质粒载体的发展

cmlr
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。

（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型

pMB1
15-20
pUC系列质粒
pMB1
500-700
pACYC及其衍生质粒
p15A
10-12
pSC101及其衍生质粒
pSC101
∽5
ColE1
ColE1
15-20
1. 质粒复制的方式
质粒的复制主要是通过θ型复 制和滚环复制两种方式之一进 行的，其中以θ型复制为主。 在θ型复制中，有单向复制和 双向复制两种类型。
R100
产生抗生素或细菌素的质粒
产生毒素的质粒
降解质粒
水扬酸盐
萘
乙醛 丙酮酸盐
致病性质粒
Opines:冠樱碱 Octopine（章鱼碱） Nopaline（胭脂碱）
共生固氮质粒 隐蔽质粒
第三节 质粒的检测
一、质粒的消除
1. 理化因子消除法 质粒消除有两种作用机制： a. 对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，从而在 细菌生长繁殖过程中逐步淘汰 b. 选择性抑制带有质粒的菌的生长
革兰氏阴性细菌中多数质粒是 以θ型方式复制，R1、R100等 是单向复制，F、R6k等是双 向复制类型。
在革兰氏阳性细菌 中大多数质粒是以 滚环方式复制。
2. 复制起点(ori)区的功能
复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在 其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、 参与DNA合成起始调控因子的结合位点。
2. 原生质体诱导的质粒消除
第三节 质粒的检测
二、遗传转移 三、分子杂交 四、质粒的分离、检测与纯化
1. 琼脂糖凝胶电泳 2. 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心 3. 电镜观察
第四节 质粒的复制和调节
一、 质粒的大小和拷贝数
1. 质粒大小的测定 与标准质粒电泳比较，酶切分析，电镜照片推算，序列 分析。

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④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌 有两个基本方法：
一是化学法，即用CaCl₂处理并加热激以促进DNA进入 菌体；
二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。
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⑤ 筛选时会有三种结果：
一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成；
二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落；
三是要插入的序列与质粒相连产生白色的抗氨苄青霉素菌 落。
pptቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ件
14
THANKS
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（2）不相容性 同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
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5
（3）可扩增性
• 质粒能自主地进行复制，这样它才能随着细菌细胞的 分裂而稳定地遗传。
• 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨 型复制。
• 松弛型复制：拷贝数高，一个细胞中可达上千个拷贝；
★ 质粒不是细菌生长所必须的 ★ 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★ 分子量在1~200kb之间
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3
质粒（plasmid）
特点：
能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予
宿主细胞一些遗传性状。 ppt课件
4
（二）质粒的基本特性
(1) 自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
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8
质粒的制备
实验室一般使用两种方法制备质粒： （一）碱裂解法 （二）沸水浴法
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（1）碱裂解法
原理：利用溶菌酶在NaOH与SDS的混合溶液中破坏细菌 外壁，去除染色体DNA及变性蛋白质，离心，苯酚—氯仿 溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。

质粒的分⼦⽣物学与质粒载体第三章质粒的分⼦⽣物学与质粒载体⼀、填空题1．基因⼯程中有3种主要类型的载体：——-------、------------⼀、-----------.2.由于不同构型的DNA插⼊EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度—----------—，OC DNA泳动速度—---------—，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染⾊的⽅法可将不同构型的DNA分别开来。

3.质粒的复制像染⾊体的复制⼀样，是从特定的起始点区开始的。

然⽽，质粒的复制可以是—---—向的、或是—----—向的。

在杂种质粒中，每个复制⼦的起点都可以有效地加以使⽤。

但是在正常条件下只有⼀个起点可能居⽀配地位。

并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下—------—的复制起点可能被苯闭。

4.就克隆⼀个基因(DNA⽚段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：—-----—、—---------—、—----------------—。

另外，⼀个理想的质粒载体必须具有低分⼦量。

5.如果两个质粒不能稳定地共存于同⼀个寄主细胞中，则属于—---------—群，这是因为它们的——————————所致。

6.质粒拷贝数是指细胞中—------------------------—。

7.复制⼦由三部分组成：(1)—-----------------—---(2)——-----------————(3)—--------------—。

8.酵母的2µm质粒有------------，可以配对形成哑铃结构。

9.⼀个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养⼀段时间后，⼀部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫----------------。

10.pBR322是⼀种改造型的质粒，它的复制⼦来源于----——，它的四环素抗性基因来⾃于—-----------—，它的氨苄青霉素抗性基因来⾃于—---------—。

质 质粒 粒与 与载 载体体 中央研究院 植物研究所 杜 镇 研究员一、质粒绝大多数的生物都是以 DNA 的形式来储藏其遗传信息。

遗传物质要能生生不息地传给后代 的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication ，或译为复制起点)，使整 个基因体得以复制。

含有复制原的遗传物质称为 replicon ，我们姑且把它译为为复制体吧！。

原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。

其中 质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼 DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。

它们的 基因体约由 2,000 至 150,000 个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如 Borrelia burgdorfferi)。

事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。

在自然环境中它们相 当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌 (Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌 (Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。

以下我们谈的以细菌性质粒为主，尤其是革兰氏阴 性菌的质粒。

二、质粒的类型当我们谈到质粒的类型时，就要看你从哪个角度来看它们，譬如说抗药性、结合生殖能力、 宿主范围及 DNA 复制方式等等。

这些分型标准之间并无横向关联。

你无法说能结合生殖的 质粒一定抗药或不抗药，也无法确定宿主范围和质粒套数的调控有何关联。

我们用到这些名 词时，只是对特定质粒的性状做一些描述而已。

质粒的真正系统分类标准并非靠些性状，而 是依据它们的不共容性(incompatibility)。

有的质粒带有显著特征可供我们侦测它们的存在，无已知特征的质粒称为隐性质粒(cryptic plasmids)；有特征者称为显性质粒(acryptic plasmids)；带有抗药基因的天然质粒称为 R­质 粒(R­plasmids)。

2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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叶亚新
发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）

特性
稳定性
质粒载体可以在宿主细胞内稳 定存在，不易丢失或发生突变
。
可复制性
质粒载体可以在宿主细胞内自 主复制，扩增DNA分子。
可选择性
质粒载体通常携带抗性基因， 可以通过抗生素筛选和富集。
可修饰性
质粒载体可以通过限制性酶切 和连接等分子生物学技术进行
修饰和改造。
质粒载体的应用领域
克隆技术
质粒载体是基因克隆和DN择
天然质粒载体
01
存在于生物体内的天然质粒，具有自我复制能力，可在宿主 细胞内稳定存在。
02
天然质粒通常具有抗生素抗性基因，可作为筛选标记基因。
03
天然质粒载体的复制能力有限，拷贝数较低，且容易丢失。
人工构建的质粒载体
通过基因工程技术人工构建的质粒载体，具有特 定的复制起始位点和筛选标记基因。
转化与筛选
转化
将连接产物导入受体细胞中，常用的受体细胞有细菌、酵母、动物细胞等。
筛选
通过抗性筛选、PCR鉴定等方法对转化子进行筛选，获得阳性克隆。
04
质粒载体的改造与
优化
启动子的优化
选择合适的启动子
启动子突变
根据基因的表达需求，选择合适的启 动子，如强启动子、弱启动子等。
通过突变启动子序列，改变其转录活 性，以实现基因表达的调控。
功能元件
选择含有合适功能元件的质粒载体，如启动 子、多克隆位点等，以满足实验需求。
稳定性
选择稳定性好、不易丢失的质粒载体，以确 保目的基因在宿主细胞内的稳定表达。
03
质粒载体的构建过
程
目的基因的获取与鉴的基因。
目的基因的鉴定
通过测序、限制性酶切、PCR扩 增等手段对目的基因进行鉴定， 确保其准确性。

E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。

质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）2010-01-25 13:25:29 来源：易生物实验浏览次数：6084 网友评论 0 条一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类关键词：质粒载体质粒载体标记基因一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。

在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。

在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。

图3-1 是其复制其始示意图。

在复制时，首先合成前 RNAⅡ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前 RNAⅡ，使之成为成熟的 RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。

形成的 RNAⅠ可控制 RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强 RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。

削弱 RNAⅠ和 RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。

图 3-1 带 pMB1（或 ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。

2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。

严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

表 5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。

表 3-1 ：质粒载体及其拷贝数质粒 复制子 拷贝数pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20pUC 系列质粒及其衍生质突变的 pMB1 500～700粒pACYC 及其衍生质粒 p15A 10～212pSC101 及其衍生质粒 pSC101 ～5ColE1 ColE1 15～20pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。

pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ，DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和danZ 的产物。

质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。

在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ 复制。

在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1 质粒或ColE1 质粒的复制起始位点。

图3-1 是其复制其始示意图。

在复制时，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并与DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。

形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。

削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。

图3-1 带pMB1（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。

2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。

严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

表5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。

表3-1：质粒载体及其拷贝数pUC 系列质粒的复制单位来自质粒pMB1 ，但其拷贝数较高。

pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提续复制，最后每个细胞中可积聚2～3 千个质粒。

3．质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。

不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。

两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。

而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。

基因⼯程的载体种类基因⼯程的载体对于外源基因的复制、扩增、传代乃⾄表达⾄关重要，其必需具备以下条件：①具有有效运载能⼒，能够进⼊宿主细胞；②对多种限制酶有单⼀或较少的切点，最好是单⼀切点，即本⾝是⼀个复制⼦，携带外源基因前后均能在宿主细胞内⾃主复制，或者能够整合到宿主细胞中；③在宿主中能控制外源基因的表达活动；④要有筛选标记，鉴定⽅便，装卸⼿续简单；⑤容易控制，安全可靠。

在基因⼯程（DNA重组）中，使⽤的载体有：①克隆载体（clone vector），即以繁殖DNA分⼦为⽬的的载体；②穿梭载体（shuttle vecto），⽤于真核⽣物DNA⽚段在原核⽣物中增殖，然后在转⼊真核⽣物细胞宿主表达；③表达载体（express vector），⽤于⽬的基因的表达。

现在对载体提出了更⾼的要求，如：⾼拷贝数、具有强启动⼦和稳定的mRNA、具有⾼的分离稳定性和结构稳定性、转化频率⾼、宿主范围⼴、插⼊外源基因容量⼤且可以重新完整地复制与转录、和宿主细胞匹配等。

此外，载体在宿主不⽣长或低⽣长速率时仍能⾼⽔平地表达⽬的基因。

但达到上述要求的载体很少，尤其是当动物细胞作为宿主细胞时，⽬前能⽤的主要时病毒，进⼊宿主的⽬的基因⼀般只能是⼀个基因，⽽以基因组或多个基因同时进⾏重组还有⼀定困难。

⼀、质粒克隆载体除酵母杀伤质粒（killer plasmid）为RNA外，其他质粒多位环状DNA分⼦，每个质粒都有⼀段DNA复制起始点的序列，帮助实现质粒的复制。

质粒⼀般决定抗⽣素的抗性、产⽣抗⽣素酶系、糖酵解酶系、降解芳⾹族化合物酶系、肠毒素及限制-修饰酶系等。

其中严紧型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体同步，并与宿主蛋⽩质合成有关，与DNA聚合酶I活性⽆关，蛋⽩质合成停⽌，质粒与宿主染⾊体复制亦停⽌，故只有1个或少数⼏个拷贝；⽽松弛型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体复制不同步，与蛋⽩质合成⽆关，与DNA聚合酶I活性有关，蛋⽩质合成停⽌，质粒仍可复制，故可以在宿主有10—206个拷贝。

表达载体与克隆载体的区别


Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体



pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能

4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型

1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体


3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体

克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr

质粒载体的发展趋势
质粒载体的发展趋势可以归纳为以下几个方面：
1. 多样化：随着基因工程和合成生物学的发展，越来越多的研究需要使用不同类型的质粒载体。

因此，质粒载体的种类和功能也变得更加多样化，可以根据实验需要选择不同类型的质粒载体，如表达质粒、宿主矢量、介导基因编辑的工具等。

2. 容量增加：随着科技的进步，质粒载体的容量也越来越大，可以容纳更多的基因序列。

这使得更复杂的基因工程研究和应用成为可能，如构建更复杂的代谢途径或合成生物学系统。

3. 高效转化和复制：质粒载体的转化效率和复制稳定性是影响基因工程研究成功的重要因素。

因此，现代质粒载体设计趋向于提高转化效率和复制稳定性，以使实验更加可靠和高效。

4. 降低毒性和免疫原性：一些传统质粒载体存在毒性和免疫原性的问题，限制了其在基因治疗和基因疫苗等领域的应用。

因此，质粒载体的发展趋势是降低毒性和免疫原性，提高安全性和稳定性。

5. 精准基因编辑：随着CRISPR-Cas9等基因编辑技术的兴起，质粒载体也相应发展为能够实现精准基因编辑的工具。

质粒载体用于基因编辑需要具备高效的模
板构建和传递能力，以实现精准的基因修饰。

总之，质粒载体的发展趋势是多样化、容量增加、高效转化和复制、降低毒性和免疫原性，以及适应精准基因编辑等新技术的要求。

这些趋势的发展将推动基因工程和生物技术的进一步发展和应用。

2抗生素抗性基因可以便于加以检测如ampkan3多克隆位点mcs克隆携带外源基因片段3多克隆位点mcs克隆携带外源基因片段4启动子增强子5terms终止信号6加polya信号可以起到稳定mrna作用质粒的特点是染色质外的双链共价闭合环形dna可自然形成超螺旋结构不同质粒大小在2300kb之间不等15kb的小质粒比较容易分离纯化15kb的大质粒则不易提取
三、质粒载体的构建及特点
1．天然质粒用作克隆载体的局限性
天然质粒，一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造 的质粒。在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1 、pSC101等。 鉴于天然质粒用作基因克隆载体存在着不同程度的局限性，科学工作 者便在其基础上进行了修饰改造，发展出了一批低分子量、高拷贝、 多选择记号的质粒载体。 现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。
③质粒对宿主生存并不是必需的 质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿 主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞在特定条件下生 存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分 解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药 性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存 繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。
4、质粒载体不稳定性
分离的不稳定性
DNA的缺失、插入和重排都是造成质粒载体结构不稳定性 的原因。
结构的不稳定性
在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，也是导致质 粒不稳定性的重要原因。
影响质粒载体稳定性的主要因素
(1)新陈代谢载体稳定性的影响 (3)寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应

都能便利的加以检测
如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因。将受体细胞放在含有 该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的 受体细胞才能存活。