线断裂？原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据9.样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同“扩增曲线断裂”。

一文掌握RT-PCRqPCR原理、实验设计、数据分析、问题、技巧一网打尽qPCR常见问题及解...在RT-qPCR的实验过程中，大家或多或少都会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常、重复性差等问题。

小翊给大家整理了SYBR Green染料法的常见问题及解决方案，以供大家参考。

Part 1 扩增曲线异常正常的扩增曲线一般呈S型，Ct值最好在20-30之间。

异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。

1.Ct值偏大（如Ct值＞30）1）模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。

2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。

3）扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。

4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

2.扩增曲线无法达到平台期基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。

3. 扩增曲线平台期下降可能是基线范围设置不当，这种一般是由于模板量过高导致的。

建议减小基线的终点值（一般建议设置为Ct值-4），调整后见下图。

4.扩增曲线平台期锯齿状1）RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。

2）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

5.扩增曲线杂乱无规律可能是ROX浓度和机型不匹配，建议调整ROX浓度，调整后见下图。

【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX 导致的。

6.有熔解曲线，无扩增曲线可能是扩增程序设置错误，未进行荧光信号搜集，建议重新实验，增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。

7.扩增曲线有向上或向下的尖峰可能是仪器故障，建议维修仪器。

8. 阴性对照有扩增1）NTC有扩增，可能有以下两种情况：①Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃（一般正常qPCR产物，大小在100-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚体导致，可进一步优化引物。

RT-PCR中可能遇到的问题及处理方法摘要：本文就在RT-PCR实验中可能遇到的，包括在琼脂糖凝胶电泳分析中看到少量或没有RT-PCR产物、在琼脂糖凝胶分析中看到非预期条带、多聚糖同RNA共沉淀、cDNA第一链合成错误或数量少、RNA二级结构太多等问题进行分析，并提出了相应的可能的处理方法。

RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。

逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。

由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。

原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。

RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。

RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

RT-PCR的关键步骤在是RNA 的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。

1 材料与方法1.1材料1.1.1 RT-PCR技术相关试试剂:oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子1.2 方法1.2.1 RNA提取组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）。

转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min。

加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min。

10000 rpm 4℃离心15min。

转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min。