人脐带间充质干细胞3种分离制备方法的比较

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人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。

方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。

结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。

结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。

%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。

人脐带间充质干细胞体外分离、培养、扩增方法及生物学特性研究

ＡＳＲＣＯｂｅｔｅＴｏｅｔｂｉｈａｍｅｈｄｔｅａａｅｍｅｅｃｙｌｓｅｃｌｒｍｕｎＢＴＡＴ：ｊｃｉｖｓａｌｔｏｏｓｐｒｔｓｓｎｈｍａｔｍｅｌｆｏｈｍａｓ
ｕｍｂｌｃ１ｃｄ（ｉｉａｏｒＵＣ＿ＳＣｓｃｌｕｒＣ＿ＳｎｖｉｒＭ），ｕｔｅＵＭＣｓｉｔｏ，ａｔｙｉｓｉｌｉａｃａａｔｒｓｉｓｎｄｓｕｄｔｂｏｏｇｃ１ｈｒｃｅｉｔｃ．ＭｅｈｄＭＳｒｅａａｅｒｍｔｏｓＣｓｗｅｅｓｐｒｔｄｆｏｈｕｍａｍｂｌｃ１ｃｄｗｉｈｔｎｚｍｅｍｅｈｄａｘｎｎｕｉｉａｏｒｔｗｏｅｙｔｏｎｄｅｐａ — ｄｉｕｔｅｎｖｔｏｎｇｃｌｕｒｄｉｉｒ．Ｇｒｗｔｕｒｅｅｌｒｒｗｎａｕｆｃｎｉｅｒｅｅｔｄｗｉｈｏｈｃｖｓｏｆｃｌｓｗｅｅｄａｎｄｓｒａｅａｔｇｎｓｗｅｅｄｔｃｅｔｆｏｗｙｏｍｅｒ．ｔｍｏｒｇｉｉｉｓｏｆｃｌｓｗｅｅｔｓｅｂｓｆｇｒｃｏｎｔｏｄｌｃｔｔｙｕｉｅｃｔｅｅｌｒｅｔｄｙｏｔａａｌｎｉｇｍｅｈ．ＲｅｕｔＴｈｅｓｌｓｍｅｈｓｏｕｔｅａｄｅｐａｉｎｏｆＵＣ＿ＣｓｉｉｒｒｓａｉｈｅｔｏｄｆｃｌｕｒｎｘｎｓｏＭＳｎｖｔｏｗｅｅｅｔｂｌｓｄ．Ａｄｈｓｖｅｃｌｓｗｅｅａ１ｅｉｅｌｒｌｐｉｉｏＳＣ－ｅａｅａｉｅｓ，ｓｈｓＣＤ２９，ＣＤ１５，ＣＤ４４，ａｄＣＤ１ｏｓｔｖｅｆｒＭｒｌｔｄｎｔｇｎｕｃａ０ｎ３，ｂｎｅｔｖｏｕｔｇａｉｅｆｒＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ３１，ＣＤ１０６，ａＨＬＡ— ｎｄＤＲ．Ｍｕｈｉｃｔｏｎｏｆｅｌｓ０ｐｉａｉｃｌｓｗａ３ｈｏｕｓＣｅ１ｙｌｒ．ｌｃｃｅ

人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究

ｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ．Ｒｅｒｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｌａｔｅｎｔｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅａｎｄｌｏｇａｉｔｒｈｍｉｃｒｏｇｗｔｈｐｈａｓｅｏｆｈＵＣＭＳＣｓｗｅｒｅｉｎ
ｈＵＣＭＳＣｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｗａｓｄｒａｗｎ．Ｂａｓｅｄｏｎｃｅｌｌｇｒｏｔｈｗｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．ｔｈｅ３ｐａｓｓａｇｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒ－ｉｓｔｉｃｓｏｆｈＵＣＭＳＣｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｉｍｍｕ —
ＳＣｓ），ａｎｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅａｎｄｕｈｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓｔｉｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｐｉｒｍａｒｙ

人脐带间充质干细胞不同冻存方法探讨

殖后，设立４个因素和３个水平，分为９个实验组，分另ｑ观察不同冻存条件下对各组ＨＵＣ－ＭＳＣ的存活率、回收率、免疫抗原ＣＤ３４
和ＣＤ４４的影响。结果第９组ＨＵＣ－ＭＳＣ解冻复苏后，其存活率、回收率以及免疫抗原ＣＤ４４积分值均高于其他组（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），
关键词：间质干细胞；连续传代；细胞培养技术；低温保存；正交试验
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１２．１２．００３
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７３—４１３０（２０１２）１２—１４１４—０３
ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＬｉＺｈｅｎｇｍｉｎ，ＧｏｎｇＣｕｉｃｕｉ
国际检验医学杂志２０１２年６月第墅鲞箜塑』生！』堡！：塑！ · 基础实验研究论 Nhomakorabea著 ·
人脐带间充质干细胞不同冻存方法探讨
李正民，宫璀璀（中国人民解放军第一五三中心医院检验科，郑州４５００４２）
摘要：目的观察不同冻存条件对人脐带间充质干细胞（ＨＵＣ—ＭＳＣ）冻存效果的影响。方法将ＨＵＣ－ＭＳＣ传代培养增
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｏ．１５３ＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｅｏｐｌｅｓ

人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。

4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。

7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。

8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/mlbFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞1 资料与方法1.1 一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4C保存，6h内无菌处理。

1.2 脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank's 液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton 胶。

将其剪碎至1mm31织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20〜25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37 C，体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。

3〜5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%台牛血清的DMEM/F1培养基，正向放入体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。

72h后换液，一般5~7d 可有间充质干细胞爬出。

1.3 脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F1（2 不含酚红）、StemProRMSC SFM 三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。

1.4流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1X 106个细胞，分别加入10 u l单克隆抗体CD73 CD34 CD45 CD105 HLA-DRHLA-ABC及阴性对照lgG1 -PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min, PBS洗涤两次，室温300g, 5min。

PBS重悬后上流式细胞仪。

1.5 cck-8 法检测细胞活性取生长状态良好的P4 代细胞，调整细胞浓度至0.2 X 105/ml，加入96孔板。

每孔90卩l放在37C、体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内培养。

7d内每日上午10:00取出96孔板用与原来孔内相同培养基100卩l换液后加入cck-8溶液，继续孵育1h。

用酶标仪波长450nm测定各孔OD 值。

以OD直代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。

干细胞（MSCs）分离方法

干细胞（MSCs）分离方法目前常用的干细胞分离方法主要有：组织贴壁法、差速离心法、流式分选法、磁珠分选法。

1 组织贴壁法根据MSCs具有在塑料或玻璃培养皿中贴壁生长的特性对其进行分离。

例如：脐带间充质干细胞的分离提取(1) 无菌取剖宫产新鲜脐带约10 cm，生理盐水洗去脐带残留血液，剪成2～3cm 的小段，再次漂洗，纵行剖开脐带，剔除1 条脐静脉、两条脐动脉，剥离华通胶。

(2) 用眼科剪将华通胶剪碎成1mm²的小组织块，转移至细胞培养瓶中，加入含有体积分数为10%FBS、100 U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，于5%CO2、37℃的培养箱中静置培养。

(3) 倒置显微镜每天观察细胞生长情况。

(4) 1周后首次换液，此后3～4d 换液1次。

(5) 待细胞长至80%～90%融合时用胰蛋白酶/EDTA消化液消化传代，显微镜下控制消化时间。

2差速离心法主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。

收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

适用于人，猴子，犬等物种骨髓间充质干细胞的提取3 流式分选法流式细胞仪分离法原理是：当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。

流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。

在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。

将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

_三阶段法_分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞

三阶段法分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞张东辉1*,许永华1,许琴1,李建瑛1,是文辉1,李佳佳1,卢开伯1,邢彦超2,于良宽3,龙志新4(1兰州军区乌鲁木齐总医院实验动物科,2输血科,3妇产科;4新疆出入境检验检疫局,新疆乌鲁木齐830000)摘要:目的探讨运用三阶段法分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞的效果。

方法取人脐带血4份,经过3个阶段(去除红细胞阶段、短暂培养阶段、持续培养阶段),以完全低糖DM EM(含20%胎牛血清)为培养基,纯化分离人脐血间充质干细胞。

传代至第3代通过流式细胞仪和间充质干细胞诱导分化为成骨细胞进行鉴定。

结果4份人脐血中3份分离出间充质干细胞。

分离培养的细胞经流式细胞仪检测不表达造血细胞的抗原(CD34-),表达间充质干细胞的抗原(CD29+、CD44+、CD105+),并能向成骨细胞方向分化。

结论三阶段法能够简便、有效地从人脐血中分离出间充质干细胞。

关键词:人脐静脉血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R446;R34文献标识码:A文章编号:1009 5551(2010)10 1188 03C ulture and identify hu man umbilical cord b lood MSC s using three p hase approachZHANG Don ghui,X U Yong hua,XU Qing,et al(Dep ar tm ant of A nimal E x p eriment,Ur umqi General H osp ital of L anz hou Command,P L A,Urumqi830000,China)Abstract:Obiective To culture and identify human umbilical cord blood MSCs(m esenchy mal stem cells) using three phase approach.Methods Through three phases(remov al ofr ed blo od cell,br iefly culturing and phase of lasting culturing)to separate M SCs from4hum an umbilical co rd bloo d sam ples.Culture me dium w ith low g lucose DMEM w as supplemented w ith20%fetal calf serum.Isolated M SCs w er e passag ed to the third g eneration fo r identifying.Results Three gro ups o f M SCs w er e separated fro m4g roups of samples.By flow cytom etry analysising,cells expressed M SCs surface markers of CD29,CD44and CD105positively and CD34negatively.T he result of the differentiation of osteoblast like cells derived from human umbilical cord blood w as positive also.Conclusion We can easily and effectiv ely separ ate M SCs fro m human umbilical Cord Blood by thr ee phases appro ach.Key words:hum an um bilical co rd blo od;mesenchym al stem cells;in vitro culture人脐血间充质干细胞(umbilical cord blo od mesenchymal stem cells,U CB M SCs)具有良好的多向分化潜能,在适当的诱导条件下可以多向分化为间质谱系内的各种细胞[1-2],跨系分化为外胚层的神经细胞[3]、内胚层的肝细胞[4]。

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定王娟;陆琰;何冬梅;张洹【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.【总页数】6页(P367-372)【作者】王娟;陆琰;何冬梅;张洹【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定 [J], 王玲玲;马峰;张玉成;杜珍武;张桂珍2.睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究 [J], 肖斌;王晓云;周广东;周英晋;毕宏达;朱吉;张敬德;邢新3.大鼠雪旺细胞体外分离培养纯化及鉴定 [J], 张春燕;张自强;刘玉梅;邓雯;王玉琴4.猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究 [J], 何晋浙;樊鹏;孙培龙5.胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 [J], 李云龙;郭欣;杨晓波;黄跃南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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4 参考文献
［1］侯克东，卢世壁，张莉，等．人脐带 Wharton 胶中间充质干细胞的分离、培养与鉴定［J］．解放军医学杂志，2008，4（ 33）： 375-378．
［2］尹富华，杨晓凤，黄胜男，等．脐带间充质干细胞分离培养和生物学特征的初步研究［J］．现代检验医学杂志，2009，24（ 2）： 75-77．
［3］张彦，黄平平．人脐带间充质干细胞的生物学特性及应用前景［J］．国际移植与血液净化杂志，2008，4（ 5）： 39-42．
［4］吕璐璐，刘拥军，许贞书，等．脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状［J］．福建医科大学学报，2006，40（ 2）： 99-104．
（收稿日期： 2009-11-17，修回日期： 2010-06-03）（本文编辑：陈维忠）
摘要：目的比较组织块贴壁培养法、脐带匀浆胶原酶消化法与改良胶原酶消化法制备脐带间充质干细胞（ CMSCs），探讨一
种简便、快速、高质量的 CMSCs 制备方法。方法无菌条件下留取健康孕妇剖宫产的新生儿脐带，采用上述三种方法获取
CMSCs，经传代培养、倒置显微镜形态观察、细胞增殖能力观察及流式细胞仪检测 CMSCs 免疫表型。结果三种方法均制备
统计学意义（ P ＞ 0． 05）。 2． 3 体外诱导分化结果成骨分化：第 2 代脐带源贴壁细胞成骨定向诱导 14 d，对照组细胞 von Kossa 染色未见黑色矿化物沉积，而诱导组则见细胞间布满黑色颗粒，大小不均一，提示有矿化基质沉积。脂肪分化：第 2 代脐带源贴壁细胞脂肪定向诱导 14 d 后，对照组细胞油红 O 染色阴性，诱导组细胞可见油红 O 染色呈强阳性，倒置显微镜下可见细胞浆中含有脂肪空泡。
作者简介：尹富华，1954 年生，女，副主任技师，主要从事骨髓干细胞、脐带 MSC、CIK-DC 细胞的实验室研究。通讯作者：杨晓凤，女，主任医师，硕士研究生导师，E-mail： yxf463@ 126． com。
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临床检验杂志 2010 年 11 月第 28 卷第 6 期 Chin J Clin Lab Sci，Nov． 2010，Vol． 28，No． 6
1 材料与方法
1． 1 主要试剂、仪器 UItraCULTURE 无血清培养液（ Lonza 公司，USA），Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶（ Gibco BRL 公司），CO2 培养箱（日本三洋公司），倒置显微镜（ Leica 公司，German），立式恒温振荡培养箱（哈尔滨东联公司），流式细胞仪（ BD FACSCalibur FACS101），流式细胞术抗体（ Pharmingen 公司）。 1． 2 脐带的前期准备经我院伦理委员会批准，脐带取自足月剖宫产健康孕妇，并且孕妇 HBV 抗原、抗 HCV 抗体、抗 HIV 抗体、抗梅毒螺旋体抗体、 ALT、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性。无菌条件下采集脐带后送往实验室，如不能立即制备应将脐带置保存液内于 4 ℃ 冰箱存放，且不得超过 6 h。 1． 3 CMSCs 的制备方法（ 1）组织块贴壁培养法见参考文献［1］。（ 2）脐带匀浆胶原酶消化法见参
关键词：脐带；间充质干细胞；细胞培养；制备方法
中图分类号： R394． 26
文献标识码： A
间充质干细胞（ mesenchymal stem cells，MSCs）是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、羊膜液、胎盘、脐带血及脐带组织中。脐带间充质干细胞（ CMSCs）是存在于脐带华尔通胶（ Wharton' s jelly）和血管周围组织中的一种干细胞，来源广泛，便于取材，在体外易于分离扩增。我们应用组织块贴壁培养法、脐带匀浆胶原酶消化法与改良胶原酶消化法 3 种方法制备人 CMSCs 并进行比较，旨在探讨一种简便快速高质量的 CMSCs 制备方法。
出 CMSCs，但改良胶原酶消化法贴壁迅速，短时间内即可获得大量的 CMSCs。细胞免疫表型：高表达 CD90、CD105、CD73、
CD29、CD44；极低表达 CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR。结论改良胶原酶消化法可以快速分离脐带华尔通胶（ Wharton' s
jelly）中 CMSCs，且细胞迅速贴壁生长 3 ～ 5 d 即可传代，是一种简便快速易行的 CMSCs 制备方法。
2 结果
2． 1 CMSCs 的培养及形态学观察 2． 1． 1 组织块贴壁培养法原代培养 7 ～ 15 d，组织块间隙可见散在分布的长条梭状细胞。经去组织块换液后，倒置显微镜下可见几个或几十个贴壁生长的细胞，呈长梭形或扁平状，细胞形态与骨髓 MSC 相似。继续培养 10 ～ 15 d，可达到 80% 融合，从组织块接种到 80% 融合，约需 4 ～ 5 周。 2． 1． 2 脐带匀浆胶原酶消化法原代培养 3 d 左右时，贴壁细胞形成集落，多数为长梭形或扁平形的成纤维样细胞，少数为多突起的星形细胞，细胞有折光性，核仁明显；细胞增殖能力旺盛，经 7 ～ 10 d 即可达到 80% ～ 90% 融合。 2． 1． 3 改良胶原酶消化法原代培养 1 ～ 2 d，倒置显微镜下即可看到贴壁细胞呈散在分布，为长梭状或扁平形细胞，少数为多突起的星形细胞，细胞有折光性，核仁明显； 3 ～ 5 d 即可达到 80% ～ 90% 融合。用 2． 5 g / L 胰蛋白酶消化、传代，多数呈旋涡状生长。从原代种植到 80% ～ 90% 融合需 3 ～ 5 d。 2． 2 免疫表型检测流式细胞术检测结果表明，MSCs 相关的细胞表面标志呈高表达；而造血干细胞相关的细胞表面标志极低表达。高表达的表面标志为 CD105 （ 99． 7% ），CD90 （ 99． 5% ），CD73 （ 99． 9% ）， CD29（ 99． 8% ），CD44（ 94． 2% ）；极低表达的表面标志为 CD34（ 0． 4% ），CD45 （ 0． 6% ），CD19 （ 0． 5% ）， CD14（ 0． 6% ），CD19 （ 0． 5% ），HLA-DR（ 0． 6% ）。3 种试验方法培养的 MSCs 表面标志检测结果未见明显差别。 2． 3 细胞增殖能力选择原代培养及第 2、4、6 代的生长曲线进行观察。传代后静止期约 24 h，至 16 代细胞仍保持相似的细胞倍增时间。2 ～ 3 d 进入对数生长期，持续 3 ～ 4 d 后逐渐进入平台期，7 ～ 8 d 后生长缓慢。原代、2、4、6 代间细胞数间的差异无
次。第 14 d 用油红 O 染色，于倒置显微镜下观察脂肪滴的形成。向成骨细胞诱导分化：细胞以每孔 2 × 104 接种于 T-25 cm2 塑料培养瓶和 6 孔板，诱导分化体系为含 1． 0 × 10 － 8 mol / L 地塞米松、2． 0 × 10 － 4 mol / L 抗坏血酸、7． 0 × 10 － 3 mol / L β-磷酸甘油的 IMDM 培养基，每 3 d 半量换液 1 次。第 14 d 用 von Kossa 染色检测钙化基质沉淀。
3 讨论
脐带属于胎儿分娩后的废弃物，组织来源广泛，无伦理学限制［3］，其中的 MSCs 较原始且分化能力强，也降低了移植后受体的排斥反应。脐带经制备处理后可获得大量的 MSCs，其具有与骨髓 MSCs 极为相似的细胞形态和免疫特性。近来资料显示，从脐带不同组织（包括脐带静脉内皮和内皮下层，华尔通胶及血管及其周围组织）中可分离得到 MSCs。有研究者［4］曾采用内皮消化的方法从脐带中分离 MSCs，70% 标本不能得到可多次传代的 MSCs，原因可能是内皮消化法只能得到脐带内皮和内皮下的 MSCs，细胞数量较少。本组实验对脐带制备方法进行了改进：将华尔通胶剪碎直接贴壁；将脐带全部组织匀浆处理后进行胶原酶消化改为将剪碎的华尔通胶置于Ⅳ型胶原酶中振荡消化，取消胰蛋白酶消化步骤，过滤后将收集的 MSCs 单个细胞直接加入 UItraCULTURE 无血清培养液中培养。改良胶原酶消化改进了获取 MSCs 的方式，是一种增殖能力强、简便易行、可快速获得大量 CMSCs 的制备方法。
考文献［2］。（ 3）改良胶原酶消化法：去羊膜，取华尔通胶，剪碎成 0． 5 ～ 1． 5 mm3 的组织块，加入Ⅳ型胶原酶（ 1． 0 g / L），置 37 ℃ 恒温振荡培养箱振荡消化 3 h 后，用 80 目滤网过滤，将滤过的细胞悬液离心洗涤。用 UItraCULTURE 无血清培养液混匀细胞，以 1． 0 × 105 / cm2 接种于 T-75 cm2 培养瓶中，置 37 ℃ 、饱和湿度、5% CO2 培养箱中培养。3 种方法制备的细胞贴壁后，每隔 3 ～ 4 d 换液。融合至 80% ～ 90% 传代培养，加入 2． 5 g / L 胰酶（含 EDTA）消化，按 1∶ 2 或 1∶ 3 传代至 T 175 cm2 培养瓶中。 1． 4 细胞表面分子标志检测收集 107 个培养 3 ～ 4 d 的第 3、4 代成纤维样细胞制成细胞悬液，分别加入抗人 CD34-PE、CD45-FITC、CD105-PE、CD90FITC、CD73-PE、CD29-PE、CD44-FITC、CD14-PE、 CD19-FITC、HLA-Drpercp-A 等各 5 μl，鼠 IgG1 为阴性对照。4 ℃ 反应 30 min，流式细胞仪检测。 1． 5 细胞增殖能力的检测分别取原代、2、4、6 代成纤维样细胞，加入 UItraCULTURE 无血清培养液制成细胞悬液，以 1 × 105 / ml 的密度接种于 6 孔板内。第 3 d 起，每隔 1 d 消化并细胞计数，根据细胞数量绘制曲线。 1． 6 体外诱导分化以不加诱导剂的培养液培养的细胞为阴性对照。向脂肪细胞诱导分化：细胞以每孔 2 × 104 接种 T-25 cm2 塑料培养瓶和 6 孔板，诱导分化体系为含 10% FCS、10 － 6 mol / L 地塞米松、 100 μg / ml 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（ IBMX ）、50 μg / ml抗坏血酸的IMDM培养基。每 3 d 半量换液 1