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动物细胞的体外培养

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动物细胞的培养条件和培养基

动物细胞的培养条件和培养基
• 血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝 或去纤维蛋白法)的血浆。
• 2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，可 大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、 MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及 ISOCOV、199和McCoy等。
• 缺点：无法替代一些未知成分。 • 解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此互补
的胎牛血清。
• 血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生 长增殖所需要的各种生长因子和激素；（2）提供 有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子； （3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结 合蛋白；（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微 量元素。
• 3、无血清培养基
• 无血清培养基的优点如下：①提高了细胞培养的可 重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响； ②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生 物污染的危险；③供应充足、稳定；
动物细胞的培养条件和培养基
• 为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些 基本条件：
（1）绝对无菌操作； （2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其
微量的离子掺入； （3）适量氧气供应；
（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物； （5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透
压和离子浓度等； （6）及时分种，保持合适的细胞密度。
6、空气
二、动物细胞培养基的 种类和组成
• 细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要 有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培 养基。 1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的 培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、 血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。
• 优点：营养价值高 • 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高

动物细胞培养

动物细胞培养
第一节动物细胞的生长特征
一、贴附生长
附着于一定的底物并伸展，是大多数体外培养细胞的基本生长特点。支持细胞生长的底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。培养细胞在未贴附于底物之前一般呈球体状，当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈上皮细胞样或成纤维细胞样等。细胞附着于底物并非是一种需能的过程，一般认为与电荷有关。一些特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连结素、Ⅲ型纤维、血清扩展因子等）可能参与细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面、培养基和血清之中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的球形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，进而细胞逐渐伸展成其原来的形态。另外，细胞的贴附和伸展，还受培养体系中的某些物理和化学因素的影响。如低钙离子浓度、高pH值、低温或培养基的流动过快等均可妨碍细胞的贴附。一般来说，除非是转化了的细胞或肿瘤细胞，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长期在培养基中悬浮生长而逐渐退变。
第三节 动物细胞体外培养的生长方式和条件
一、培养细胞的生长方式体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴附生长型细胞和悬浮生长型细胞两大类。１．贴附生长型细胞贴附生长型细胞指能附着于底物（支持物）表面生长的细胞。包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞都属于这一类型。当这类细胞从活体体内转移到体外培养时，必须贴附于底物才能生长。这些细胞在活体体内时，各自具有其特殊的形态，但是处于体外培养状态下的贴附生长型细胞则常在形态上表现为比较单一化而失去其在体内原有的某些特征，并反映出其胚层来源的情况。一般可将贴附生长的体外培养的细胞从形态上大体分为上皮细胞型和成纤维细胞型，还有一些难于确定其稳定形态的细胞。２．悬浮生长型细胞少数细胞类型在体外培养是不需要附着于底物而在悬浮状态下即可生长，来源于血液、淋巴组织的细胞、许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞均属于这一类型。这些细胞在悬浮培养中生长良好，可以是单个细胞或细小的细胞团，细胞呈圆形。由于细胞悬浮生长于培养基中，因此细胞生长空间大，具有能够提供增殖大量细胞、传代方便、易于收获的优点。

第三章动物细胞培养用液

第三章动物细胞培养用液
合成培养基的基本成分是氨基酸、维生 素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物须氨基酸，非
必须氨基酸中的的谷氨酰胺，另外特殊需要
加入其它氨基酸。是合成培养基的主要内容。
（2）碳水化合物
糖类为主，既是能量来源，也是合成某 些氨基酸的原料。
（3）无机离子
培养基含有平衡盐液中的钾、钠等无机 盐，有些培养基含有微量元素，如 Fe2+ 、 Zn2+ 、 Ca2+等。
Na2HPO3/NaH2PO3
理想缓冲液应有以下几个特点：
①能持续维持培养液的PH值恒定。
②不干扰在培养液中进行的化学或生物化学
反应。 ③不影响实验和观察。
三、生理盐水
最简单的生理盐水是，0.9%NaCl溶液， 等渗。后期发展成为了现在的各种平衡溶液。
四、平衡盐溶液（BSS）及其配制
又叫盐溶液，集缓冲能力，生理盐水的等渗
合成培养液是对细胞体内生存环境中各种已知物 质在体外人工条件的模拟。但这种模拟不是被动和不
加选择的。而是在体外反复实验和筛选、进行强化和
重新组合后形成的人工合成培养基。 合成培养基现有20多种，实际大多数cell培养选用 的培养基仅七八种。如，TC199、DMEM、RPMI1640、MEM等。
1 合成培养基的基本成分
第三章 动物细胞培养用液
动物细胞进行体外培养离不开其在体外 生存、生长的各种溶液，此即培养用液。包 括：培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清以 及消化液、 PH 调整液和抗生素液等其它常用 液。
一、蒸馏水的制备/培养用水
水是细胞体外生存最基本的环境条件。体 外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度 要求较高，细胞培养用水的质量要求为电阻 率在1×106 Ώ•cm以上，双蒸馏水的水质刚刚 达到这一标准。

[课件]动物细胞体外培养知识PPT

[课件]动物细胞体外培养知识PPT
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3、细胞传代操作 （1）先用酒精棉擦拭需要放入超净台的物品，然后将物品 放入超净台进行操作。 （2）无菌取样，通常检测细胞密度、活度、葡萄糖、乳酸 ，根据实验优化等还需要检测其他各项生化指标。 （3）根据预先实验设计的传代密度或者稀释比例来添加新 鲜培养基进行传代，记录代次。 （4）在进行方瓶、滚瓶等大瓶传代时，需要两名实验员密 切配合操作，并由监控员协助进行物品传递等工作。因此 熟练各环节的细节操作对于保证无菌来说非常重要。
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一、基本概念

1、细胞培养：动植物细胞在体外条件下存活和生长，此 时细胞不再形成组织，主要是指用来生产次生代谢产物为 目的的大规模细胞培养技术。 2、动物细胞体外培养的生长类型：贴附型和悬浮型。 3、动物细胞大规模培养技术：是建立在贴壁培养法和悬 浮培养法的基础上，融合了固定化培养、流式细胞术、生 物反应器技术等而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载 体培养、微囊化培养、中控纤维培养等。
液氮中长期保存。
温度降低原则：达到4度，然后达到-20度冷冻状态，再转移 到-70度，18h后，在液氮中保持。
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2、细胞复苏操作 （1）登记要取用的细胞。 （2）快速取出细胞放于准备好的37度水浴中，快速溶解 。

（3）将溶解的冻存管细胞离心，根据细胞特性，选择合 适的离心强度。
（4）酒精棉擦拭冻存管后放于超净台，将细胞沉淀用新 鲜培养基重悬后臵于离心管中进行离心。洗涤步骤，去除 DMSO。 （5）细胞用新鲜培养基传入培养瓶中。

化学限定培养基---不含蛋白水解物，均为已知化学结构。
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三、基本过程

1、从整个操作过程来说包括： （1）细胞小瓶培养---传代操作 （2）细胞大规模培养---转瓶、反应器操作 （3）细胞冻存和复苏---原则

动物细胞培养及胚胎培养培养基的要求

动物细胞培养及胚胎培养培养基的要求

动物细胞培养及胚胎培养培养基的要求动物细胞培养时对培养基的要求：培养基按其来源可分为天然培养基和合成培养基。

天然培养基的营养成分与细胞在体内所需条件比较接近，但就细胞在体外生存的环境来说，合成培养液也有其独特之处，譬如成分便于控制和标准化。

体外培养的细胞直接生活于培养基中，无论何种培养基都应该能满足细胞生长所需的营养与生理的基本要求。

(1)营养成分：1）氨基酸合成培养液中的氨基酸以12种必需氨基酸为主，这些氨基酸不能由细胞自身合成，必需由培养液供给。

在氨基酸的成分中谷氨酰胺的作用特别重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在配制各种培养液中应补加一定量的谷氨酰胺。

2）单糖葡萄糖是最常用和最好的单糖3）维生素维生素在细胞代谢过程中必不可少，主要可以提供辅酶和辅基。

生物素、叶酸、泛酸、核黄素、维生素B12等等4）其他成分：细胞生长过程中除需钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素外，还需要一些微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼等。

此外，为优化细胞生存环境，合成培养基中有时还添加些其他成分，包括核酸降解物、抗氧化剂等。

（2）促生长因子及激素各种激素、生长因子对于促进细胞生长、维持细胞功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。

如胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，泌乳素可促进乳腺上皮细胞生长的作用。

各种生长调节因子的作用更加明显并具有特异性。

（3）pH大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围对细胞将产生有害影响。

造成培养基pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的二氧化碳。

解决这一问题可采取两种方法：一是用具有一定缓冲能力的培养基，如使用NaHCO3-CO2缓冲系统，二是采用开放式培养的方法，使细胞代谢产生的二氧化碳及时逸出培养皿。

（4）渗透压细胞必须生活在等渗的环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定的耐受性。

注：天然培养基主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。

合成培养基是人工配制的培养基，给细胞提供一个近似体内生存的环境，又便于控制和标准化的体外生存环境，但合成培养基尚未成为十分完全的培养基。

成体动物皮肤细胞体外培养

成体动物皮肤细胞体外培养

成体动物皮肤细胞培养一，猪耳皮肤成纤维细胞培养：取材：在种猪场，选取1-6周龄幼猪，尽量挑选猪耳组织上血管较细少的部位，用刮毛刀刮毛后，无菌取一块猪耳组织，将组织块放入含有250iu/ml青霉素和250µg/ml链霉素的无菌PBS中，4℃保温立即带回实验室。

酶消化法分离培养猪耳皮肤成纤维细胞：在超净台上，将猪耳组织块浸入到70%酒精10-30s，然后置于无菌培养皿中，用眼科剪剪去毛，用含有100iu/ml青霉素和100µg/ml链霉素的无菌PBS涮洗3-5遍，在PBS中将猪耳组织块剪碎成1-3mm3的小块，并将猪耳组织块等分到两个培养瓶中，分别采用胰蛋白酶热处理法与胰蛋白酶冷热处理结合法分离细胞。

（1）胰蛋白酶热处理法待组织块下沉后，吸去上清，向其中一个培养瓶中加入含有0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA 的消化液，密封瓶口后，置于37℃下消化30min,中间摇匀数次，消化结束后，收集含有解离下来细胞的消化液，置4℃冰箱内冷却，在所余组织上再一次加入消化液，重复上述消化步骤四次，并将每次收集到的含有细胞的消化液混合到一起，离心去上清，重悬于1ml37℃预温的DMEM/F12（GIBCO)培养液（含20%胎牛血清，2mmol/l谷氨酰胺，100iu/ml青霉素和100µg/ml链霉素），吹打均匀后，将1滴细胞悬液与2滴2%的台酚蓝液混合后，滴入细胞计数板，2min后，在显微镜下计数至少299个细胞，未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，计算活细胞百分比。

（2）胰蛋白酶冷热处理结合法向另外一瓶中加入少量含0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA的消化液，置于4℃冰箱。

冷消化1-2h,改为用37℃培养箱继续进行消化。

30-60min后加入1ml37℃预温的DMEM/F12培养液（含20%胎牛血清，2mmol/l谷氨酰胺，100iu/ml青霉素和100µg/ml链霉素），吹打均匀后，用上述的台酚蓝排出检测法计算活细胞的百分比。

动物细胞培养基本技术与原理备课讲稿


二、动物细胞特性
动物细胞在活体内的特性 培养条件下动物细胞生长特性 培养条件下动物细胞生理特性
1. 动物细胞在活体内的特性
在活体内，动物细胞:
增殖 分化
分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有 明显的形态学特征。
如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。
二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion )
（一）取材——获取组织
原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录；
“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年 龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚 成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则 不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维 细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。
大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超 过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是 发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久 细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细 胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。
用特点及组织成分不同适当选用 （4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。
2、组织消化操作方法(tissue digestion method of operation)

体外培养动物细胞的类型

体外培养动物细胞的类型前两天看到有同⾏问问题：为什么动物细胞会贴壁⽣长？⼀直⾃⼰对这个问题的解释其实很简单：就是因为植物细胞⼜细胞壁，不仅仅是保护，还有很重要的功能是⽀撑、提供给不定形的植物原⽣质体⼀个附着；⽽动物细胞没有细胞壁，还好多细胞动物往往⼜⾻骼（内或者外⾻骼），但是离体的动物细胞没有⾻骼附着怎么办？贴壁啊！但是⾃⼰也不是很⾃信，因为⾃⼰的推理，⼀家之⾔，且⼜不是⼤⽅之间。

好在刚刚看书，找到了权威⽀持，笔者的⾻骼！体外培养细胞的分型：根据离体细胞在体外⽣长时是否贴壁的性质,将其分为贴壁型与悬浮型两类。

1、贴壁型细胞(anchorage-dependent cell)贴附是有机体细胞在体内⽣存和⽣长发育的基本⽅式，包括细胞与细胞之间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触两种⽅式。

正是基于细胞的这种贴附⽣长的特征，使得不同细胞之间接合⽽形成组织，也使细胞与周围环境之间保持联系。

因⽽有机体的绝⼤多数细胞必须贴附在某⼀固相⽀持物上才能长。

体外培养时多数细胞仍然保持了这种特性，即必须贴附在培养瓶壁等⽀持物上才能⽣长。

根据体外养细胞在⽀持物上贴附⽣长时的形态，⼤致分为四种类型：1)上⽪细胞型( epithelium) 细胞呈扁平不规则多⾓形，中间有胞核，彼此紧密相连，呈单层⽣长状态。

消化道上⽪、肝、胰和肺泡上⽪等起源于外胚层和内胚层的细胞在体外培养⽣长时多呈上⽪细胞型。

2)成纤维细胞型(fibroblast) 细胞贴壁后呈梭形或不规则三⾓形，胞质向外伸出2~3个长短不同的突起。

起源于中胚层的细胞，如⼼肌、平滑肌、⾎管内⽪细胞等体外培养时常呈成纤维细胞型。

3)游⾛细胞型(wandering) 细胞质常伸出伪⾜或突起，呈活跃的游⾛或变形运动，贴附于⽀持物上散在⽣长，⼀般不连接成⽚。

该类细胞形状很不稳定，有时与上⽪样细胞或成纤维细胞难以区别，单核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体外培养时4)多形型细胞( polymorphie) ⽣长时像神经细胞那样呈呈多⾓形，并伸出较长的神经纤维，很难确定它们的形状，因⽽我们将此类细胞称为多形型细胞。

动物细胞的体外培养

PH
大多数细胞在PH =7.4时生长最好，一般6.8 --7.6。
PH指示剂
温度
温度除直接影响细胞生长外，也与培养液的PH值有关。 如：低温时，CO2 溶解多，影响PH值。
粘度
粘度对细胞生长影响较少，但在细胞培养或用胰蛋白酶处
细胞培养的类型
理时，为尽量减少细胞损伤 ，可通过提高培养液粘度来克服。
加羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮 来增加粘度。
酸等。
平衡盐溶液
主要用于稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压 ，提供缓
冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，
提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
抗生素
常用为青霉素和链霉素、两性霉素，以抑制革兰氏阴性菌和阳性
菌的污染。
氢离子缓冲器
FGF 成纤维细胞生长因子 EGF 表皮生长因子
三.培养基的物理性质
表面张力和泡沫
原代培养
表面张力有利于培养物粘着于底物上面。在悬浮培养中， 传代培养 减少泡沫的产生，加防泡沫硅 。
渗透压
细胞的衰退 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有
一定耐受性。
一、细胞原代培养
从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖
一定的代数后（一般10代以内）停止生长。
材料来源之一。
(2)单层细胞培养：
在动物培养中，一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形
成致密的细胞单层。
优点：
①更换新鲜培养液比较容易。一般1-3天换液一次，细胞长成 单层后进行传代 ②可用于观察某些因子对细胞生长的影响 ③容易表达某些产物
（2-3天）
(3)悬浮细胞培养：（1）使细胞呈悬浮状态在培养液中连续生 长（小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞）（2）通过机械搅拌使细胞保 持悬浮状态，选择得到悬浮生长的细胞进行悬浮培养。

动物细胞工程(动物细胞培养、核移植)练习题

动物细胞工程（动物细胞培养、核移植）练习题1．一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件( )①无毒的环境②无菌的环境③培养液中需加血清④温度与动物体温相近⑤需要O2，不需要CO2⑥CO2能维持培养液的pHA．①②③④⑤⑥B．①②③④C．①③④⑤⑥D．①②③④⑥2．下列对动物核移植技术的描述不正确的是( )A．哺乳动物核移植包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植B．体细胞核移植过程中可通过显微操作去除卵母细胞的细胞核C．通过体细胞核移植方法生产的克隆动物是无性繁殖D．通过体细胞核移植方法生产的克隆动物是对动物进行了100%的复制4．在动物细胞培养前胰蛋白酶所起的作用是( )A．分解细胞膜易于融合B．分解培养基的蛋白质供给细胞营养C．使组织分散成单个细胞D．用于细胞内物质的分解5．下列动物细胞工程技术利用了细胞膜流动性原理的是( )①动物细胞培养②动物细胞融合③核移植④胚胎移植A．①④B．②③C．①②D．③④10．现将“细胞工程”中动、植物细胞培养技术列表比较如下，你认为哪一项比较有错误( )C．结果D．培养目的6．有关全能性的叙述，不正确的是( )A．克隆羊的诞生证明了已分化动物细胞的细胞核仍具有全能性B．生物体内细胞由于分化，全能性不能表达C．卵细胞与受精卵一样，细胞未分化，全能性最高D．植物细胞离体培养在一定条件下能表现出全能性7．下列属于动物细胞培养与植物组织培养区别的是( )A．动物细胞培养所用的培养基的成分与植物的不同B．动物细胞培养需在无菌条件下进行，而植物组织培养不需要C．动物细胞培养过程中可发生基因重组，而植物组织培养不能D．动物细胞培养需控制温度，而植物组织培养不需要14．下列关于动物细胞培养的叙述，不正确的是( )A．培养基为液体培养基B．培养结果只能获得大量细胞及生物制品，而不能获得生物体C．需要氧来满足细胞代谢的需要，不需要二氧化碳D．通过细胞培养可以检测有毒物质，判断某物质的毒性8．某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行动物细胞培养。

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（二）细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸 入37℃温水中，并不时摇动令其尽快 融化; 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖 子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心 管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心,1000rpm,5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清 培养液重悬细胞，计数，调整细胞密 度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培 养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。
2.细胞解离
｛
1）胰蛋白酶解离细胞法: 2）胶原酶解离细胞法 3）机械解离细胞法
解除了细胞之间的“组 织关系”从而可以反映 出单个细胞的生物形态
原代细胞培养的方法
｛
（1）外植块细胞培养 （2）单层细胞培养 （3）悬浮细胞培养
(1)外植块培养：外植块在一定限度内可保持其原有组织结构，
有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的
表面张力和泡沫
原代培养
表面张力有利于培养物粘着于底物上面。在悬浮培养中， 传代培养 减少泡沫的产生，加防泡沫硅 。
渗透压
细胞的衰退 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有
一定耐受性。
一、细胞原代培养
从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖
一定的代数后（一般10代以内）停止生长。
‘荷包蛋’菌落出现。
3、病毒的检测
a.扫描电镜和透射电镜观察病毒颗粒形态
b.致细胞病变效应（CPE）或集落的检测
常见的形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。
正常细胞
病变细胞
问题2：应如何避免 细胞污染？ 细胞污染的种类可分成细菌、真菌、 霉菌、病毒等。主要的污染原因为无菌操作 技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和
外环境条件的变化而不断有新的变化。 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细 胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种 的作用。
原理
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证
明这样可以最大限度的保存细胞活力。
细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂;
复苏细胞应采用快速融化的方法。
（一）细胞冻存
血清
一般常用为小牛血清(包括胎牛血清),人血清和其它动物血清。
氨基酸（必需氨基酸）
谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的 氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不 良而死亡。
维生素
维持细胞生长的生物活性物质，在细 胞代谢中起调节及控制作用。
碳水化合物
细胞生长的主要 能量来源其中有的是合成蛋白质和核酸
的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋
1、细菌污染
2、真菌污染
3、支原体污染
4、外源病毒污染
•
培养液颜色变黄，出现浑浊显微镜下观察有大量圆球状颗粒漂浮， 细胞表面和周围有大量细菌细胞生长停止，并有中毒表现。
圆球状颗 粒漂浮物
显微镜观察到的细菌污染
肉眼可见培养液中见白色或黄色漂浮物，倒置镜下可见 丝状、管状、树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养皿中， 有的形态呈卵形或链状排列，散在细胞周边和细胞之间生长， 培养液多不浑浊
机械搅拌式生物反应器：它通常由罐体、 管路、阀门、泵及马达组成，由马达带动 桨叶混合培养液，通过搅拌器的作用使细 胞和养分在培养液中均匀分布。
原代培养的细胞特点
• 也称初代培养, 是从供体取得组织细胞后在体外进 行的首次培养。 • 细胞保持原有的性质（二倍体细胞系）：适合作 药物测试，细胞分化研究。 • 原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，供体和 细胞间有很大差异。
2.半悬浮生长细胞传代

此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
贴壁生长细胞传代方法：
采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液 1. 吸光培养瓶中的培养液; 2.加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为 准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）; 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液;
1、潜伏期
2、指数生长期
3、停滞期
传代细胞培养的方法
｛
1）悬浮细胞生长传代 2）半悬浮细胞生长传代 3）贴壁细胞生长传代
1.悬浮生长细胞传代

离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养
液后再混匀传代。

直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除
1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
单克隆抗体的制备 :包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体。
2、生物制药
(1) 疫苗生产:病毒性疫苗,肿瘤疫苗等； (2) 基因工程药物生产:一些细胞生长因子等； (3) 诊断和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽物 质等。
PH
大多数细胞在PH =7.4时生长最好，一般6.8 --7.6。
PH指示剂
温度
温度除直接影响细胞生长外，也与培养液的PH值有关。 如：低温时，CO2 溶解多，影响PH值。
粘度
粘度对细胞生长影响较少，但在细胞培养或用胰蛋白酶处
细胞培养的类型
理时，为尽量减少细胞损伤 ，可通过提高培养液粘度来克服。
加羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮 来增加粘度。

从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于 冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次 培养液； 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以 免冻伤； 冻存和复苏最好用新配制的培养液；


在冻存时要均匀减少细胞内水分，减少冰晶形成。
细胞污染的种类和判定
• 细胞培养中常见的污染：
被 污 染
未 被 污 染
b.电镜检测
可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48~72小 时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固
定、包埋、切片后才能进行观察。
扫描电镜下的支原体（附于细胞 表面众多的圆形颗粒为支原体）
支原体污染电镜照片 （煎蛋状）
c.培养检测
将细胞悬液5ml加入45ml支原体肉汤培养基，培养14天后 观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的 培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无
严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但 实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞 培养 ，随不同的组织时间长短不一，一般为1-4周。此期细胞 呈活跃的移动，可见细胞分裂但不旺盛。
原代培养6天后的大鼠神经元
1.组织解离： 无菌条件下采取动物组织或器官，放在含有抗生素的 平衡盐溶液中，然后尽快在超净台内进行解离处理。
材料来源之一。
(2)单层细胞培养：
在动物培养中，一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形
成致密的细胞单层。
优点：
①更换新鲜培养液比较容易。一般1-3天换液一次，细胞长成 单层后进行传代 ②可用于观察某些因子对细胞生长的影响 ③容易表达某些产物
（2-3天）
(3)悬浮细胞培养：（1）使细胞呈悬浮状态在培养液中连续生 长（小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞）（2）通过机械搅拌使细胞保 持悬浮状态，选择得到悬浮生长的细胞进行悬浮培养。
细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或
转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 （50代以上）。
特点:遗传物质改变，具有癌细胞的特性，可以无限分裂
一代周期内细胞生长有三个时期
所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。 如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。

潜伏期 指数生长期 停滞期
4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液;
5. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内;
6. 将后者放入培养箱中培养。
贴壁细胞的生长规律
贴壁过程
1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所 每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。 2．传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康
二、细胞的传代培养
培养的细胞由于细胞增殖,数量增加,细胞难以继续生
长繁殖，需要进行分瓶培养，将培养的细胞分散，以1:2
或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传 代培养，也叫做继代培养。
细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细
胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持（1050代） 特点：遗传物质不改变
察到。如培养液变浑浊，或略加振荡可观察到很多漂浮物。
漂浮物
2、镜下观察：
a.在倒置显微镜的高倍镜下可 见培养液中有大量圆球状颗 粒漂浮，即为细菌污染。 b.若细胞之间有丝状、管 状、树枝状或卵形的物 质常为真菌污染。
酵母菌
Hela细胞
2、支原体污染的检测
a.荧光技术检测
利用荧光染料检测支原体污染。被支原体污染的细胞经染色后 在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为 支原体的DNA，证明有支原体污染。
污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁
的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配 制是减低污染最好方法。
药物研究与开发
生物制药
1、药物研究与开发
新药筛选 :如化学合成药物药效研究； 疫苗研究与开发 :如病毒性疫苗的研究与开发 基因工程药物的研究与开发:如干扰素的研究与开发； 细胞工程药物的研究与开发 :生物活性多肽研究与开发；
细胞的体外培养
细胞培养的基本条件
仪器和设备 培养基的组成成分
培养基的物理性质
一.仪器和设备
(1)无菌条件：风淋室、超净台、干燥除菌设备、 低温冰箱等。 (2)细胞生长条件：纯水蒸馏器、纯水仪、CO2 孵箱、培养器皿等。