乳酸乳球菌食品级表达载体的改造(摘要)

乳酸乳球菌质粒提取方法的改进与优化任志娟;李轶杰;马正海【摘要】[目的]建立一种简便、快速、安全的乳酸乳球菌质粒提取方法.[方法]质粒提取采用文献报道的乳酸菌质粒提取与常用的大肠杆菌质粒提取相结合的方法,并对提取过程中溶菌酶浓度、溶菌酶处理方式和时间进行优化.[结果]采用改良后的方法提取乳酸菌质粒效果显著.最佳溶菌酶浓度是10 mg/mL,最佳溶菌酶处理方式和时间是37℃振荡培养30 min.[结论]该方法避免了毒性物质溴化乙锭的使用,同时减少了通常提取乳酸菌质粒的复杂步骤,是一种高效、快速、安全的提取乳酸菌质粒的方法.%[Objective] To develop a simple, rapid and safe method for extraction of plasmid DNA from Lactococcus lactis . [ Method] The method for plasmid extraction from lactic acid bacteria was improved by combining the method of E. coli plasmid extraction and the reported method of plasmid extraction from lactic acid bacteria ( LAB) . Conditions for this new method were optimized in terms of lysozyme concentration and lysozyme treatment way and time length. . [Result] The optimal concentration of lysozyme was 10 mg/mlj the optimal lysozyme treatment method and time were at 37％ for 30 min with shaking. [ Conclusion] This method avoided the use of ethidium bromide (EB) and simplified the complicated procedure, so it was a high effective and safe LAB plasmid DNA extraction method .【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2011(048)004【总页数】5页(P734-738)【关键词】乳酸菌;质粒;提取;溶菌酶【作者】任志娟;李轶杰;马正海【作者单位】新疆生物资源基因工程重点实验室,新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐,830046;新疆生物资源基因工程重点实验室,新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐,830046;新疆生物资源基因工程重点实验室,新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐,830046【正文语种】中文【中图分类】S188+.40 引言【研究意义】乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是正常存在于人和动物胃肠道中的菌群[1]。

综述与专治乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展张金宝1,乌云塔娜2(1.内蒙古扎兰屯农牧学校,内蒙呼伦贝尔162650;2.呼伦贝尔市新巴尔虎右旗畜牧局动物疫控中心,内蒙古呼伦贝尔162650)摘要:乳酸菌以其遗传工程可行并操作简单,在建立和研究乳酸菌食品级高效表达载体系统方面具有十分重要的实际意义。

本文对乳酸菌食品级高效表达载体系统的最近研究及其在外源基因表达方面的应用概况进行初步总结。

指出食品级乳酸菌工程及其表达产物可直接用于食品工业、医药和保健品等领域,是具有巨大应用前景的技术。

关键词:乳酸菌(LAB);食品级;表达载体系统中图分类号:T S201.6文献标识码:A文章编号:1004-6704(2008)06-0042-03The Food Grade Inducible Over ProductionExpression System of Lactic Acid BacteriaZH ANG Jin-Bao,WU Yun-tana(1.Zalantun F armets and Sc hools in I nner M ong oli,Zalan tun,I nner M ong li162650;2.X in baery ou qi ise ase Cintrol Ceter,Zanlantun,162650)Abstract:T he g enetic pro ject of the L actic A cid Bacteria(LA B)is simple o per ated。

T hat already w idely used in to ex press many other sour ces g ene.Study the Fo od-Gr ade Inducible Over-P roduct ion Ex pression System-of L actic Acid Bacteria hav e v ery impo rtant significance.In this paper,T here are preliminary co nclusio n the research o f t he Fo od-Gr ade Inducible O-v er-P roduct ion Expressio n Sy stem-o f Lactic Acid Bacter ia at r ecently and it's used in to ex press other g ene aspects.Key words:lactic acid bacter ia;fo od-gr ade;over-production;ex pression system乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一群革兰氏阳性厌氧细菌,能发酵碳水化合物(如葡萄糖),主要代谢产物是乳酸的各类细菌的统称。

文章编号:1002-2694(2008)03-0224-05乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达孙强正,熊衍文,叶长芸,徐建国摘　要:目的　构建乳酸乳球菌(L a ctococcus lactis ,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA)。

方法　PCR 扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pS H91中,构建食品级分泌性表达载体p SQZ ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌Nuc A 成熟肽的编码序列nucA 到pSQZ 中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MB P71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA ;采用TB 2D 法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA 活性。

结果　PCR 扩增得到usp45基因片段,酶切、连接到载体pS H91中构建了食品级表达载体pSQZ;将扩增的nucA 基因片段克隆入载体p SQZ 并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA 。

在TB 2D 平板上,L l actis MB P71/p SQZ 2nucA 克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/pSQZ 2nucA 上清和菌体在18kDa 位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体。

结论　成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA 在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础。

关键词:乳酸乳球菌;食品级载体;分泌性表达;报告蛋白 中图分类号:R155.5　文献标识码:A Constr uct ion of a f ood 2gr ade secr et ion expr ession vectoran d the expression of r epor ter pr otein in Lact ococcus l actisSUN Qia ng 2zheng ,XION G Yan 2we n ,YE Chang 2yun ,XU Jia n 2guo(S tate Key L abora tor y f or i nf ectious dise ase prevention an d cont rol ,N a tiona l I nstitute f or Communica ble D isease Controla nd Pr evention ,Chinese Center f or D isease Cont rol a nd P revention ,Bei jing 102206,Chi na)AB S T RAC T :To const ruct a food 2gra de secretion e xpre ssion vector and it s use in the exp ression of repo rter protein nucle 2ase (Nuc A),a f ragment ,Usp45,containing the coding sequence of promoter ,ribosomal binding site ,secretion signal and the cod 2ing seque nce for 11pre 2amino acids was a mplif ied by PCR using t he ge nomic DNA of ctis M G 1363,and t hen inser te d into t he f ood 2gra de vecto r pSH91,t hus to constr uct a secretion exp ression vector pSQZ.In addition ,the coding sequence of NucA (nucA)was also amplified f rom St ap hyloco ccus a ur eus chromoso me and inser ted into vector p SQ Z under the control wit h pro 2mote r usp45to constr uct a recombina nt pla smid pSQZ 2nuc A.Nuclea se plate activ ity and zymogram assa ys we re to be used to detect the NucA activity in the secretion expression of ctis.It was demonstrated tha t the secretion expressio n vector sys 2tem ctis MB P71/pSQZ 2nuc A was successively const ructed thro ugh t he processe s mentioned a bove and the qua ntity of Nu 2cA sec reted into c ultural super natants wa s gr ea te r tha t t hat in bacterial lysates.Because all the fr agments used to co nstr uct the vector pSQZ we re obtained f rom food 2grade bacteria ,the vector pSQZ can be regarded as a food 2gra de secretion e xpre ssio n vec 2tor.These data can be used a s the foundation fo r the f urther st udy on t he secretion expression of t he protective antigen in t he o 2ral vaccine. KE Y W O RDS :L actoco ccus lactis ;Food 2gra de vector ;Secre tio n expr ession ;Repor te r protein 通讯作者徐建国,x j @ 作者单位中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京　6 乳酸菌(l act ic aci d bacteri a ,L AB )是一类可发酵糖产生乳酸的细菌总称,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌等二十几个属,广泛用于食品工业,用来生产和保存乳制品及其他食品,被公认为是安全的食品级微生物(generall y regarded a s safe ,GRAS)。

一种乳酸乳球菌MG1363介导的pBpp重组蛋白表达菌株的实验分析作者：崔国贤来源：《食品界》2019年第04期研究背景概述本文通过实验研制乳酸乳球菌MG1363介导的pBpp重组蛋白表达菌株，期望可以有效的治愈我国糖尿病患者。

根据针对糖尿病中的免疫功能紊乱以及自由基毒素等致病因子对人体进行作用，从而降低人体机能中的胰岛素抵抗力以及胰岛功能，最终形成蛋白质、电解质以及脂肪等系列性代谢紊乱症状的分析。

提出了研制一种乳酸乳球菌MG1363介导的pBpp重组蛋白表达菌株的思路。

具体研究内容pBpp蛋白概述。

pBpp蛋白属于一种功能性蛋白，可以用到人体的胰腺中，并且不必经过糖代谢机制，可以促进β细胞的增长和繁殖，加快胰岛素的分泌速度，而且对于人体的降糖操作刺激性不大，副作用也不大。

其次我们应当注意到的是，人体对pBpp蛋白的吸收率不高，口服形式的治疗方法不予推荐。

并且由于目前技术水平制约，pBpp蛋白的制备和生产无法达到量产的规模。

因此应用于实际的治疗当中还需要时日。

一种乳酸乳球菌MG1363介导的pBpp重组蛋白表达菌株的验证方法依据乳酸乳球菌MG1363定植肠道的特性，在胃酸环境中能够很好的实现乳酸乳球菌MG1363对pBpp蛋白的保护作用，并促进重组蛋白集中分泌在肠道中，乳酸乳球菌MG1363介导，一方面实现了pBpp蛋白在人体内部的正常表达，另一方面提高了人体对pBpp蛋白的吸收率。

第一步：以斑马鱼粪便菌群DNA為模板，依托于pMG36e质粒，设计并运用一对引物，进行含有乳酸乳球菌分泌表达肽的pBpp蛋白表达基因的扩展。

第二步：在大肠杆菌中进行pMG36e质粒的扩增。

第三步：通过电转手段，在pBpp重组蛋白中导入一种乳酸乳球菌MG1363。

第四步：取实验小白鼠，通过药物针剂注射的方式，将50mg/kg计量的链脲佐菌素连续五天注射到小白鼠身上，使小白鼠患有糖尿病。

并标注为I型糖尿病模型小白鼠。

第五步：取一组制备好的乳酸乳球菌MG1363介导的pBpp重组蛋白表达菌株，准备实验小白鼠，采取灌胃的形式，将乳酸乳球菌MG1363介导的pBpp重组蛋白表达菌株液体投放到小白鼠的体内，进行I型糖尿病模型小白鼠的病情治愈工作。