(完整版)小鼠表达谱芯片及服务

小鼠TREM-1分子CDR1保守区的克隆、原核表达
及纯化的开题报告
一、研究背景
小鼠TREM-1 （Triggering receptor expressed on myeloid cells-1）是一种跨膜受体分子，在免疫响应和炎症过程中发挥重要作用。

其CDR （Complementarity-determining region）序列是重要的抗体识别位点，是制备抗体及开发药物的重要依据。

因此，对小鼠TREM-1分子的CDR1保守区进行研究具有重要科学意义和应用价值。

二、研究内容
1. CDR1保守区的克隆
本研究采用基因克隆技术，利用PCR扩增小鼠TREM-1分子的CDR1保守区片段，并进行酶切、连接、转化等步骤，将其插入到原核表达载体中，构建重组表达质粒。

2. 原核表达
构建好的表达质粒在大肠杆菌系统中进行表达。

在进行表达之前，先行优化合适的诱导条件，包括诱导剂种类、浓度、诱导时间等因素。

利用SDS-PAGE进行蛋白质表达情况检测。

3. 纯化
对表达并经过诱导后的细菌进行离心，收集细胞上清液。

利用亲和纯化技术，将目标蛋白从杂质中纯化出来，并进行蛋白质浓度的定量。

三、研究意义
本研究成功克隆并表达了小鼠TREM-1分子CDR1保守区，为进一步研究该分子的生理和病理作用奠定了基础。

此外，纯化后的CDR1保守区蛋白可以作为制备抗体、开发药物等研究的重要基础。

Affymetrix⽣物芯⽚简介Affymetrix⽣物芯⽚解决⽅案概述Affymetrix公司作为全球销量第⼀的基因芯⽚⼚家，以其完备的芯⽚设计，稳定可靠的分析结果和强⼤的⽣物信息学分析能⼒，帮助研究⼈员在最短的时间内获得⼤量可靠的结果，为后续研究提供重要的线索和帮助。

Affymetrix公司⽬前已经在纳斯达克上市，在基因芯⽚领域中成为⾏业标准。

Affymetrix公司的巨⼤优势在于为客户提供“完整的基因芯⽚解决⽅案”，即提供全套的基因芯⽚相关产品。

包括：1. 性能优异、种类齐全的各类研究应⽤系列芯⽚产品；2. Affymetrix基因芯⽚相关试剂和试剂盒；3. 基因芯⽚杂交、洗涤、扫描检测仪器系统及相关分析软件⼯具；4. 基因芯⽚相关技术⼿册及使⽤指南等。

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该⽅法的最⼤优点在于⽤很少的步骤可合成⼤量的DNA阵列。

Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度⾼达106~1010/cm2。

⾸先，使固相⽚基羟基化，并⽤光敏保护基团将其保护起来，然后选取适当的避光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。

这样，当光通过避光膜照射到⽀持物上时，受光部位的羟基就会发⽣脱保护⽽活化，从⽽可以反应结合碱基。

由于参与合成的碱基单体⼀端可以进⾏固相合成，另⼀端受光敏基团的保护，所以原位合成后，可进⾏下⼀轮的光照、脱保护和固相合成。

基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现1.表达谱芯片及其应用表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核昔酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片，待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA,并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。

用于硏究基因表达的芯片可以有两种：①cDNA芯片；② 寡核昔酸芯片。

cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核昔酸芯片采用双色荧光系统：U前常用Cy3—dUTP （绿色）标记对照组mRNA, Cy5—dUTP （红色）标记样品组mRNAUl。

用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计•算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值（ratio值），同时计算机还给出直观的显色图。

在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况⑵。

基因芯片因具有高效率，高通量、高精度以及能平行对照研究等特点，被迅速应用于动、植物和人类基因的研究领域，如病原微生物毒力相关基因的。

基因表达谱可直接检测mRNA的种类及丰度，可以同时分析上万个基因的表达变化，来揭示基因之间表达变化的相互关系。

表达谱芯片可用于研究：①同一个体在同一时间里，不同基因的表达差异。

芯片上固定的已知序列的cDNA或寡聚核昔酸最多可以达到30 000多个序列，与人类全基因组基因数相当，所以基因芯片一次反应儿乎就能够分析整个人的基因⑶。

②同一个体在不同时间里，相同基因的表达差异。

③不同个体的相同基因表达上的差异。

对小鼠apoE基因表达谱的分析载脂蛋白E(apo1ipoprotein E,apo E)是乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)的重要组分。

继人类apoE基因于1973年首次发现后,陆续在小鼠、大鼠、猪、狗、牛、猴子等动物体内也发现了它的踪影。

而且在一些动物中,apoE基因的结构有较高的相似性,如人、猪和小鼠的apoE基因均由4个外显子和3个内含子组成。

apoE基因编码的apoE蛋白在稳定微管蛋白结构、细胞内信号传导、免疫调节、糖代谢、氧化应激、脂质代谢及其他细胞过程中发挥重要作用,与人类的衰老,心血管疾病密切相关,apoE基因的多态性及其表达越来越受到研究者的关注,其中小鼠被广泛用作该基因作用机制研究的动物模型。

如apoE 基因敲除小鼠的出现,增加了一个可用于评估研究人类衰老性疾病的动物模型,它有助于深化研究apoE基因的功能,为多种疾病的治疗提供了药物筛选的平台。

尽管小鼠被广泛用作该基因作用机制研究的动物模型,但未见该基因在小鼠各种组织表达的研究报道。

本研究通过对小鼠apoE基因表达谱的分析,为小鼠的apoE基因的研究及其动物模型的利用积累基础性的资料。

1、材料与方法1.1试验动物:健康清洁级昆明种小鼠3只,雌性,40d龄,平均每只体重(28±3)g(广西医科大学实验动物中心提供,批号************)。

处死动物前禁食12h,仅供饮水。

颈椎脱臼处死动物,取心、肝、脾、肺、肾、脑、脊髓、胃、小肠、胸腺、肾上腺、胰腺、膀胱、子宫、主动脉、血液、腹肌等17种组织,每样组织标本约100mg,分别放入含有500μLRNA保存液(北京康为世纪生物科技公司)的1.5mLEP管中备用。

组织样本采集均于处死动物后30min 之内完成,所用解剖工具和EP管均用0.1%DEPC(北京天根生化科技公司)水浸泡过夜后高温高压消毒。

1.2方法1.2.1总RNA抽提:总RNA提取选用上述小鼠的心、肝等17种不同组织,取80~100mg组织样在无RNA酶的研磨器中匀浆后采用Trizol-异丙醇(美国Invitrogen公司)沉淀法提取总RNA,1%的琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性,并于-70℃保存备用,具体操作按照Invitrogen公司提供的RNA提取试剂盒说明书进行。

小鼠缺氧实验报告缺氧是指由于各种原因使人体内氧气供应不足的情况，一定程度上有害于生命健康。

在科学研究中，通过对小鼠进行缺氧实验，可以更好地了解缺氧的生理学效应以及应对方法。

本文将介绍一个小鼠缺氧实验的基本流程和结果分析。

实验方法1. 实验动物本实验使用12只2-3月龄的小鼠，体重在20-25g之间。

小鼠是实验动物中最为常用的种类之一，其生理特征与人体较为接近，这也是选择小鼠作为实验动物的原因之一。

2. 组织样本制备将小鼠放置在缺氧室中，实行8小时长期缺氧训练，然后立即用三氯乙酸酚麻醉动物。

随后，取出小鼠大脑、心脏和肝脏等器官，将其冰冻保存，以备后续组织样本制备。

3. RT-PCR分析通过RT-PCR反应体系，提取所需组织样本中的RNA。

随后运用高保真度反转录酶进行反转录，获得相应的cDNA模板。

根据所需基因及其引物调整试剂体系，进行PCR扩增反应。

扩增结束后，取样本进行凝胶电泳检测，分析其PCR扩增产物的特征和大小，以判断该基因的表达情况。

实验结果1. 缺氧训练引起小鼠组织缺氧损伤缺氧训练后，小鼠被发现缺氧受损明显，心脏等器官出现不同程度的缺氧损伤，包括细胞膜破损，线粒体肿胀、减少和形态改变等。

同时，高浓度染料染色显示，组织细胞核周围空隙的体积显著增大，这也表明缺氧训练引起了细胞凋亡和坏死。

2. 缺氧训练重构小鼠的基因表达谱RT-PCR分析结果显示，在缺氧训练后，小鼠的基因表达谱出现了显著变化。

在实验中选择的神经元特异性烯化酶（NeuN）和中性粒细胞介素-1β（IL-1β）基因的表达水平均有所变化。

其表达水平明显下降，表明大脑和心脏细胞缺氧损伤后，神经元的表达产物发生异常变化，进而影响了细胞内环境进一步发生的改变。

3. 缺氧训练影响小鼠免疫系统实验后，采用血清免疫学试验探究缺氧训练对小鼠免疫系统的影响，结果表明，缺氧训练对小鼠免疫系统造成了一定程度的负面影响，如分泌免疫球蛋白（IgG）的水平显著下降。

康成生物ChIP-on-chip 技术服务ChIP-on-chip（染色体免疫共沉淀和芯片结合的技术）的出现超越了以往传统的芯片分析方法。

传统的芯片检测方法只能对基因调控做管中窥豹式的研究，然而事实上转录是一个非常复杂的过程，它涉及到多种形式的相互作用以及大量组分间的精妙的互相结合。

ChIP-on-chip是染色体免疫共沉淀与芯片技术的结合，用于分析在活体细胞中调节蛋白与基因组DNA之间的相互作用。

调节蛋白与基因组DNA结合控制着染色体的复制和基因的激活（或抑制），是细胞调控网络的开关。

由于对于整个细胞调控网络我们还有很多是未知的，对这部分的理解和认识将有助于研究人员确认调控这些通路的新的靶基因及新的治疗方法。

ChIP-on-chip研究获得的新信息再结合之前获得的基因表达谱数据，能够大大促进疾病和新药开发领域的研究。

ChIP-on-chip这个新的研究转录调控——包括研究转录的激活和抑制的检测平台主要是通过精确确认调节蛋白与基因组DNA序列的结合位置来实现的。

ChIP-on-chip技术能为一些重要机制的研究提供线索，包括DNA复制、修饰、修复，更重要的还有甲基化以及组蛋白修饰等等；还能帮助我们更好的理解一些疾病的发生机理比如糖尿病、白血病、乳腺癌等。

除此之外，ChIP-on-chip技术也已在一些至关重要的生命过程中为我们提供了重要的线索，包括细胞增殖、细胞分化、癌症发生、细胞周期、细胞凋亡以及神经生成等过程。

●研究基因启动子部位组蛋白的甲基化乙酰化或磷酸化水平改变●研究所以基因启动子部位DNA甲基化水平改变●研究转录因子与其结合的所有基因启动子DNA结合水平改变Agilent ChIP-on-chip 芯片Agilent的ChIP-on-chip （染色体免疫共沉淀和芯片结合的技术）是推动新一代芯片平台的强大技术。

Richard Young 等国际知名学者，利用Agilent的ChIP-on-chip 芯片在Nature、Science、Cell上已发表大量文献。

小鼠数据库总结小鼠数据库总结随着基因组测序技术的发展和逐渐成熟，研究人员能够深入了解物种的遗传信息以及其与相关疾病之间的关联。

小鼠是生物医学研究中最常用的模式动物之一，其基因组序列与人类相似度较高，具有许多与人类相关的遗传特征。

小鼠数据库是为了便于研究者查询、分享和分析小鼠基因组数据而建立的一个集成化平台。

本文将对目前常用的小鼠数据库进行综述，以便于读者更好地了解和应用这些资源。

1. 小鼠基因组数据库小鼠基因组数据库是整个小鼠数据库的核心，其中包含了小鼠的基因组序列、基因注释信息以及其他相关的遗传数据。

NCBI (National Center for Biotechnology Information)的小鼠基因组数据库（Mouse Genome Database，MGD）是最权威的小鼠基因组数据库之一，提供了丰富的基因组信息、遗传标记、表达谱和突变模型等数据。

另外，Ensembl和UCSC Genome Browser也提供了小鼠基因组数据的浏览和查询功能，研究者可以根据自己的需要选择合适的数据库进行数据检索。

2. 小鼠突变模型数据库小鼠突变模型是研究小鼠基因功能和相关疾病的重要工具。

小鼠突变模型数据库收集和整理了数千种小鼠基因突变模型的信息，为研究者提供了一个方便的平台用于查询和分析这些模型。

例如，International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC)的数据库中包含了大量基因敲除或突变的小鼠模型，研究者可以通过该数据库了解和比较不同基因突变模型的表型特征和影响等。

3. 小鼠表达谱数据库小鼠表达谱数据库收集了小鼠不同组织和发育阶段的基因表达信息，供研究者查询和分析。

Gene Expression Omnibus (GEO)和Expression Atlas是两个常用的小鼠表达谱数据库，研究者可以根据自己的研究目的查询特定基因在不同组织或条件下的表达情况，并进行差异分析和功能注释等。