生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

生物化学实验报告姓名：专业：院系：学号：实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。

凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。

但这种“过筛”与普通的过筛不一样。

将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。

在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。

相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。

利用这种性质可分离不同分子量的物质。

以下进一步来说明凝胶层析的原理。

将凝胶装载柱后，柱床总体积称为“总体积”，以Vt表示。

实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。

Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。

洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。

2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。

二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。

当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。

该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。

当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。

大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。

若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。

总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。

将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。

实质上Vt是由V o，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。

Vg为凝胶本身的体积。

洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。

它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。

实验十一凝胶层析法测定蛋白质分子量实验目的：了解凝胶层析的原理及其操作，分离血红蛋白和胰蛋白酶（或蓝葡聚糖2000）。

实验原理：凝胶层析也成凝胶过滤法，排阻层析、分子筛层析或渗透层析等是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。

这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。

用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。

以交联葡聚糖分离物质和测定相对分子量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。

交联葡聚糖（Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物。

控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。

“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小，见表3-3（P.41.）。

G值越小，颗粒比较硬，G值越大，颗粒相比较软些（可以以手感触）。

G值也对应凝胶的工作范围。

凝胶层析广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。

凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。

用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。

亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，洗脱时，此类物质沿着颗粒间隙下移，最先流出层析柱（板书：图3-14，3-15A）。

而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。

分子越小，进入凝胶内部越深，在凝胶颗粒的网孔内滞留的时间越长，结果是小分子的蛋白质洗脱速度较慢，即洗脱体积较大，最后流出柱外。

不同一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。

凝胶层析法的原理及应用原理凝胶层析法是一种分离和纯化生物大分子的常用方法。

它利用凝胶的孔隙结构和生物大分子的大小、形状、电荷等特性来实现分离。

凝胶通常是由聚丙烯酰胺、琼脂糖等材料制成，形成了一种类似于海绵状的结构。

在凝胶层析法中，样品首先加载到凝胶柱或凝胶板上，然后通过加入缓冲液，使样品在凝胶中进行扩散。

扩散的速率取决于生物大分子的特性和凝胶的孔隙大小。

较大的分子会更慢地扩散，而较小的分子则会更快地扩散。

分离的原理基于这样的事实：样品中的生物大分子在凝胶中扩散并与凝胶中的孔隙进行互相排斥。

较大的分子会受到较大的阻力，因此在凝胶中停留的时间更长。

而较小的分子则会更快地通过凝胶孔隙。

通过调整凝胶的孔隙大小和选择合适的缓冲液pH值、离子强度等条件，可以实现按照分子大小和形状的分离。

应用凝胶层析法广泛应用于生物化学、分子生物学、蛋白质组学等领域的分离和纯化工作。

以下是一些常见的应用：1.蛋白质分离与纯化：凝胶层析法是蛋白质分离与纯化的常用方法之一。

可以根据不同的分子量选择不同的凝胶柱或凝胶板，实现蛋白质按照分子量的分离纯化。

2.DNA/RNA分离和纯化：凝胶层析法也可以用于DNA和RNA的分离和纯化。

通过选择合适的凝胶孔隙大小和调整缓冲液条件，可以实现不同大小的DNA/RNA分子的分离和纯化。

3.脱盐和浓缩：在凝胶层析过程中，可以通过透析和洗涤步骤去除样品中的盐和其他杂质。

此外，也可以利用凝胶的亲水性来浓缩目标分子。

4.药物分子筛选：凝胶层析法也可用于药物分子筛选。

通过以目标分子为模板，筛选出与其有特异性亲和力的分子。

5.分析性凝胶层析：凝胶层析法还可以用于生物大分子的定量分析。

通过将样品和标准分子一同加载到凝胶中，可以通过测量样品和标准分子的扩散距离来确定样品中特定分子的含量。

结论凝胶层析法是一种重要的生物大分子分离和纯化的方法。

它基于凝胶的孔隙结构和生物大分子的特性，实现了按照分子大小、形状和电荷的分离。

一、实验名称：蛋白质分子量测定——凝胶层析法二、实验目的：1. 了解凝胶层析法的基本原理和操作步骤。

2. 学习利用凝胶层析法测定蛋白质的分子量。

3. 培养实验操作技能和数据处理能力。

三、实验原理：凝胶层析法是一种利用凝胶作为固定相，通过分子大小不同的物质在凝胶孔径中的移动速度差异来实现分离的方法。

在凝胶层析中，大分子物质不能进入凝胶内部的孔径，而小分子物质可以进入孔径，从而在洗脱过程中，大分子物质先流出，小分子物质后流出。

通过测量不同分子量蛋白质的洗脱体积，可以计算出其分子量。

四、实验材料与试剂：1. 凝胶层析柱（直径1.5cm，长30cm）2. 凝胶（聚丙烯酰胺凝胶）3. 蛋白质样品（已知分子量）4. 标准样品（已知分子量）5. 洗脱液（Tris-HCl缓冲液）6. 显色剂（考马斯亮蓝G-250）7. 移液器8. 旋转混匀器9. 分光光度计五、实验步骤：1. 准备凝胶层析柱：将凝胶倒入层析柱中，用洗脱液充分浸泡凝胶，直至凝胶膨胀并固定在层析柱中。

2. 准备样品：将蛋白质样品和标准样品分别稀释至适当浓度。

3. 加样：将蛋白质样品和标准样品分别加入凝胶层析柱中，用洗脱液洗脱，收集不同洗脱体积的洗脱液。

4. 显色：将收集到的洗脱液加入考马斯亮蓝G-250显色剂，室温下显色10分钟。

5. 测量：用分光光度计测定显色液在595nm处的吸光度值。

6. 数据处理：以标准样品的分子量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

根据蛋白质样品的吸光度值，从标准曲线上查得蛋白质的分子量。

六、实验结果：（此处插入实验数据表格，包括标准样品和蛋白质样品的分子量、洗脱体积、吸光度值等）七、实验分析：通过凝胶层析法，成功分离了蛋白质样品，并测定了其分子量。

实验结果表明，蛋白质样品的分子量与标准样品的分子量相符，说明实验操作正确。

八、讨论与心得：1. 凝胶层析法是一种简单、有效的蛋白质分离方法，可用于测定蛋白质的分子量。

2. 在实验过程中，要注意凝胶层析柱的制备、样品的加入和洗脱液的收集等操作步骤，以保证实验结果的准确性。

生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。

2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。

最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。

实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。

实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

凝胶层析法(gel chromatography)测定蛋白质分子量一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。

2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。

二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。

它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。

凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。

用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。

亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。

分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。

一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。

这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

凝胶层析分离原理示意图参见64页的“图 3－5”。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～10 0%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数 Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。

分子量大，Ve值小，Kav值也小。

反之，分子量小Ve值大，Kav值大。

65页的“图 3－6”画出了凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（Vg）、外水体积（V0）、内水体积（Vi）及柱床总体积（Vt）的示意图。

凝胶色谱层析
凝胶色谱层析（Gel Chromatography）是一种常用的分离和分析
生物大分子的技术。

它基于不同分子的大小和形状差异，通过凝胶的
分子筛效应来实现分离。

凝胶色谱层析通常包括以下步骤：
1. 凝胶的选择：选择适当的凝胶，如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，根据待分离物质的大小和性质选择合适的凝胶孔径。

2. 柱子的制备：将凝胶填充到柱子中，确保凝胶均匀且无气泡。

3. 上样：将待分离的混合物加载到柱子的顶部。

4. 洗脱：使用适当的洗脱液，通常是缓冲液，将混合物通过柱子
进行洗脱。

大分子物质由于不能进入凝胶的孔径，会首先被洗脱出来，而小分子物质则会被凝胶保留较长时间。

5. 检测：在洗脱过程中，通过检测柱子出口处的洗脱液，可以监
测不同物质的洗脱时间和浓度。

6. 收集和分析：根据洗脱时间和检测结果，收集不同组分的洗脱液，并进行进一步的分析和鉴定。

凝胶色谱层析的优点包括分离效果好、操作简单、可重复性高，适用于分离和分析蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。

它是生物化学、分子生物学和生物技术等领域中常用的分离和分析技术之一。

简述凝胶层析的原理及应用1. 凝胶层析的原理凝胶层析（Gel chromatography）是一种基于分子大小差异进行分离的色谱技术。

其原理基于分子在凝胶基质中的不同扩散速率而进行分离。

凝胶层析主要通过凝胶柱或凝胶片来实现分离过程。

凝胶纤维（如琼脂糖、琼脂糖凝胶等）或凝胶颗粒（如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖琼脂糖凝胶、硅凝胶等）通常用作凝胶基质。

这些基质形成了具有不同孔隙结构的凝胶层。

较大分子无法进入较小孔隙，因此会更快地通过凝胶层，而较小分子能进入较小孔隙，因而逗留在凝胶层中。

凝胶层析可以实现从混合溶液中富集或纯化特定分子，以提高样品的纯度，并对样品进行分离。

2. 凝胶层析的应用2.1 生物化学研究凝胶层析在生物化学研究中具有广泛的应用，包括：•蛋白质纯化：凝胶层析可在不破坏活性的情况下分离和纯化蛋白质。

根据蛋白质的分子量，可以选择合适的凝胶基质和层析缓冲液，使目标蛋白质迅速逗留在凝胶层中，从而实现纯化。

•蛋白质复杂与亚细胞结构的分析：凝胶层析可以用于分析复杂蛋白质混合物，如细胞提取物中的蛋白质组分。

通过层析分离，可以获得单个蛋白质，并对其进行进一步分析和研究。

•糖类和核酸纯化：凝胶层析也可以用于糖类和核酸的纯化和分析。

2.2 药物分析凝胶层析在药物分析中也有应用，包括以下方面：•药物纯化：凝胶层析可以用于从药物混合物中纯化目标活性成分，如从植物提取物中纯化药用成分。

•药代动力学研究：凝胶层析可以用于药物在生物体内的代谢动力学研究，通过监测不同时间点药物与其代谢产物的变化，可以了解药物在生物体中的代谢过程和消除速率。

2.3 环境监测在环境监测中，凝胶层析也起到重要作用，如：•环境污染物检测：凝胶层析可以通过分离和纯化样品中的有机污染物来进行环境污染监测。

•水质检测：凝胶层析可以用于监测水中的有机和无机成分，如重金属、溶解有机物等。

3. 结论凝胶层析是一种基于分子大小差异进行分离的色谱技术，其原理是利用分子在凝胶基质中的不同扩散速率进行分离。

实验名称：蛋白质分子量测定——凝胶层析法实验日期：2023年10月26日实验目的：1. 理解凝胶层析法的原理和操作步骤。

2. 通过凝胶层析法测定蛋白质的分子量。

3. 掌握蛋白质分离和鉴定技术。

实验原理：凝胶层析法，也称为分子筛层析法或排阻层析法，是一种基于分子大小差异进行分离的方法。

凝胶是一种多孔材料，其孔径大小不一，能够根据分子的大小将混合物中的不同组分分离。

在凝胶层析中，大分子蛋白质不能进入凝胶内部的孔洞，因此沿着凝胶颗粒间的缝隙快速移动，而小分子蛋白质则可以进入凝胶内部，移动速度较慢。

通过比较不同蛋白质在凝胶层析中的迁移距离，可以推断其分子量。

实验器材与试剂：- 凝胶层析柱- 凝胶- 蛋白质样品- 标准蛋白质分子量对照品- 缓冲液（pH 7.4）- 标记笔- 移液器- 洗脱液- 紫外线检测仪实验步骤：1. 准备凝胶层析柱，用标记笔标记起始线。

2. 将凝胶加入层析柱中，使其填充均匀，注意避免气泡。

3. 准备蛋白质样品和标准蛋白质对照品，用缓冲液稀释至适当浓度。

4. 用移液器将蛋白质样品和标准蛋白质对照品分别加入层析柱的起始线处。

5. 加入洗脱液，调节流速，保持洗脱液面始终高于凝胶表面。

6. 收集洗脱液，每隔一定时间取样，用紫外线检测仪检测蛋白质的吸收峰。

7. 根据标准蛋白质对照品的分子量和迁移距离，绘制标准曲线。

8. 根据样品的迁移距离和标准曲线，计算样品的分子量。

实验结果：- 蛋白质样品和标准蛋白质对照品在凝胶层析中的迁移距离分别为：样品A 2.5 cm，样品B 3.0 cm；标准蛋白质对照品1 2.0 cm，标准蛋白质对照品2 3.5 cm。

- 根据标准曲线，样品A的分子量为 10 kDa，样品B的分子量为 15 kDa。

讨论与分析：本实验成功地将蛋白质样品与标准蛋白质对照品分离，并测定了样品的分子量。

凝胶层析法是一种简单、有效的蛋白质分离和鉴定技术，广泛应用于生物化学和分子生物学研究中。