组织学制片技术(本科)

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组织病理学技术

组织病理学技术组织病理学技术一. 实验综述组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。

是一门新兴的学科。

在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。

主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。

同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。

为由基础走向临床打下坚实的基础。

二. 实验目的1. 掌握病理组织切片的基本制作过程步骤2. 掌握病变器官的代谢和机能的改变3. 明白病理组织切片制作过程中的注意事项4. 了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项二.实验材料1. 实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签2. 实验试剂：福尔马林、酒精（50% 55% 70% 75% 80% 85% 95% 无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶四.实验步骤（一）取材从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。

1. 取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。

为此要选取病变显著的区域和可疑灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。

较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。

2. 取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性，避免认为变化。

为此，切取组织块的剪刀要锋利，切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。

3. 组织块的大小要适当，通常其长、宽、厚以 1.5 X1X 0.4cm为宜，必要时可增大到2X 1.5 x 0.5cm,以便于固定液迅速浸透。

《组织学制片技术与电镜》习题

《组织学制片技术与电镜》习题第一部分组织学技术和免疫组织化学技术一、选择题（一）A1型题(标准型)1.免疫组化技术的关键步骤是A.标本处理B.抗体的处理与保存C.免疫染色D.设立对照试验E.结果判断2.免疫组化技术的首要试剂是A.抗原B.抗体C.标记物D.固定剂E.洗涤液3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。

B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。

C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理20～30min。

D.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。

E.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。

4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的A.1950B.1960C.1970D.1980E.19905.PAP复合物中的酶是A.辣根过氧化物酶B.碱性磷酸酶C.葡萄糖氧化酶D.胃蛋白酶E.胶原酶8.PAP法中的“桥”是A.第一抗体B. 第二抗体C. 第三抗体D.亲和素E.第四抗体9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术A.1961B.1975C.1981D.1985E.199010.ABC法中的“桥”是指A.第一抗体B. 第二抗体C. 第三抗体D.亲和素E.链霉素亲和素14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色A.4℃B.20℃C.40℃D.37℃E.50℃23．PAS反应是检测组织内的：A.核酸B.脂C.蛋白质D.多糖E.抗原一、填空1、免疫组织化学中最常用的标记物是__________、____________ 、___________、____________。

原位杂交组织化学中常用的标记物有___________和___________两大类。

常用实验技术

当取下脏器灌注时，所留的动脉干要长一些，以便插入导管。灌注器官内血管制作铸型或透明标本，以离体局部灌注效果较好。其方法为：将新鲜标本以1%肝素生理盐水（37℃）灌注动脉后，分别灌入5%、10%、20%ABS丁酮溶液，丁酮中加入适量的大红油画颜料，第二天再补充灌注20%ABS丁酮溶液100mL，浸入温水中6小时，-30℃冰箱中低温冰冻48小时，横断面切割，解冻后辨别形态结构。
A.顺行标记；B.逆行标记；C.跨节标记
3.免疫组织化学法
免疫组织化学法又称免疫细胞化学法，是综合应用免疫学及组织化学原理，对组织或细胞的某些抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、受体等）在组织或细胞的原位进行定位、定性和定量测定。
即应用抗原抗体特异性结合，用特异性抗体去检测组织或细胞中同类抗原物质；并由于抗原抗体复合物是无色的，还须借助组织化学的呈色反应将抗原抗体结合的部位显示出来。免疫组织化学法把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙结合起来，具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合的优点。
2.组织化学方法
组织化学与细胞化学都是建立在细胞学、组织学和生物化学基础上，针对细胞中的不同组分，利用化学或物理的方法使其形成不同的有色反应沉淀物，从而在显微镜下观察。这是一种最基础的细胞和组织研究技术，具体如下。
（1）糖原显色方法：过碘酸雪夫反应，显示糖原和其他多糖物质为紫红色。
（2）核酸显色方法：孚尔根显色法，显示DNA呈现紫红色。甲绿-派郎宁法显色法，显示DNA呈现蓝绿色，RNA呈现红色。
（2）非切片标本制备：指不经包埋和切片步骤制作成组织标本，主要包括涂片、铺片或磨片标本的制备。例如，血液、脱落细胞、分泌物等可直接涂在载玻片上，称涂片法；疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织可在玻片上撕开展平，称铺片法；而骨和牙可直接研磨成薄的磨片贴附在载玻片上，称磨片法。骨和牙还可以用酸脱钙后再按常规制成切片外，进行染色观察。

组织病理学制片技术

Notice
1.上课请关手听一次，下次课班长提交选修课学生名单(包括email)。
3. 学分问题 ⑴ 平时表现如：纪律、问答、作业。 ⑵ 结课测验? ⑶ 对本课程的意见和建议；
生命科学研究中心邢立强 emxlq@
目的和要求
三、脱水(Dehydration)
组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混溶。因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水。
常见的脱水剂有乙醇、正丁醇、丙酮等。为防止水份丢失过快，造成组织变形，一般
病理技术的应用
Application of pathologic technique
帮助临床查明死因(尸检); 手术后病变标本，明确诊断(临床活检); 为教学、科研提供资料;
第一节组织处理
Tissue processing
取材(Sample collection)→固定(Fixation)→ 脱水(Dehydration)→透明(Transparentizing) →浸蜡(Paraffin soaking)→包埋(Embedding)
（五）固定时的注意事项
1. 标本应新鲜并及时取材，快速放入固定液中。特殊标本应单独固定和存放。
2. 固定液的用量一般固定液用量为组织块体积的 10~20倍，贵重的固定液不少于3~5倍。避免组织紧贴容器底部，影响固定效果。对于特殊染色的组织 (如神经染色及酶组织化学染色等)固定时应考虑组织块的大小、固定液种类、固定时间和温度等。酶组织化学染色组织的固定应置于冰箱4℃固定。
固定就是用物理或化学方法，阻止组织细胞离体或培养细胞脱离生存环境后发生形态学变化。
(一)固定的目的
1. 迅速阻断组织细胞离体后的自溶性变化，防止腐败，尽量保持组织细胞生活状态下的形态结构。

绪论

106050073 胡燕预防医101绪论思考题一.选择题1．组织学中最常用的制片技术 AA. 石蜡切片B.火棉胶切片C.冰冻切片D.涂片E.铺片2．用于光镜观察的石蜡切片厚度一般是 BA.1～2μmB.5～10μmC.50～80μmD.5～10 nmE.50～80 nm3. 多糖经过碘酸氧化出现 CA.羟基B.羧基C.醛基 D 氨基 E.硫氢基4．PAS反应显示的是组织和细胞内的 CA.蛋白质B.脂类C.多糖D.核糖核酸E.脱氧核糖核酸5．涂片一般适用于 EA.上皮组织B.骨组织C.肌组织D.神经组织E.血液6. 下列HE染色法的叙述那一个是正确的 DA．能显示细胞的高尔基复合体B．能显示网状纤维C．能将细胞膜染成蓝紫色D．能将细胞核染成蓝紫色E．能将弹性纤维染成黑色7．透射电镜的最大分辨率约为 CA. 0.2 mmB. 0.2μmC. 0.2 nmD. 2.0μmE. 2.0 nm二、名词解释1.H-E 染色: 即苏木精-伊红染色法。

苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内核糖体着紫蓝色；伊红为酸性，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着粉红色。

2.嗜碱性：组织或细胞结构对碱性染料亲和性强的称嗜碱性。

3.嗜酸性：组织或细胞结构对酸性染料亲和性强的称嗜酸性。

4.组织学定义：医学组织学是研究机体微细结构及其相关功能的科学。

5.嗜银性：组织结构通过还原剂间接使硝酸银还原而显（黑）色的性质称嗜银性。

6.亲银性：细胞组织经硝酸银浸润后，可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上，呈棕黑色，这种性质称亲银性7.异染性：在用单一染料染细胞和组织时，染色部分被染成与染剂色调不同的颜色8. PAS反应：用高碘酸氧化多糖时，醛基被游离出来，而显Schiff阳性反应，这种Schiff 反应称为PAS三.填空题1.组织学的研究内容包括（细胞、组织和器官系统）2.人体四大组织包括（上皮组织、结缔组织、肌组织、神经组织）。

组织学制片技术

组织学制片技术

目的要求
1、了解组织学制片的基本程序；
2、熟悉HE染色的步骤；
3、掌握HE染色结果的观察。
一、组织学常用的几种标本类型
1．切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常用的标本。
2．铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载玻片上，经固定、染色、封固而制成的标本。
3、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。二甲苯：透明组织的能力强，但易使组织收缩和变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时间可以延长至24小时也无妨。
（五）包埋
1．目的：由于生物体的组织有各种硬度不同的成份，必须加石蜡等作支持物质渗入组织块内部，并将组织块包埋起来，然后用切片机以制作极薄的切片。 2．种类：包埋物质目前广泛采用的除石蜡外，还有火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、OTC(冰冻切片包埋剂）等。
1、动物致死法：（1）颈椎脱臼法（2）断头法（4）空气栓塞法：
2、组织取材时应注意： (1)所取材料越新鲜越好； (2) 切取组织的刀剪刃口必须锋利； (3) 取材时必须考虑切面的方向； (4)组织块应力求小而薄； (5)收缩较大的新鲜组织； (6)注意清洁；（3）麻醉法
（三）标本的固定
8．活体标本：在组织细胞生活状态下进行观察的标本，或生活状态下进行活体染色后制成的标本。
9 ．血管注射标本：一种是将树脂类铸形剂经血管灌注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织而制成的血管铸形标本，可瓶装供肉眼观察或进一步处理后作扫描电镜观察。另一种是将染料加明胶配制成染色液注入血管内，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成的组织切片标本。这类标本主要用于了解血管的走行及其与所支配组织或器官的相互关系。

组织切片技术..

（10％福尔马林）。甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pH 为7.6，能长期保持中性。甲醛固定后，通常需在流水中冲洗24-48小时,否则影响染色效果。
(2) 4％多聚甲醛固定液
最好是动物经灌注固定取材后，继续固定2-24h。该固定剂较为温和，适用于组织标本的长期保存。
变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情
而定
注意事项：
1.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。 2.更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 3.在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材
料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后
除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否
适当和完全。
固定的目的和作用在于：
① 防止组织自溶和腐败；
② 使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而
保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构； ③ 因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色； ④ 固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。
动物的选择
动物的选择是组织切片取材的第一步,在组织学
中以人的组织为理想，但人的组织不易得到，根据研
究的需要，大都以动物的组织来代替。有些动物的组织器官比人的组织更为典型，如：猪的肝脏；豚鼠胰腺、内耳；猫的肋间肌显示运动终板；兔的皮下组织和肠系膜作活体染色较为理想等。
动物的处死

组织制片技术原理与流程及切片机的使用

组织制片技术原理与流程及切片机的使用组织制片的特点组织制片是组织学、胚胎学、病理学、生物学等学科观察和研究组织、细胞的正常形态和病理变化的常用方法。

其基本原理是用固定剂固定组织、细胞以及各种亚细胞器，保持组织的微细结构，制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差，在显微镜下观察组织、细胞的形态结构，或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分，并可进行形态和化学成分的定量分析。

随着细胞和分子生物学技术的发展，组织制片也为原位显示细胞内基因表达提供了基础。

一石蜡包埋切片制作石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂，故固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织中的水，后用二甲苯等透明剂置换出乙醇，此过程即脱水、透明。

再用石蜡渗入组织块，冷凝后变硬，即浸蜡、包埋，就可在切片机上切片了。

1.固定细胞、组织离体后要迅速用相应的固定剂固定，使蛋白质沉淀、变性、凝固，保持组织原有的形态结构和抗原性。

一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或Carnoy于4℃并向固定过夜。

2.脱水与透明固定后的组织须由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，一般为50%、70%、85%、95%、和100%（3次）3.渗蜡与包埋渗蜡是石蜡置换组织块中透明剂的过程，一般用熔点为52-60℃的石蜡。

透明后的组织块先于1/1体积的二甲苯与石蜡中37℃渗透过夜，后温度调至58℃换入纯石蜡继续渗透，一般每间隔3h换一次纯石蜡，直到无二甲苯气味即可进行包埋。

4.切片与展片先用刀片修去组织块周围多余的石蜡，一般保留2mm左右的石蜡，修整成梯形的组织块，以便于展片时蜡带的分离。

先加热刀片，后把修好的组织块快速粘到方形的小木块上，冷凝后即可进行切片。

一般组织切片的厚度为6-12um，切片速度以40-50次/min为宜，用毛笔托起蜡带，分割后依次放到洁净的载玻片上，蜡带的光滑面朝下放，后滴上适量的蒸馏水放至展片台上于37-40℃烤片过夜。

5. 染色、脱水、透明与封片染色一般是双重染色或单染，番红与固绿是常用双重染色法，而苏木精是最优良的核染色剂。

常规组织制片技术在病理学实验教学中的应用

学生的学习要求，而且有时还会把一些人为制片的 “ 假象” 误认为病理现象。因此本课题组在医科大学部分专业的病理实验教学中讲授了常规组织制片技术及优质切片的判断标准，同时为学生进行现场演示操作并让其亲自参与。该技术方法在病理实验课中的推广，不仅使学生通过观察实验切片的内容来加深掌握所学的理论知识，而且使学生对该技术有一个全面的了解和认识，为将来的进一步深造奠
研究细胞生理和病理形态变化的一种主要的技术方
生在实验课中真正能有所收获。
１实验模式的施行
法．３Ｊ。在常规组织制片技术中最常用的是ＨＥ染色。ＨＥ染色是一种以形态为基础结合应用化学技术对组织各种细胞进行染色的实验技术。目前在病理实验课教学中单纯地讲授疾病的病理知识，并未让学生了解切片制作的过程及如何判
迎。
关键词：病理学；实验教学；ＨＥ染色
中图分类号：Ｒ３６文献标志码：Ａ文章编号：２０９５—１４５０（２０１３）０７— ０６８５— ０２ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．２０９５—１４５０．２０１３．０７．１２
２００２．４：２８—３０．

组织学技术

组织学技术（供动物学、发育生物学硕士研究生用）参考书目1．杜卓民1982 实用组织学技术人民卫生出版社2．芮菊生等1980 组织切片技术人民教育出版社3．郑国昌1979 生物显微技术人民教育出版社组织学技术组织学技术是高等院校生物学、医学、农林院校以及科研单位的一项最基本的实验室技术和工作手段。

无论在教学还是在科研工作中，凡是对人体或生物体进行微细结构观察时，大多数需要依靠组织学技术来完成。

随着科学技术的不断进步，组织学技术在不断的发展，使得组织学的研究方法很多。

目前，组织学的研究方法主要包括一般光镜技术、组织细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术、电镜技术和组织培养技术等六大类。

本课程计划以同学们的实际操作为主，主要掌握一般光镜技术中的石蜡切片技术。

第一章实验室基本设备及常用试剂一、基本设备组织学实验室的常用设备主要有观察组织标本用的显微镜及制作标本用的必要设备和工具。

（一）显微镜种类很多，功能也各不相同。

用于组织切片观察的主要是透射光学显微镜。

该镜所观察的放大倍数为物镜放大率和目镜放大率之积。

为显示观察到的材料的大小，常需要在目镜内安装目镜测微尺。

目镜测微尺为一块圆形玻璃片，普通用测量长度的标尺为直线式，一般长5mm，分成1个大格，每1大格又分成10个小格，共50小格。

目镜测微尺安装在目镜的光阑上，有刻度的一面朝下。

目镜测微尺每1小格所代表的实际长度（10×或40×）要用镜台测微尺进行标定。

参考郑国昌《生物显微技术》P185-189 。

（二）切片机切片机一般有三种类型，即旋转式、滑动式、冰冻式。

这三种切片机均具有三种主要部件：①固定切片刀的刀架。

②夹持组织片的夹具。

③推动组织夹具的微动调节器。

滑动切片机多用于火棉胶切片，故又称火棉胶切片机。

它常用于制作大块标本、囊状器官和易于塌陷的组织切片。

冰冻切片机是将组织切片承托台改换成急速冷冻装置（约-20~-30℃），这种急速冷冻装置可以是液态二氧化碳，也可以用半导体制冷装置。

组织学与胚胎学题库

组织学与胚胎学题库1、制作组织切片时包埋的目的是：(单选题)A、固定组织使细胞不崩解B、使组织变硬易切C、把一种组织埋人另一种组织中D、便于对比观察E、使组织呈一定颜色答案： B2、组织学中最常用的制片技术是：(单选题)A、石蜡切片B、火棉胶切片C、冰冻切片D、铺片E、磨片答案： A3、PAS反应显示组织或细胞内的(单选题)A、核酸B、脂类C、多糖D、蛋白水解酶E、抗原答案： C4、光镜结构常用计量单位是:(单选题)A、μmB、 mmC、 nmD、 cmE、 A答案： A5、关于细胞外基质,下列哪项错误：(单选题)A、是细胞产生的非细胞质B、具有支持、联系、保护和营养的作用C、参与构成细胞的微环境D、血浆、淋巴液、组织液等体液不属于细胞间质E、可以进入毛细血管和淋巴答案： D6、光镜下观察组织石蜡包埋切片的厚度一般是：(单选题)A、 100nmB、 0. 1~0. 5 umC、 5~8umD、 50nmE、 1mm答案： C7、研究细胞器的超微结构用:(单选题)A、透射电子显微镜B、扫描电镜C、荧光显微镜D、暗视野显微镜E、相差显微镜答案： A8、畜禽机体结构和功能的基本单位是:(单选题)A、细胞B、组织C、器官D、系统E、体系答案： A9、电子显微镜最高的分辨率为:(单选题)A、 0.2nmB、 2nmC、0.2μmD、 10nmE、0.04μm答案： A10、研究细胞表面结构用:(单选题)A、透射电子显微镜B、扫描电镜C、荧光显微镜D、暗视野显微镜E、相差显微镜答案： B11、研究细胞表面结构用:(单选题)A、透射电子显微镜B、扫描电镜C、荧光显微镜D、暗视野显微镜E、相差显微镜答案： B12、冰冻切片：(单选题)A、能较好地保存酶的活性B、冷冻后用普通切片机进行切片的技术C、能较好地保存微细结构D、最常用于骨组织E、比石蜡切片应用更广泛答案： A13、在还原剂存在时被硝酸银染成黑色的结构具有：(单选题)A、嗜银性B、嗜酸性C、嗜碱性D、亲银性E、嗜中性答案： A14、光镜组织切片和电镜组织切片: (单选题)A、均为超薄切片B、均用化学染料染色C、均可制冷冻切片D、均为固定组织E、均可摄彩色照片答案： D15、下列关于组织构成叙述正确的是：(单选题)A、细胞和无定形基质B、细胞和细胞外基质C、细胞和组织液D、基质、纤维和组织液E、细胞和培养基答案： B16、对组织学染色的表述正确的是：(单选题)A、最常用的是酸性苏木精和碱性伊红染色法,简称HE染色B、酸性苏木精可将细胞核染为蓝色,碱性伊红可将细胞质染成粉红色C、有的生物样品无色透明,难以在镜下观察,故要对组织切片进行染色D、碱性苏木精可将细胞质染为红色,酸性伊红可将细胞核染为蓝色E、能过冰冻切片，不能进行染色答案： C17、HE染色中核染为:(单选题)A、蓝紫色B、粉红色C、橘红色D、黄绿色E、蓝绿色答案： A18、超微结构常用计量单位是:(单选题)A、μmB、 mmC、 nmD、 cmE、 A答案： C19、光学显微镜最高的分辨率为:(单选题)A、 2nmB、0.2μmC、 0.2nmD、2μmE、5μm答案： B20、以下表述中,哪一项错误：(单选题)A、组织学的研究内容包括细胞、组织和器官系统三部分B、细胞间质是非细胞产物,它构成了细胞生活的微环境C、不同的组织构成器官或系统D、结构与功能相似的细胞群及细胞间质构成组织E、器官一般由多种组织构成答案： B21、以下属于石蜡切片的制作步骤的是：(多选题)A、取材和固定B、脱水和包埋C、培养和计数D、切片和染色E、封片答案： ABDE22、基本组织一般包括：(多选题)A、上皮组织B、结缔组织C、肌组织D、神经组织E、淋巴组织答案： ABCD23、组织学的研究水平包括： (多选题)A、子B、细胞C、胞D、织E、官答案： ABCD24、HE的染色法的染料是_______（碱性）和_______（酸性）,组织切片中与前者亲和力强的着色结构称_______,与后者亲和力强的着色结构称_______,与两者亲和力均不强者称_______。

《动物组织制片技术》教学大纲

《动物组织制片技术》教学大纲课程名称：动物组织制片技术英文名称：Animal tissue slicing technology课程总学时：32学时课程总学分：2学分适用专业：动物医学一、课程性质与任务动物组织制片技术是动物医学及生物学领域中十分重要的实验技术，是动物医学专业必修课《动物组织学与胚胎学》的重要补充和深化，其主要内容包括组织学标本制作的基本理论、常规组织学制片技术、各组织器官的特殊染色技术、组织化学技术、胚胎标本制作技术、显微摄影技术等。

通过本课程的学习，以掌握观察和研究动物有机体细微结构的基本方法。

本课程共计32学时（理论16，实验16）。

二、教学目的与要求1．理论知识方面：掌握组织制片的基本理论，尤其牢固掌握石蜡切片的原理与步骤。

2．实验技术方面：掌握组织学常规HE染色、常用特殊染色和组织化学染色。

三．教学重点与难点教学重点：组织制片的基本原理，石蜡切片常规HE染色技术。

教学难点：特殊染色和组织化学染色技术。

四．教学方法与手段理论讲授与实验操作相结合，以实验操作为主。

五．教学内容与目标教学内容教学目标学时分配（32学时）（一）理论部分(16学时) 1．组织学技术概述 31.1 组织学技术的发展与应用了解 11.2 组织学制片方法概述掌握 11.3 实验室的主要设备及常用试剂理解 12．石蜡切片技术82.1 动物麻醉与取材掌握 12.2 固定液与组织固定掌握 12.3 组织冲洗掌握 12.4 脱水剂与组织脱水掌握 12.5 透明剂与组织透明掌握 12.6 组织渗蜡与包埋掌握 12.7 组织切片、贴片与烤片掌握 12.8 染料与组织片染色掌握 1 3．其他制片技术简介 43.1 冷冻切片技术了解0.53.2 火棉胶切片技术了解0.53.3 组织铺片技术掌握0.53.4 组织涂片技术掌握0.53.5 组织磨片技术掌握0.53.6 组织化学技术理解 1.5 4．显微摄影技术简介 14.1 全自动显微摄影及其装置了解0.54.2 摄影方法与显微照片放大倍数的计算方法了解0.5 （二）实验部分(16学时) 实验一、动物组织切片的制作 62实验二、肠系膜铺片镀银法染色或疏松结缔组织铺片地依红—HE染色实验三、胰岛三色显示法或骨骼肌切片铁苏木精染色 2实验四、肥大细胞甲苯胺蓝染色或T淋巴细胞ANAE染色法 2实验五、肝糖元PAS染色法或蛋白质汞溴酚蓝显示法 2实验六、冷冻切片实验与脂肪苏丹染色法 2 六．考核办法成绩评定比例（%）1、平时成绩50%2、期末考试50%七．教材与参考资料1．教材：组织学技术（自编. 2004）2．参考资料：杜卓民主编．1999．实用组织学技术（第2版）．人民卫生出版社。

病理学实验技术重点

1.什么是病理学技术？病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法。

2.组织制片的目的。

生物学标本在生活状态下多为无色透明，而且组织一旦离开机体后很快就会死亡，其结构就会失去正常状态,必须对组织采取固定、切片和染色措施！3.何谓组织制片技术？组织经过固定、切片和染色后，光波通过被检组织成分时，波长和振幅发生改变，在显微镜下能清晰的观察其组织结构，称之为光镜标本的基本制作方法或称为组织制片技术。

4.组织制片种类及其各类方法的分类。

（一）组织非切片制作方法：组织分离标本组织活体标本组织涂片标本磨片标本整体封存（压片）标本组织铺片标本组织印片标本等（二）组织切片法：1.石蜡切片法 2.火棉胶切片法 3.冰冻切片法4.超薄切片法（电镜技术） 5.树脂切片 6.碳蜡切片5.组织制片的主要程序。

取材、固定----脱水-----透明、浸渍-----包埋、切片----贴片、染色---浸洗----脱水----透明----封固6.实验动物处死常用方法及优缺点。

1）挥发性麻醉剂（吸入麻醉）包括：乙醚、氯仿等。

优点：乙醚吸入麻醉适用于各种动物，安全度亦大，动物麻醉深度容易掌握。

缺点：是对局部刺激作用大，可引起上呼吸道粘膜液体分泌增多、肺部充血，再通过神经反射可影响呼吸、血压和心跳活动，并且容易引起窒息，故在乙醚吸入麻醚时必需有人照看，以防麻醉过深而致动物死亡。

2）非挥发性麻醉剂（注射麻醉）这类麻醉剂种类较多，包括10%苯巴比妥钠、4%戊巴比妥、5%硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，20%氨基甲酸乙脂（乌拉坦）和1%水合氯醛、氯胺酮等，可通过肌肉注射、静脉注射、腹腔注射。

优点：这些麻醉剂使用方便，一次给药可维持较长的麻醉时间，麻醉过程较平衡，动物无明显挣扎现象。

3）断髓（脱臼）法动物处死过程中动作要迅速，尽量避免其长时间处于痛苦或濒于死亡状态，以免机体内组织或细胞结构发生改变引起人工假象。

组织切片制作步骤

组织切片制作步骤1．取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法。

取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下：(1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。

(2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为50px×50px×7.5px，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～5px即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～12.5px，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。

(3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。

夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。

(4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。

(5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。

纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。

(6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。

(7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。

为此可将组织展平，以尽可能维持原形。

2．固定(1)小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4～20，但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。

故取组织块的大小一般为50px×50px×7.5px。

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（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4）（4）Bouin’s液：苦味酸饱和水溶液75份，甲
醛25份，冰醋酸5份配制而成。
4．固定方法
（1）灌注法（Irrigation method）自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，注入固定液，30min后取材，置同一固定剂后固定。（2）浸入法（Immersion method）。
粘膜
粘膜下层
胃壁结构模式图
肌层
浆膜
（三）标本的固定
1．固定的目的使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，防止组织自溶；使组织成份转变为不溶性物质从而有利于保存。这就是固定的基本意义。
2．固定的注意事项
(1) 组织块不宜太大，一般以厚度为 2 毫米，长度不超过0.5厘米*0.5厘米。
商品石蜡的处理：反复溶化、过滤以增加石蜡
的硬度和密度，并除去杂质。
浸蜡：
温度最好不超过该石蜡溶点的2℃以上；1~2h 。
包埋：通常使用包埋盒。
包埋通常使用组织包埋机、包埋盒及配套使用的
不锈钢模具。把熔蜡倒入模具内，再用加热的弯曲钝
头镊子夹取已经过浸蜡的组织块，使切面朝下平正地
置放于模具底面的中央处，然后放上包埋盒，继续加
(2)固定液的量一般以组织块大小的30倍为宜，
最好在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层纱布以使固定液能从上下左右前后各方都能渗入组织块。 (3)固定的时间，一般以24小时为宜。
(4)后固定：柔软组织在新鲜时不易切成小块，
往往采用重新固定法处理。（ 5 ）特殊固定：神经组织以在活体动物灌流
固定后再重新投入固定液为佳，有些组织如肺
5．固定后处理
材料固定后，药剂继续留在组织中，易使
组织破坏，必须用水或酒精洗去。三种方式进行处理：（1）流水冲洗；（2）酒精充分洗涤；（3）直接入脱水剂。
（四）脱水与透明
1、脱水的意义和目的：固定后组织其硬度不能达到切薄片的要求，须进行除固定以外的其
他处理．脱水就是继固定后的重要步骤．脱水
组织病理学常用技术基本理论
——第2节、第3节
目的要求
1、了解组织学制片的基本程序；
2、熟悉HE染色的步骤；
3、掌握HE染色结果的观察。
第二节组织学常用的几种标本类型
见视频“组织学制片方法”
第二节组织学常用的几种标本类型
1．切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常用的标本。
间可以延长至24小时也无妨。
（五）包埋
1．目的：由于生物体的组织有各种硬度不同的成份，必须加石蜡等作支持物质渗入组织块内部，并将组织块包埋起来，然后用切片机以制作极薄的切片。 2．种类：包埋物质目前广泛采用的除石蜡外，还有火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、
OTC(冰冻切片包埋剂）等。
石蜡包埋法：
2．铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载玻片上，经固定、染色、封固而制成的
标本。
3．涂片标本：主要是将液态组织如血液、骨髓、痰液、腹水、精液等液体涂抹于载玻片上，经固定、染色制成的组织标本，以供观察细胞的形态与其微细结构。
4．磨片标本：不经脱钙及切片手续，而直接用手工在磨石上磨制成薄片，以便在
必须从低浓度开始，逐渐转入高浓度脱水剂。
另外脱水必须进行得很彻底。
2、常用脱水剂：（1）酒精：（2）丙酮：
3、透明的意义和作用：
透明剂能够同时溶解于脱水剂及包埋剂当中，它能逐渐渗入组织，最终将脱水剂完全排出。 4、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。二甲苯：透明组织的能力强，但易使组织收缩和变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时ຫໍສະໝຸດ 显微镜下观察的骨、牙磨片标本。
5．分离标本：将极小组织块用化学药物的水
溶液浸泡后，溶去其细胞间质，采用机械分离方法（如振荡、针拨等方式）使之分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上进行镜检。

6．压片标本：组织经化学药物软化及染色后，用盖片压封于载玻片上进行镜检的标本。如运动终板的制作。
动亦可按此方法进行观察。
9 ．血管注射标本：一种是将树脂类铸形剂经
血管灌注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织而制成的血管铸形标本，可瓶装供肉眼观察或进一步处理后作扫描电镜观察。另一种是将染
料加明胶配制成染色液注入血管内，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成的组织切片标本。这类标本主要用于了解血管的走行及其与
→染色→封固。
（二）动物的致死与取材
1、动物致死法：
（ 1）（ 2）（ 3）断头法：麻醉法：空气栓塞法：
2、组织取材时应注意：
(1) 所取材料越新鲜越好； (2) 切取组织的刀剪刃口必须锋利； (3) 取材时必须考虑切面的方向； (4) 组织块应力求小而薄； (5) 收缩较大的新鲜组织； (6) 注意清洁； (7) 用作免疫组化的组织取材； (8) 病理取材。
所支配组织或器官的相互关系。
第三节
组织切片的常规制作（一）概述
组织切片的制作方法有：石蜡切片、冰
冻切片、火棉胶切片、明胶切片、振动切片、
塑料切片（半薄切片）、超薄切片（电镜标
本）、碳蜡切片等。石蜡切片是最常用的方法，
本节将较详细讲授其制作步骤。
组织切片制作方法的基本程序：
取材→固定→脱水→透明→包埋→切片
7．整装标本：一种是将很小的动物或早期胚胎经固定、染色后，封固于载玻片上。另一种是将小动物、胚胎或病变器官经固定后，保存于固定液中瓶装供肉眼观察用。可了解胚体的表面立体形态特征及病变部位与周围组织的毗邻关系。
8．活体标本：如将蛙的口腔粘膜取下放于载玻片上，迅速滴加生理盐水或 Ringer 氏液以观察其纤毛运动。其它如精子运
则采用由气管注射固定液后再投入固定液为好。
3．固定剂
用以固定组织的药剂，称为固定液。
常用的固定液有：（1）10%福尔马林液：商品甲醛（36%—40%甲醛水溶液）配成固定液其浓度为3.6%—4%，也就是习惯上称为10%的福尔马林液。（2）10%中性缓冲福尔马林液：商品甲醛10ml，
0. 1mol/L pH7.4 PBS 90ml。