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铜污染对空心莲子草根部解剖结构的影响刘林妹(上饶师范学院生命科学系05 级( 1)班05120116)摘要：利用光学显微技术，对本校区与铜矿区的空心莲子草的根进行形态解剖学对比研究。
结果表明：铜矿区生长的空心莲子草根部解剖结构与本校区生长的相比较，凯氏带增厚，通气组织进一步发达，气隙面积扩大。
关键词：空心莲子草铜根解剖结构、八、-前言1、空心莲子草的生物生态学特征空心莲子草( Alteoanthera philoxeroide ) 又名喜旱莲子草、水花生、革命空心觉，为苋科( Amaranthaceae) 莲子草属 ( llernantheraForsk )的一种多年生宿根性草本植物。
原产南美洲巴西等国[12]。
20世纪30 年代末日本侵华时引入我国并予以栽培。
该草广泛分布于淡水生境中；种子产量低，依靠水和风传播种子；克隆繁殖和克隆生长是空心莲子草在研究地区的主要繁殖和生长方式。
1.1 形态识别空心莲子草的根系属不定根系,不定根可进一步发育成肉质贮藏性根,即宿根,根直径1cm 左右；茎基部匍匐，长达约1.2m ，节处生须根(不定根) ，上部斜生或直立于水面，茎圆筒形,中空, 有分枝；幼茎及叶腋被白色或锈色柔毛，老时无毛；单叶对生，长圆形或长圆状倒卵形，长约2.5~5cm ，全缘，革质，两面无毛或被平伏毛，下面具颗粒状突起；叶柄长0.3~1cm，不明显；头状花序，花白色或粉红色，两性[12]。
1.2 生长习性空心莲子草适应广泛，适应性强，多生于海拔750m以下的水沟边、池塘边及湿地处。
该草能耐寒、耐旱、耐贫瘠，以根、茎进行营养繁殖。
深埋地下的根经年不腐；匍匐茎发达，并于节处生根，茎的节段亦可萌生成株，借以蔓延及扩散，茎蔓最长可达15m以上，茎段亦可随水流及人和动物的活动传播，1节匍匐茎或0.2 cm的肉质根仍可繁殖，甚至牲畜未消化完全的茎段还能全新萌发，并迅速在异地着土定植。
与作物及土著植物相比，作为入侵植物的空心莲子草的根系异常发达，生命力强，具有很强的入侵性。
第25卷第4期 湖北民族学院学报(自然科学版) Vol.25 No.4 2007年12月 Journal of Hubei I nstitute f or Nati onalities(Natural Science Editi on) Dec.2007空心莲子草不同提取物的抑菌作用研究程 超,李 伟,王 鹃(湖北民族学院生物科学与技术学院;湖北省生物资源保护与利用重点实验室,湖北恩施445000)摘要:以空心莲子草为实验材料,采用OD值法比较空心莲子草8种不同提取物对4种微生物的抑制作用,同时采用ST AT软件对结果进行聚类分析,结果表明:空心莲子草干粉酸性乙醇提取物6和80%乙醇处理后的空心莲子草残渣的水提物的60%乙醇沉淀物质4对大肠杆菌具有较好的抑制效果,空心莲子草醇提物的乙酸乙酯酯层萃取物5对枯草杆菌的抑制效果非常明显,空心莲子草醇提物的乙酸乙酯醇层萃取物8和80%乙醇处理后的空心莲子草残渣的水提物的60%乙醇沉淀物质4对金黄色葡萄球菌具有较明显的抑制效果,空心莲子草醇提物的乙酸乙酯萃取物5和8对苏云金芽孢杆菌抑制效果明显,聚类结果显示空心莲子草的乙酸乙酯提取物有别于其他提取物.关键词:空心莲子草;提取物;抑菌;聚类分析中图分类号:R151.3文献标识码:A文章编号:1008-8423(2007)04-0458-03空心莲子草(A lternan thera philoxeroides(M art.)Griseb),又名螃蜞菊、水花生、喜旱莲子草(以下简称APG),是多年生宿根草本[1,2].空心莲子草的生命力旺盛,田间、潮湿等地随处可见,目前人们对其的研究主要是将其作为田间杂草如何去除,但是空心莲子草具有很好的抗病毒作用[3],空心莲子草主要含黄酮甙、三萜皂甙、有机酸、酚性成分、香豆素、糖、脂肪、蛋白质、6-甲氧基木犀草素、7-a-L-鼠李糖甙(7-a-L-rha mnosy1-6-methoxyluteolin)及藤菊黄素(patuletin).具有清热、凉血、解毒,可用于流行性乙型脑炎早期、流行性出血热初期、麻疹[4,5]等疾病的治疗.为了开发这种丰富的植物资源,本文对空心莲子草不同提取物进行抑菌实验的初步研究,并利用聚类分析[6]探讨了不同提取物的抑菌作用的差异.1 实验材料、试剂、仪器空心莲子草:采自湖北省恩施市湖北民族学院院内,实验用其全草.于60℃烘干粉碎并过60目筛,装于棕色瓶中备用.试剂与仪器:石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯等;高速冷冻离心机(日本制造);真空旋转浓缩蒸发器(上海申科机械研究所);F D-155真空冷冻干燥机(北京医博实验仪器有限公司);7200S可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司).2 实验方法2.1 空心莲子草不同提取物的制备不同的化学成分对微生物的抑制能力是不同的,为了研究空心莲子草的主要抑菌成分,试验设定提取几种不同空心莲子草的化学物质,具体操作见以下试验方法.2.1.1 空心莲子草干粉水提取物 空心莲子草干粉60g,加600m l水,在60℃下水浴提取3h,过滤,滤液用旋转蒸发器减压浓缩,加95%乙醇至浓度为45%,取沉淀,进行冷冻干燥,取沉淀加少量水使之溶解,加5∶1的氯仿-正丁醇溶液,充分振荡,3600r/m in的转速离心10m in,取上清液,减压浓缩,透析,离心,除去杂质后进行冷冻干燥,得“空心莲子草干粉透析提取物1”;溶液再次进行减压浓缩后加95%的乙醇至浓度为收稿日期:2007-06-05.基金项目:湖北省生物资源保护与利用重点实验室开放课题(2007016);湖北民族学院2006年青年项目.作者简介:程超(1976-),女,硕士,主要从事食品化学及特色资源开发研究.60%,取沉淀,进行冷冻干燥,得“空心莲子草干粉水提物2”;2.1.2 空心莲子草干粉80%乙醇提取物 取空心莲子草干粉20g,加250m l80%的乙醇,充分振荡,浸提40h,取上清液,渣中再加入150m l80%的乙醇,再次振荡,浸提48h,取上清液,合并上清液,抽滤,将滤液转入分液漏斗中,加100m l 石油醚,充分振摇,静置10m in,取下层液,减压浓缩后进行冷冻干燥,得空心莲子草80%的乙醇提取物,为7号提取物.2.1.3 空心莲子草干粉乙醇提取后的残渣水提取物 取乙醇提取后的空心莲子草残渣150g,1000m l 水,40℃水浴提取2h,过滤,滤液减压蒸发浓缩后加95%的乙醇至浓度为45%,取沉淀加少量水使之溶解,加5∶1的氯仿-正丁醇溶液,充分振荡,3600r/m in 的转速离心10m in,取上清液,减压浓缩,透析,离心,除去杂质后进行冷冻干燥,得“干粉乙醇提取后的残渣水提物3”.溶液再次进行减压浓缩后加95%的乙醇至浓度为60%,取沉淀,进行冷冻干燥,得“空心莲子草干粉水提物4”;2.1.4 空心莲子草干粉乙酸乙酯提取物 空心莲子草干粉170g,用70%的乙醇萃取一周.萃取液减压浓缩至干,用热水反复溶解,趁热过滤,滤液中加入石油醚充分振摇,分离水层和醚层,水层用1.5%盐酸调pH 为2,加乙酸乙酯萃取;萃取液减压蒸发浓缩,冷冻干燥,得乙酸乙酯提取物5和8.2.1.5 空心莲子草干粉酸性乙醇提取物 空心莲子草干粉50g,加0.5%盐酸乙醇250m l,浸提48h,取上清液,渣中再加入0.5%盐酸乙醇250m l,充分振荡,浸提48h,取上清液,合并清液,减压蒸发浓缩至干,加200m l 浓氨水溶解,过滤,滤液减压浓缩,加100m l 无水甲醇,微加热,过滤,滤液减压浓缩,冷冻干燥,得空心莲子草干粉酸性乙醇提取物6.2.2 空心莲子草提取物的防腐作用首先将空心莲子草不同提取物配制成10mg/m l 的溶液备用.测定方法为:每种液体微生物试管中分别加入10mg/m l 的空心莲子草8种提取物的溶液,同时以相对应的液体试管菌种做对照,摇床培养,间隔2h 取样,用分光光度计测定其在600nm 吸光度A,记录数据,作出标准曲线图[7].如果加入空心莲子草提取物的试管在细菌的整个生长曲线中,OD 值低于对照,说明该提取物具有防腐作用.3 结果与分析3.1 空心莲子草8种提取物对细菌的抑制效果试验选取大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌4种细菌进行防腐实验,空心莲子草8种提取物对上述四种细菌的抑制效果见图1～4.由图1可以看出,4号和6号提取物对大肠杆菌具有较好的抑制效果,尤其是6号提取物在大肠杆菌培养的后期表现出非常明显的抑制效果,测定的细菌的A 600急剧下降.其他的几种提取物也有不同程度的抑制作用,但是抑制效果不太明显.在图2中,5号提取物对枯草杆菌的抑制效果非常明显,并且在枯草杆菌的培养初期即可表现出明显的抑制作用;8号提取物对枯草杆菌具有一定程度的促进作用,其他几种提取物对枯草杆菌均有一定程度的抑制效果,但不明显.由图3可以看出,8号提取物对金黄色葡萄球菌具有较明显的抑制效果,而7号提取物却具有一定程度的促进作用,其他几种提取物对金黄色葡萄球菌均有一定程度的抑制效果.954第4期 程 超等:空心莲子草不同提取物的抑菌作用研究 在图4中,5号和8号提取物即空心莲子草醇提物的乙酸乙酯萃取物对苏云金芽孢杆菌抑制效果明显,但是二者对苏云金芽孢杆菌的抑制作用不同,5号提取物在培养初期表现出较强的抑制效果,但是随着培养时间的延长其抑制效果有所减弱,可能是在苏云金芽孢杆菌培养过程中,5号提取物在苏云金芽孢杆菌的代谢产物作用下发生降解,从而使其作用减弱,但具体作用机理有待于进一步研究.8号提取物在培养的前2h 内抑制作用特别强,但随后迅速下降,表现为苏云金芽孢杆菌的吸光度值快速上升,表明细菌的菌体数在不断增加.其他几种提取物对苏云金芽孢杆菌均有一定程度的抑制效果.图5 空心莲子草不同提取物的聚类分析图Fig .5 The clustering of different extracti on fr om APG 综合图1～4可以看出,不同的空心莲子草提取物对不同细菌的抑制效果不同,同一种提取物对同一种细菌在不同的培养时间也表现出不同的抑制效果,这说明在不同的空心莲子草提取物中含有不同的功效成分,而不同的功效成分对不同的细菌类表现出抑制作用;同时这些功效成分在不同的细菌培养时间中,由于细菌代谢产物积累的效应,可能使得不同的功效成分发生了降解作用,从而使提取物的抑菌效果随培养时间表现出不同的特点,但是具体作用机理仍有待于进一步研究.3.2 空心莲子草8种提取物的聚类分析为了较好的说明空心莲子草不同提取物对细菌类抑制效果的关系,采用ST AT 软件对空心莲子草不同提取物的抑菌作用数据进行聚类分析,见图5.可以看出,2号提取物即空心莲子草干粉水提的60%乙醇沉淀物和4号即80%乙醇处理的空心莲子草干粉残渣水提后60%乙醇沉淀物防腐作用相近,而这两组物质与7号提取物的抑菌效果接近;此外5号和8号提取物即空心莲子草醇提物在用乙酸乙酯萃取处理后的物质防腐作用不同于其他处理,而且防腐作用也较好.这说明在这些提取物中有可能含有相类似的功效成分.4 结论与讨论综合以上实验结果可以看出,空心莲子草不同提取物对不同的细菌具有不同的抑制效果,这有可能是由于在空心莲子草不同的提取物中所含主要化学成分不同,从而导致了空心莲子草不同提取物的抑菌能力不同,具体空心莲子草不同提取物中的化学成分与防腐的关系有待于进一步研究.参考文献:[1] 娄远来,邓渊钰,沈纪冬,等.我国空心莲子草的研究现状[J ].江苏农业科学,2002(4):46-48.[2] 樊一桥,武谦虎,徐文强,等.空心莲子草醇提物对D -半乳糖胺诱导的肝损伤的影响[J ].抗感染药学,2004(3):115-117.[3] 赵维民,秦国伟.空心莲子草具杀灭钉螺活性皂甙成分的研究[J ].天然产物研究与开发,1999(1):12-17.[4] 袁慧,易厚生,付童生,等.空心莲子草有毒成分的研究[J ].湖南畜牧兽医杂志,1994(3):12-13.[5] 熊卫国,刘雅士,刘焱文.空心莲子草的化学成分研究[J ].中草药,2000(7):501-502.[6] 王东辉,陈根洪,田国政,等.茶树有性繁殖体变异研究[J ].湖北民族学院:自然科学版,2004,22(2):23-25.[7] 沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M ].北京:高等教育出版社,2004:97-99.(英文摘要下转第470页)参考文献:[1] 宋鄂平,胡胜华.丽水区域块状经济地理分布特征、绩效与形式机制的研究[J].湖北民族学院学报:自然科学版,2005,23(4):395-398.[2] 吕惠进.浙西南地区南北向构造带及其控矿作用的探讨[J].浙江地质,1995,11(1):13-15.[3] 陈和平,王深法,胡恒鹏.突发性山地灾害与土壤发生类型的相关性[J].土壤通报,2003,34(1):67-68.[4] 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or p reventing and reducing geol ogical disasters such as landslides as well as m ini m izing econom ic l osses and avoiding casualties.Key words:Q ingyuan county;landslide;circum stances;coures;p reventive measures(上接第460页)Study on the An tisepsis Effect of i n A lternan theraePh iloxeroi des(M a rt.)G riseb D i fferen t Extracti onCHENG Chao,L IW ei,WANG Juan(School of B i ol ogical Science and Technol ogy,Hubei I nstitute f or Nati onalities,Enshi445000,China)Abstract:I n this paper,using the APG as the ra w material,with the method of OD,the antisep sis effect of different extracti on on the four kinds of m icr obe was co mpared,and the results was clustered with the ST AT.The results showed that,the acidity-alcohol extracti on of APG and the p reci p itati on by60%alcohol of the APG residue had the antisep sis effect on the E.coli,the ethylactate extracti on had the obvi ous antisep sis effect on the B.subtilis, and the alcohol extracti on and the p reci p itati on by60%alcohol of the APG dealed with80%alcohol had the evi2 dent antisep sis effect on the Staphyl ococcus aureus,and the ethylacetate extracti on had the antisep sis effect on the Bvacillus thuringiensis.It showed that the ethylactate extracti on was different fr om the others by the clustering anal2 ysis.Key words:A lte m an thera philoxeroides(M art.)Griseb;extracti on;antisep sis effect;clustering anlysis。
空心莲子草的入侵机制及其防治对策张文艳;庞静【摘要】Alternanthera philoxeroides is a global invasive species,and it has become a important invasive species in freshwater ecosystems in temperate and tropical humid climate zones.It has negative impact on economy,environment and ecosystem.In this article,the biological characteristics of Alternanthera philoxeroides and its damages,invasion mechanism and prevention measures was reviewed.%空心莲子草为世界性的入侵物种,现已成为暖温带-热带湿润气候区淡水生态系统的重要外来入侵种,对经济、环境和生态系统产生了负面的影响.文章结合空心莲子草的生物学特性,对其危害、入侵机制以及防除措施方面进行评述.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2013(027)003【总页数】5页(P302-306)【关键词】空心莲子草;危害;入侵机制;综合防除【作者】张文艳;庞静【作者单位】湖北大学资源与环境学院,武汉430062;湖北大学资源与环境学院,武汉430062【正文语种】中文【中图分类】S451空心莲子草，原产于南美洲的巴西、乌拉圭、阿根廷等国［1］。
苋科，又名水花生、喜旱莲子草等，是中国亚热带及温带地区一种严重的外来多年生杂草［2］。
现已遍及美洲、澳洲、亚洲的许多国家和地区。
20世纪30年代末日本侵华时引入我国上海郊区作为马饲料予以栽培，其垂直分布的上限约为海拔700 m，在我国主要分布于44°N以南、97°E以东的海拔低且气候相对较暖湿的广大地区［3］。
当前，空心莲子草在我国各地区呈迅速蔓延之势，占据大量的农业及生态资源，造成了极大的经济损失，加强对该杂草的防治工作显得十分重要。
在生态文明建设大背景下，入侵物种绿色防控与地方环境保护紧密结合，成为防治过程中的重点与难点。
相较于传统的物理及化学防治，生物及生态防治具有成本低、时效长、环境友好等优势，可为我国农业可持续发展、生态恢复等战略的实施提供一定的理论基础与技术支撑。
1空心莲子草的危害空心莲子草（Alternanthera philoxeroides ）又名喜旱莲子草、水花生等，是原产于南美洲的苋科莲子草属多年生宿根草本植物，适宜生长于暖湿气候地区，喜水耐旱，适光范围广，以无性繁殖为主，可利用根茎节段繁殖新植株[1]。
伴随贸易全球化的迅猛发展，空心莲子草由原产地逐步蔓延至世界各地，多分布在我国北纬44°以南、东经97°以东，海拔较低、气候相对暖湿的长江流域及南方各省份[2-3]。
早在2003年，空心莲子草就已被列入《中国第一批外来入侵物种名单》[4]。
空心莲子草对入侵地区的航运水利、淡水养殖、生态环境、生物多样性及物种基因库等多方面造成危害，其入侵农田后同农作物争夺水分、光照、肥料和生长空间，导致多种粮食、油料和经济作物不同程度减产，尤其是对水稻产量影响较大[5]。
喻大昭等发现，水稻穗长、有效穗数、千粒质量及产量等多项数据均随空心莲子草密度增加而显著降低[6]。
此外，空心莲子草能向周边环境释放多种化感物质，使周边植物的光合色素含量降低，保护性氧化物酶活性下降，细胞膜结构被破坏，妨碍有丝分裂和DNA 复制修复等，导致油菜、玉米、水稻和小麦等多种农作物的种子萌发、幼苗生长和新陈代谢受抑制[7]。
外来入侵物种每年对我国造成数千亿元的经济损失，对社会经济和人们生产生活构成重大威胁，其中空心莲子草是危害我国大部分省份和水域的恶性杂草之一，相关防治工作势在必行。
2空心莲子草入侵机制根据表型差异，可将空心莲子草分为水生型和陆收稿日期：2022-02-11基金项目：长江大学“校级大学生创新创业训练计划项目”（Yz2020264）。
空心莲子草的防除
张敦阳;顾德明;吴彩全
【期刊名称】《农药科学与管理》
【年(卷),期】1993(000)004
【摘要】空心莲子草(Alternanthera philoxeroide Griseb.)日前在江苏省已成为草坪、蔬菜田杂草的亚优势种群,严重危害农作物生长,其适应性强,再生繁殖力旺盛,并可迅速蔓延,难以根除。
为此,江苏省农药检定所在田间进行了药剂防除试验。
试验筛选出防除空心莲子草的理想药剂——使它隆(fluroxypyr)及分别与草甘膦(glyphosate)、2甲4氯(MCPA)、助剂885的混用配方。
研究结果表明使它隆用量在450～1250mL/hm~2范围内,防效随药量的增加而增高;用药期应掌握在出草高峰后和进入植株伸长始盛期。
同时还发现使它隆对水稻生长及
【总页数】1页(P21-21)
【作者】张敦阳;顾德明;吴彩全
【作者单位】江苏省农药检定所;江苏省农药检定所
【正文语种】中文
【中图分类】S48
【相关文献】
1.六种除草剂对草坪空心莲子草的防除效果比较 [J], 聂均铭;邓沛飞;林肖楠;钟春燕
2.空心莲子草入侵从江县的风险评估与防除措施 [J], 越燕;李元荣;韦江龙;杨艳娟
3.麦冬草坪中多年生杂草空心莲子草的化学防除 [J], 陈月阳;蔡靖萱;陈勇睿;邓维;冯建国;袁树忠
4.麦冬草坪中多年生杂草空心莲子草的化学防除 [J], 陈月阳;蔡靖萱;陈勇睿;邓维;冯建国;袁树忠
5.几种除草剂与莲子草假隔链格孢混用防除空心莲子草的初步研究 [J], 向梅梅;游明龙
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第41卷第2期2014年4月植物保护学报ACTA PHYTOPHYLACICA SINICAVol．41No．2Apr．2014基金项目：安徽省农业科学院院长青年创新基金项目（12B1122）作者简介：周凤艳，女，1982年生，助理研究员，研究方向为杂草抗性机制与生物防治，E-mail ：zhoufy1982@163．com 收稿日期：2013－09－03空心莲子草致病菌假隔链格孢菌原生质体的制备与再生周凤艳1张勇1周振荣2刘小林1（1．安徽省农业科学院，植物保护与农产品质量安全研究所，合肥230031；2．当涂县农业技术推广中心，安徽当涂243100）摘要：为建立空心莲子草致病菌假隔链格孢菌Nimbya alternantherae 的原生质体提取体系，以其强致病性野生型菌株N．alternantherae 11-2为供试菌株，研究了不同菌龄、酶系统、酶解时间及稳渗剂等对假隔链格孢菌原生质体制备及再生的影响，并采用聚乙二醇PEG 介导转化法，构建了随机插入突变体库。
结果表明，在酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中培养2d 的假隔链格孢菌丝体，以0.7M 山梨醇为稳渗剂，同时使用2%裂解酶、2%崩溃酶和2%蜗牛酶3种酶的混合液，在30ħ下酶解3h 能获得足量的原生质体，且其再生率也可满足后继转化试验的要求。
关键词：假隔链格孢菌；原生质体；突变体Preparation and regeneration of protoplasts for alligator weedpathogen Nimbya alternantheraeZhou Fengyan 1Zhang Yong 1Zhou Zhenrong 2Liu Xiaolin 1（1．Institute of Plant Protection and Aro-Product Safety ，Anhui Academy of Agricultural Sciences ，Hefei 230031，Anhui Province ，China ；2．Dangtu County Agriculture Technology andPopularization Center ，Dangtu 243100，Anhui Province ，China ）Abstract ：Nimbya alternantherae is a pathogenic fungus of the invasive alligator weed ，Alternanthera philoxeroides （Mart．）Griseb．In this study ，a highly pathogenic and wild-type strain of N．alternantherae 11-2was selected to establish a protoplast extraction system．The influences of age ，enzyme system ，enzymolysis time and osmotic stabilizer on the preparation and regeneration of fungal protoplasts were examined．In addition ，the polyethylene glycol-mediated transformation method was used to establish a randomly inserted mutant library．The results showed that sufficient protoplasts could be produced when N．alternantherae hyphostroma were cultivated in a liquid medium of yeast extract peptone dextrose for 2days and then underwent 3hours of enzymolysis at 30ħ，with 0．7M sorbierite as the osmotic stabilizer along with a mixture of 2%lyase ，2%driselase ，and 2%snailase．Furthermore ，the regeneration rate of N．alternantherae protoplasts could also meet the requirements of subsequent transformation experiments．Key words ：Nimbya alternantherae ；protoplast ；mutant 空心莲子草Alternanthera philoxeroides 因其具有繁殖迅速、适应性强等特点，于20世纪50年代被引入我国江苏和浙江等地作为牲畜饲料植物栽培，随后相继传入全国各地并引起草害，与农作物争夺水分、肥料、阳光和生长空间，导致农作物严重减产，同时还会对水产、水利、航运、物种资源、生态环境等产生极为不利的影响，成为全国大部分省区和水域的恶性杂草之一［1］。
目前我国对空心莲子草以化学防治为主，有几种除草剂如水花生净，对防除空心莲子草效果比较显著，但因其残留期较长而受到限制。
许多真菌毒素由于具有特异性生理活性和高度专化性作用位点，即使在很低的浓度下也能引起寄主植物的特异性反应，而且和传统的化学农药相比，往往具有化学结构新颖、低毒、低残留等特点，因此成为开发生物除草剂优先和重点考虑的对象。
国内外近十年来对于空心莲子草的生物防治研究也逐渐开展了起来，其中以对假隔链格孢菌Nimbya alternan-therae的研究居多。
Barreto＆Torres［2］在上世纪90年代末从巴西的空心莲子草上分离获得了2个致病菌，假隔链格孢菌和莲子草尾孢菌Cercospora alternantherae，并发现前者的致病力显著高于后者，具有生物防治潜力。
此后，假隔链格孢菌对空心莲子草具有致病力的报道陆续在中国［3］、澳大利亚［4］以及美国［5］等国家出现。
田间试验表明，假隔链格孢菌SF193菌株防除空心莲子草的最适合浓度配比为1ʒ5 1ʒ10，其原液7d后对空心莲子草的鲜重防效高于化学除草剂氯氟吡氧乙酸［6］。
在自然界中，许多致病真菌尤其是腐生性真菌都能够产生毒素，毒素对于致病真菌成功侵染寄主是必需的或者是兼容性的因子［7］。
在对假隔链格孢菌分泌的毒素进行分离、纯化以及鉴定后，发现该物质为2-乙酰基-3，4-二羟基-5-甲氧基苯乙酸（vulculic acid）［8］。
该物质是非寄主专一性毒素，能够引起空心莲子草根尖组织防御酶活性发生变化［9］。
用不同浓度的假隔链格孢菌毒素处理空心莲子草叶片和根尖，发现叶绿体和线粒体可能是莲子草假隔链格孢毒素作用的初始位点［10］。
此外，还发现假隔链格孢菌在入侵空心莲子草时会导致植物细胞内活性氧的迅速上升，从而对叶片造成严重破坏［11］。
综上所述，目前国内外主要侧重于假隔链格孢菌对空心莲子草防治的生理生化研究，但在其毒素合成路径的分子作用机制方面还未开展相关工作。
而不同变异菌株的致病性、产毒能力和遗传稳定性往往存在较大差异，会给未来生产带来障碍。
因此，研究致病菌产毒的相关基因、毒素合成的分子调控机制和致病机理，将会为这些毒素开发成为新的生物除草剂提供坚实的理论依据和技术支撑。
近年来，分子遗传学研究极大地推动了对植物致病真菌产毒机制和侵染相关基因的认识。
利用现代分子生物学技术产生新的基因敲除突变体和缺毒突变体，研究毒素生物合成的相关基因、以及哪些基因的改变有助于提高病原体的致病性，对于揭示真菌的致病机理是至关重要的［12］。
而若想获得真菌产毒突变体，首先需要获得具有再生能力的原生质体，它是遗传操作的基础。
因此，针对不同真菌，建立合适的原生质体提取体系对后继试验至关重要。
目前国内已经探索出多个真菌的原生质体提取体系，如禾谷镰孢菌Fusari-um graminearum［13］、黑曲霉Aspergillus niger［14］和刺孢吸水链霉菌Streptomyces hygrospinocus等［15］。
但截至目前，还没有假隔链格孢菌原生质体提取方法的报道。
本研究旨在建立假隔链格孢菌原生质体的提取与再生体系，并通过随机插入PEG介导转化法，建立假隔链格孢菌产毒突变体库，为后期探索其毒素合成路径搭建平台。
1材料与方法1．1材料供试菌株：空心莲子草假隔链格孢菌N．alter-nantherae11-2菌株由染病空心莲子草上分离鉴定获得（GenBank登录号JQ905258），本实验室保存。
质粒：质粒pCB1636由美国弗吉尼亚生物信息研究所Christopher B．Lawrence教授赠送。
培养基：菌丝生长培养基：PD培养基（马铃薯200g、蔗糖20g，加水定容至1L）、PDA培养基（取200mL PD培养基，加入2．6g琼脂粉）、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基（1%蛋白胨、0．3%酵母浸出物、2%葡萄糖）、酵母浸出葡萄糖（yeast extract dextrose，YED）培养基（0．5%酵母提取物、1%葡萄糖）、原生质体再生培养基（0．1%酵母提取物、1M蔗糖、1%琼脂、0．1%蛋白胨）。
试剂：蜗牛酶（snailase），购自上海经科化学科技有限公司；崩溃酶（driselase）、裂解酶（lyase）、纤维素酶（cellulase），购自Sigma公司；稳渗剂：NaCl、KCl、山梨醇、蔗糖、MgSO4各0．7M。
其它试剂：STC（1M sorbitol、10mM CaCl2、10mM Tris-Cl，pH7．5）、40%PEG4000（用STC配制）均为国产分析纯，购自合肥欣乐生物有限公司；Takara PrimeSTAＲMaX DNA Polymerase，购自宝生物工程（大连）有限公司。
251植物保护学报41卷仪器：PCＲ仪BIO-ＲAD S1000，购自深圳市宇德立生物科技有限公司；凝胶成像系统Tanon-3500，购自上海天能科技有限公司。
1．2方法1．2．1原生质体的制备与再生方法参考Tanaka等［16］和Cho等［17］方法，并做适当修改。
菌丝培养2d后，用装有2层无菌擦镜纸的漏斗过滤，收集菌丝，用无菌水冲洗后再用稳渗剂冲洗1次；取0．2g湿菌丝加入10mL酶组合液中裂解，酶解若干小时；将酶解好含原生质体的酶解液用3层无菌擦镜纸过滤后，用稳渗剂冲洗1次收集于50mL离心管中；室温3000r/min离心10min，弃上清，加入10mL STC溶液重新悬浮和离心1 2次，最后用STC溶液悬浮原生质体至所需浓度。
